UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ANALISIS CLINICOS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
SEMINARIO N°2
“PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS PARA MANEJO Y ESTUDIO DE LA
INFECCIÓN FÚNGICA INVASORA”

ANALISIS CLINICOS

DOCENTE : Abanto Zamora, Francisco

ALUMNOS : ALVARADO LUIS, Leonel

BOY FERNANDES, Alexander

CICLO : VII

TRUJILLO – PERÚ
2017

SEMINARIO -II 1
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INTRODUCCIÓN
Las infecciones fúngicas invasoras (IFI) se han convertido en un problema para los
hospitales por el aumento del espectro de enfermos susceptibles, el aumento en el
número de pacientes en riesgo y su elevada mortalidad. El diagnóstico microbiológico
de las IFI, fundamentalmente de las causadas por Candida spp., se basa en el cultivo
microbiológico. Para paliar las limitaciones del cultivo se han desarrollado técnicas
alternativas como la detección de biomarcadores circulantes o ADN fúngico. Los 2
procedimientos estandarizados para determinar la sensibilidad a los antifúngicos de los
aislados clínicos productores de IFI, desarrollados por el European Committee of
Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) y el Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) aportan puntos de corte para Candida spp. Los niveles séricos de
itraconazol, voriconazol y posaconazol son difícilmente predecibles. Los pacientes con
niveles subterapéuticos tienen menor probabilidad de responder al tratamiento, mientras
que aquellos con niveles elevados pueden desarrollar toxicidad atribuible al fármaco.1

1. CONSIDERACIONES CLÍNICAS2
Las infecciones fúngicas pueden causar un gran número de entidades clínicas, con
manifestaciones variadas que dependen del lugar de infección y del tipo de paciente. En
general, podrían clasificarse según un criterio de profundidad, en superficiales, cutáneo-
mucosas, subcutáneas y profundas (endémicas y oportunistas). Son las micosis
profundas oportunistas las que han adquirido un protagonismo especial en los últimos
tiempos debido, entre otros motivos, al aumento de incidencia, gravedad y trascendencia
del diagnóstico precoz, a lo que habría que añadir la dificultad para diferenciar la
colonización de la infección invasora.

El aumento significativo de las infecciones fúngicas sistémicas oportunistas es debido,

entre otras causas, a las medidas de soporte vital, al aumento del uso de antibióticos de
amplio espectro, a la implantación de material protésico, a la terapia con corticoides y,
en general, cualquier tipo de inmunosupresión (terapéutica o adquirida). Sin el
tratamiento adecuado, la mortalidad de las infecciones fúngicas sistémicas es muy alta,
lo que unido a los costes de hospitalización que este tipo de infecciones genera, las
convierten en entidades de gran trascendencia en la práctica diaria en el medio
hospitalario.

1.1. MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTANEAS

Estas micosis incluyen infecciones muy frecuentes que afectan al estrato córneo
de la piel, a la epidermis y a los anejos cutáneos: pelo y uñas. Son infecciones que
constituyen una parte importante de las consultas dermatológicas y cuyo
diagnóstico de elección sigue siendo el examen directo y el cultivo de las
muestras de piel y anejos cutáneos.

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1.2. MICOSIS SUBCUTÁNEAS

Están causadas por hongos ambientales inoculados directamente en el tejido
celular subcutáneo mediante un traumatismo. Presentan una agresividad local
variable. Característicamente no se diseminan a distancia.

1.3. CRIPTOCOCOSIS
La criptococosis es una enfermedad infecciosa generalmente sistémica que afecta
a animales y al hombre, sobre todo en situaciones de inmunosupresión. La
criptococosis se adquiere por vía inhalatoria. El hongo responsable es una
levadura capsulada, que posee gran afinidad por el sistema nervioso central,
siendo la meningoencefalitis la presentación clínica más habitual.

1.4. ASPERGILOSIS
Las aspergilosis son un amplio y heterogéneo grupo de enfermedades oportunistas
causadas por hongos filamentosos del género Aspergillus. Tiene un ciclo
biológico muy simple, con alta capacidad de esporulación y por ello alcanza altas
concentraciones de conidias en el aire. La inhalación continua de conidias por el
hombre no supone en condiciones normales ningún problema, ya que son
eliminadas muy eficazmente por los diferentes mecanismos de defensa

1.5. CANDIDOSIS
Las levaduras del género Candida poseen una amplia distribución y pueden
originar infecciones de distinta localización y gravedad, generalmente asociado a
factores predisponentes por parte del huésped, por lo que se las considera
patógenos oportunistas. La infección endógena tiene gran importancia y suele
suceder a la colonización de diferentes localizaciones del paciente predispuesto.2

2. RECOGIDA DE LA MUESTRA3
Para alcanzar el éxito en el diagnóstico micológico partiendo de una sospecha clínica, es
fundamental realizar adecuadamente la recogida de la muestra a partir de la lesión, su
correcta manipulación para mantener la viabilidad del agente etiológico y evitar
posibles contaminaciones en su transporte y procesamiento, la siembra de la misma en
los medios idóneos y a la temperatura adecuada, así como la identificación e
interpretación correcta de los aislamientos. Únicamente con el procesamiento adecuado
se puede recuperar el hongo claramente asociado con el proceso infeccioso. A la hora de
valorar un crecimiento fúngico hay que tener siempre presente la necesidad de
diferenciar un “aislamiento significativo” de otros que no lo son, ya que no es lo mismo
identificar una especie fúngica que diagnosticar una micosis.

Las muestras de sangre se deben tomar desde una vía periférica; el aislamiento de
Candida spp. Exclusivamente en una muestra de sangre extraída por la luz del catéter no
indica la presencia de candidemia. La sensibilidad diagnóstica de los hemocultivos es

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dependiente del volumen de sangre inoculada en la botella. En pacientes adultos se

deben inocular no menos de 8-10 ml de sangre por botella. En el caso de pacientes
pediátricos, se deben inocular no menos de 1,5 ml de sangre en botellas especiales.

2.1. TRANSPORTE 3
Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rápidamente, sin conservantes.
Las muestras deben transportarse en un recipiente estéril, humidificado y a prueba
de vertidos; sin embargo, las muestras dermatológicas pueden transportarse en un
recipiente seco (placa de Petri, papel de fotografía negro, entre dos portas). En
general, no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fácil
retirar la muestra del medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de
dermatofitos u hongos dimórficos se conservarán a temperatura ambiente, nunca
refrigerados. Los raspados corneales y hemocultivos deben sembrase directamente
en el medio de cultivo adecuado. Si esto no fuera posible, se usarán medios de
transporte adecuados o se conservaran a 4 ºC.

2.2. MANEJO 3
Todas las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos
potencialmente peligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y
antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que
ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Se rechazará en los siguientes
casos: a) muestra no identificada, b) transporte inadecuado o demasiado
prolongado, c) muestra derramada, d) cantidad insuficiente o inadecuada.

2.3. PROCESAMIENTO 4
El cultivo microbiológico de las muestras se realizará en medios habituales para la
recuperación de hongos oportunistas (agar Sabouraud, CHROMagar Candida).

Las determinaciones basadas en PCR no están todavía recogidas como criterios

diagnósticos de IFI, por lo que son siempre determinaciones adicionales al cultivo
microbiológico. En caso de que la muestra sea escasa y se comprometa el
resultado del cultivo, se debe dar preferencia al mismo. En el procesamiento de la
muestra para las determinaciones de anticuerpos o antígenos fúngicos se
recomienda seguir fielmente las instrucciones del fabricante. Las muestras para
detección de ADN fúngico deben de ser centrifugadas (con la excepción del
suero) y el precipitado se someterá a extracción de ADN y posterior purificación
del mismo.

La caracterización de los aislados fúngicos se realizará sobre una cepa en cultivo

puro que se procesará de acuerdo con los procedimientos correspondientes para
los estudios moleculares o identificación por medio de espectrometría de masas.

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3. SELECCIÓN DE MEDIOS Y CONDICIONES DE INCUBACIÓN

El objetivo fundamental de la utilización de los medios de cultivo es optimizar el

crecimiento de los microorganismos. En los medios de cultivo micológicos, los
antimicrobianos se utilizan tanto para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otros
hongos ambientales.

3.1. CLASIFICACIÓN
Atendiendo a su composición, los medios de cultivo pueden ser generales,
enriquecidos, selectivos, diferenciales y especializados:

 GENERALES: El más característico y clásico es el agar glucosado de Sabouraud

(AGS). Se utiliza como medio de cultivo general y fundamentalmente para la
realizar la descripción de las características morfológicas de la mayoría de los
hongos.
 ENRIQUECIDOS: Se utilizan especialmente en micosis sistémicas endémicas
(histoplasmosis, blastomicosis), para la recuperación de la fase levaduriforme. Un
ejemplo de estos medios es el agar cerebro-corazón con sangre (BHI).
 SELECTIVOS: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismos
deseados impidiendo el de otros. Los componentes más utilizados como agentes
selectivos son antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina,
estreptomicina) y también inhibidores de hongos como la cicloheximida que es
especialmente útil en las muestras cutáneas y respiratorias para el diagnóstico de
micosis sistémicas endémicas.
 DIFERENCIALES: Se utilizan para ayudar a la identificación del hongo basada en
la apariencia de éste en dicho medio, merced a la adición de determinados
componentes como por ejemplo sustancias cromógenas, o indicadores de pH como
en el DTM.
 ESPECIALIZADOS: Son aquellos medios que contienen algún componente (por
ejemplo, ácido cafeico) destinado a aislar un agente concreto (C. neoformans),
favorecer la identificación de ciertas especies (por ejemplo, el medio de Czapeck), u
obtener estructuras de reproducción sexual (por ejemplo, agar acetato, agar
patatazanahoria).

3.2. PREPARACIÓN
La buena calidad de los medios es indispensable para conseguir el aislamiento y la
identificación de los hongos; por lo tanto, cuando se utilicen medios comerciales
es necesario tener en cuenta la garantía que aporta el proveedor y la calidad de la
distribución. Cuando se prepara un medio deshidratado deben seguirse
rigurosamente las instrucciones del fabricante, evitando errores en la forma de
disolverlos o suspenderlos, en la temperatura y duración de la esterilización para
que no se afecte la calidad del producto final.

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3.3. CONTROL DE CALIDAD

Para asegurar la correcta utilización de los medios, deben controlarse
periódicamente sus características más importantes: apariencia, esterilidad, pH y
funcionamiento. El funcionamiento se puede evaluar utilizando las cepas de
control adecuadas para cada medio

3.4. ALMACENAMIENTO
Los medios se deben guardar refrigerados a 2-8ºC. Para mejorar su conservación y
prevenir la desecación, es aconsejable invertir las placas e introducirlas en bolsas
de plástico. Las placas de Petri suelen conservarse en buen estado unos tres
meses, mientras que los medios semisólidos o líquidos en tubo de tapón de rosca
se conservan bien hasta 6 meses. Sin embargo, ciertos medios, al contener
sustancias inestables (antibióticos, vitaminas, sangre, etc.), no se conservan en
buen estado tanto tiempo. También hay que tener presente que algunos
componentes de ciertos medios pueden verse afectados por la luz, por lo que estos
medios deben almacenarse en contenedores opacos.

3.5. INCUBACIÓN
La temperatura óptima de crecimiento de la mayoría de los hongos patógenos es
30 ºC. Sin embargo, Sporothrix schenckii es una excepción, crece más rápido a
27–28 ºC.

4. MEDIOS DE CULTIVO5
Los cultivos son los mas usados a la hora de identificar y estudiar, estos pueden ser de
tres tipos naturales, semisinteticos y sintéticos. Los naturales están elaborados con
leche , huevo, granos de cereales, levadura de cerveza y otros compuestos. Los
semisinteticos como el Sabouraud, aportan una fuente de carbono y nitrógeno. Los
sintéticos, tienen una composición química bien definida y se usan en investigación.
4.1.CLÁSICOS
Los medios de cultivo clásicos se preparan fácilmente; los ingredientes se disuelven por
separado en agua y se mezclan en un matraz Erlenmeyer; se calientan 15 minutos en
baño María y 5 a 6 minutos en mechero, la solución se coloca en tubos y se procesa en
autoclave a 110 °C durante 15 a 20 minutos; al sacarlos se colocan en posición inclinada
para aumentar la superficie de cultivo. Dentro de estos se encuentran:
Medio glucosado de Sabouraud
Es el medio clásico de aislamiento; en ocasiones, no es idóneo pero se usa de manera
universal para la identificación sistematica de hongos.
Medio de Sabouraud con antibióticos
Se añaden, disueltos en 10 mL de acetona, cloranfenicol, 0,05g, o cicloheximida, 0,5 g
o ambos ( se disponen en el comercio de medios ya preparados, como Mycogel-agar,

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Micobiotic-agar, Dermasec-agar), que evitan el crecimiento de bacterias y hongos

saprófitos.
Para cualquier aislamiento, se recomienda el medio simple deSabouraud y el adicionado
con antibióticos, pero debe evitarse el cloranfenicol si se sospecha de actinomicetos, o
la cicloheximida si se sospecha de enfermedad por agentes opoirtunistas.
4.2.OTROS MEDIOS DE CULTIVO
Medio líquido de Sabouraud
Es igual al medio simple de Sabouraud, pero sin agar; puede utilizarse para rehidratar
cultivos deseados
Medio de conservación
No tiene azucares; se utiliza para evitar el fenómeno de pleomorfismo. Es recomendable
sobre todo para dermatofitos.
Medio de transporte para hongos (medio de Stuart)
Este medio contiene tioglicolato de sodio, glicerofosfato de sodio, CaCl2, Azul de
metileno, agua destilada y se ajusta a pH 7,3.
Medio papa – zanahoria
Estimula la producción de clamidosporas en Candica albicans y de peritecios en N.
rosatii y A. boydii. Se pelan las papas y las zanahorias; se sumergen en agua durante
una hora; se machacan en un mortero; la mezcla se calienta cinco minutos y se filtra a
través de una gasa; se añade el agar y se afora a 1000 mL; se esteriliza durante 10
minutos a 120°C.
Medio papa – zanahoria – bilis de buey
Al medio anterior se agrega 15% de bilis de buey. Estimula clamidosporas en C.
albicans.
Medio de Cereal
Estimula clamidosporas en C. albicans.
Medio agar – harina de maíz
Estimula clamidosporas en C. albicans.
Agar para clamidosporas
Estimula clamidosporas en C. albicans.
Medio de arroz
Favorece fructificación y evita pleomorfismo en dermatofitos.
Medio de plátano (B-M-80, Ditrani)
Se utiliza para dermatofitos, Candida y otros hongos.

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Medo de Czapek
Sirve para estudiar Aspergillus y penicillium
Medio de Sabouraud con aceite de oliva
Se utiliza para cultivar Malassezia (Pityrosporum) al medio de Sabouraud con
antibióticos se agrega aceite de oliva al 10%. El aceite se esteriliza por separado y se
agrega el medio cuando esté a 50°C y se vierte en los tubos o las cajas Petri.
Medio bilis de buey (Dixon modificado)
Se usa para Malassezia ( Pityrosporum), este medio contiene; agar extracto de malta
,Tween 40, bilis de buey, glicerina. Se pueden añadir antibióticos.
Medio con ácido oleico y vitamina A
Se utiliza para una especie de Malassezia. Este medio contiene Sabouraud simple,
tween 80, ácido oleico, vitamina A, cloranfenicol y agua destilada.
Medio de infusión cerebro-corazón
Sirve para cultivar actinomicetos y obtener la fase levaduriforme de hongos dimorfos.
Este medio contiene infusión de cerebro de becerro, infusión de corazón de buey,
peptona, glucosa, Nacl, HNa2PO4, agua destilada y se ajusta todo a pH 7.
Medio Lactrimel ( o Lactrimel de Borelli)
Tiene pocos nutrimentos; estimula la producción de pigmentos y fructificación de
muchos hongos, principalmente dermatofitos, así como de clamidosporas en Candida
albicans.
Medio de agar- dextrosa-urea
Se utiliza para observar la producción de ureasa, por ejemplo en T.mentagrophytes y
C.neoformans. Este medio contiene dextrosa, peptona, fosfato monopotásico, urea, rojo
fenol y agua destilada.
Medio de Staib
Sirve para identificar C. neoformans, ya que adquiere color café oscuro en esté medio.
Este medio contiene Guizotia abyssinica, glucosa, creatinina, KH2PO4 y agar.
Medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol
Se utiliza para diferenciar Cryptococcus neoformans. La lectura se realiza a las 72
horas; C. neoformans variedad neoformans no desarrolla colonia ni cambia de color
(amarillo); C. neoformans variedad gattii crece y cambia de color el medio a azul
cobalto.
5. EXAMEN MICROSCÓPICO6
La observación microscópica de las muestras puede, en ocasiones, detectar la presencia
de elementos fúngicos suficientemente caracteristicos como para diagnosticar la
etiología de una infección fúngica. Uno de los principales inconvenientes es su baja

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sensibilidad; por lo que un examen microscópico negativo no excluye nunca la

infección y no es recomendable su práctica cuando el material clínico del que se dispone
es escaso.
El examen directo en micología se basa en el empleo de colorantes o fluorocromos que
se unen inespecíficamente a la pared fúngica, como la tinción de Gram, la tinción con
blanco de cacoflúor, la tinción de la tinta china o las tinciones argénticas o del ácido
periódico de Schiff, especialmente empleadas en histopatología. Las levaduras son
fáciles de observar, pudiéndose apreciar las gemaciones y las pseudohifas, cuando estas
están presentes. Los hongos filamentosos se tiñen con mas dificultad por los colorantes
de la tinción de Gram, aunque si el numero de hifas es elevado pueden reconocerse
fácilmente, incluso a pequeños aumentos. Las características de las hifas, el grado de
angulación de las ramificaciones y la presencia o ausencia de tabiques permiten
distinguir entre hongos hialinos, feoides y zigomicetos.

6. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES FÚNGICAS INVASORAS

BASADO EN DETECCIÓN DE BIOMARCADORES

La baja sensibilidad del cultivo micológico ha promovido el desarrollo de métodos

alternativos basados en la detección de antígenos fúngicos (antígeno criptocócico,
galactomanano de Aspergillus y manano de Candida spp.), componentes estructurales
(1,3--D-glucano), anticuerpos producidos por el propio paciente (anticuerpos
antimanano y anticuerpos antimicelio) o detección de ADN del hongo en muestras
clínicas.5, 6

La determinación se hace generalmente en suero o plasma, y es recomendable hacerla 2

veces por semana para aumentar la especificidad. La detección de galactomanano en
LBA de pacientes oncohematológicos, pacientes críticos y receptores de trasplante de
órgano sólido también es útil para el diagnóstico de la aspergilosis invasora. La
detección mediante ELISA de antígeno manano y de anticuerpos frente a este antígeno
de Candida spp. Está disponible comercialmente. Se recomienda la realización conjunta
de antígeno y anticuerpo en todo paciente con sospecha de candidiasis invasora y que
presenta un elevado valor predictivo negativo (95)7.

Debido a la alta prevalencia de anticuerpos antimanano en la población sana o

colonizada, se han investigado otros anticuerpos más específicos, como los anticuerpos
antimicelio frente a antígenos del micelio de C. albicans, que presentan una sensibilidad
del 84,4% y una especificidad del 94,7%5. El 1,3-- D-glucano es un componente de la
pared celular fúngica que se libera con el desarrollo de la infección; es un biomarcador
panfúngico detectable en el suero de los pacientes con IFI, con la excepción de la
mucormicosis y la criptococosis.8, 9

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7. DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES FÚNGICAS INVASORAS

BASADO EN DETECCIÓN DE ADN FÚNGICO

La justificación de la detección de ADN fúngico en una muestra clínica es similar a

la de los biomarcadores discutidos en la sección anterior, con la ventaja de que los
métodos moleculares ofrecen, además de un resultado positivo, la detección de la
especie de hongo involucrada.10

Las técnicas moleculares siguen siendo herramientas muy prometedoras, aunque

desafortunadamente aún no han conseguido instaurarse en el laboratorio de
microbiología por su elevado coste, la necesidad de personal calificado y la falta de
estandarización. El formato de PCR más extendido en el laboratorio es la PCR a
tiempo real, que permite cuantificar el ADN presente en la muestra clínica,
minimiza el riesgo de contaminaciones cruzadas y por tanto de falsos positivos, y
permite el análisis una vez que se ha confirmado la amplificación del ADN. En el
diseño de las PCR se puede optar por una detección universal o bien por la
detección exclusiva de un género concreto o incluso de una única especie. Existen
sistemas de PCR a tiempo real comercializados que permiten la detección de
algunas especies de Cándida y Aspergillus, Aspergillus spp. 10

8. APLICACIÓN DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y LA

ESPECTROMETRÍA DE MASAS A LA CARACTERIZACIÓN DE
AISLADOS FÚNGICOS

La identificación de aislados fúngicos por medio de biología molecular ha permitido

descubrir especies fúngicas no diferenciables a partir de sus características
morfológicas o bioquímicas. Lo que hasta ahora se han denominado especies son en
realidad complejos de especies indistinguibles por los métodos de identificación
convencional. La región ITS1-5,8S-ITS2 cumple estos requisitos y se considera el
«código de barras» de los hongos, y es útil para la identificación precisa de
levaduras. En el caso de Aspergillus spp., se debe amplificar y secuenciar el gen de
la beta-tubulina.11
En algunas ocasiones puede ser necesario llegar a realizar una caracterización
molecular en cepas pertenecientes a la misma especie. Esto resulta esencial cuando
se estudian brotes nosocomiales de IFI. La caracterización molecular permite
evaluar la distancia genética existente entre cepas de la misma especie. Hay
diferentes sistemas para realizar la caracterización molecular de los hongos. Los
microsatélites están cobrando gran interés en los últimos años por su
reproducibilidad, su capacidad discriminatoria y la posibilidad de exportar los
resultados a otros laboratorios.12

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La espectrometría de masas basada en la ionización y desorción suave mediante una

matriz por láser y espectrometría con tiempo de vuelo (soft ionization Matrix-
Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight mass spectrometry, MALDI-
TOF MS) se está aplicando a la micología. 13

Estudios de sensibilidad in vitro a los antifúngicos El principal fundamento de estas

pruebas es detectar los aislados resistentes entre la población sensible o el desarrollo
de resistencia durante el tratamiento. El CLSI y el EUCAST han desarrollado
métodos reproducibles para determinar la sensibilidad a los antifúngicos de las
levaduras, hongos filamentosos y dermatofitos. 14

Determinar la sensibilidad a los antifúngicos: el método de microdilución en caldo

para levaduras (documento M27-A3)13 y para hongos filamentosos y dermatofitos
(documento M38-A2)14, y el método de difusión en agar para levaduras
(documentos M44-A2 y M44-S2)13 y hongos filamentosos no dermatofitos
(documentos M51-A y M51-S1). 14

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