UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química BIOQUÍMICA

AMINOÁCIDOS: CURVA DE TITULACIÓN Y SEPARACIÓN POR

CROMATOGRAFÍA
Integrantes

Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.

Programa

Resumen
En el presente documento se muestra el carácter anfotérico de los aminoácidos puesto que poseen un grupo amino
y uno carboxilo que debe reaccionar con ácidos y bases. Con el fin de observar las curvas de titulación caracterís-
ticas de los Aminoácidos partir de los cuales se pueden obtener los valores de pK de cada uno de los grupos ioni-
zables. Se realizó el montaje para llevar a cabo la titulación de Glicina (0,1M), se adicionó 1mL de HCl (0,2M),
se registró el pH en cada adición, se tituló hasta que alcanzara un pH de 1,5. Luego se tituló con NaOH (0,2M),
1mL en cada adición, hasta completar pH 12,5. La curva de titulación de la Glicina permitió identificar las dos re-
giones de capacidad tamponante. Se preparó la cromatografía adicionando la mezcla de solventes en una cámara
cromatografica, se trazó una línea recta a lo ancho de la placa, se sembraron los aminoácidos, se secaron, se marcó
la línea que alcanzo el líquido después del ascenso, se secó a temperatura ambiente, se atomizó con Nihidrina y se
calentó al horno. De esta manera se reconoció el aminoácido problema a partir de los Rf correspondientes.

Palabras clave: Carácter anfotérico, Ácido, Base, Curva de titulación, pK, Grupo ionizable, Capacidad tamponante, Rf.

1. Introducción jo tuvo como objetivo calcular en los mismos el valor de

Todos los organismos emplean los mismos 20 aminoácidos
estándar como bloques constructivos para armar las molécu-
las de proteína (Horton, Moran, Scrimgeour, Perry, &
Rawn, 2008), todos con una misma característica, son α-
aminoácidos, tienen un grupo carboxilo y un grupo amino
unidos al mismo átomo de carbono (carbono α).
Los aminoácidos son la base de todo proceso vital, al con-
formar las proteínas, intervienen en prácticamente todos los
procesos que tienen lugar en la célula y ejercen gran diver-
sidad de funciones, pues son necesarios para realizar todos
los procesos metabólicos; sus principales funciones son el
transporte de nutrientes y la optimización el almacenamien-
to de éstos mismos (Nelson & Cox, 2009).
Un estudio realizado por M. M. Suárez López, relaciona el
escore de aminoácidos en la calidad de las proteínas en los
alimentos. El escore de una proteína refleja su contenido en
aminoácidos (AA) en comparación con la proteína ideal.
Sin embargo, cuando se necesita conocer la utilización de
los AA en el organismo es necesario realizar la corrección
del valor de escore según la digestibilidad proteica
(PDCAAS). Debido a que tal información no se encuentra
disponible para los alimentos de consumo habitual, el traba-
PDCAAS. (Suárez López, M. M., Kizlansky, A., & López,
L. B, 2006).
Las restricciones que se pueden presentar en la curva de
titulación y en la separación de cromatografía de un ami-
noácido, en esta práctica, son relacionadas con la mala eje-
cución del operador al realizar los procedimientos.
El punto isoeléctrico, es el pH en que la carga neta del ami-
noácido es nula; para la curva de titulación se calculó me-
diante la siguiente ecuación:
𝟏
𝒑𝑰 = 𝟐 (𝒑𝒌𝒂𝟏 + 𝒑𝒌𝒂𝟐 ) (1)
Donde pI es el punto isoeléctrico y Los pKa a considerar
para esta ecuación, en una tabla de pH, son los que contie-
nen a la especie química con carga igual a cero, cuando
tienen más de un pKa.
Los valores de Rf de los Aminoácidos sembrados en la
cromatografía en capa fina, se calcularon mediante la si-
guiente ecuación:
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒑𝒓𝒐𝒃𝒍𝒆𝒎𝒂
𝑹𝒇 = (2)
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒇𝒓𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒅𝒆𝒍 𝒅𝒊𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆
 Aminoácidos: curva de titulación y separación por cromatografía

Durante esta práctica se esperan desarrollar los siguientes sobre la línea base, para ello se tocó suave y perpendicular-
objetivos específicos: mente la placa con la punta del capilar. Se permitió secar la
siembra, luego se sembró el segundo aminoácido sobre la
 Determinar los valores de pK de un aminoácido a línea base de la placa, procurando dejar por lo menos un
partir de la curva de titulación acido-base. espacio aproximado de 1,0 cm entre muestra y muestra y
 Calcular el punto isoeléctrico a partir de los pK de alrededor de no menos 0,5 cm antes de los bordes de la
la curva de titulación de Glicina. placa. Se repitieron los anteriores pasos para la siembra del
 Separar e identificar una mezcla de aminoácidos aminoácido desconocido. Posterior a esto, se desarrolló la
cromatografía, se puso la placa en la cámara y se inclinó
por cromatografía en capa fina.
contra la pared interna del frasco. Se cerró la cámara, no se
perturbó el sistema mientras ascendía el solvente (figura 2).
Se retiró la tapa al observar que el líquido estaba cerca del
2. Sección experimental borde superior. Se marcó rápidamente con un lápiz la línea
final que alcanzó el líquido después del ascenso. Se dejó
La práctica Aminoácidos: curva de titulación y separa-
secar la placa a temperatura ambiente. Se atomizó la placa
ción por cromatografía, se llevó a cabo en dos procedi-
con la solución de ninhidrina y se calentó la placa en un
mientos, los cuales necesitaron los siguientes materiales
horno a 105°C por minuto.
para realizarse con éxito: 2 vasos de precipitados de 100
mL, 1 vaso de precipitados de 250 mL, 1 pipeta graduada de
25 mL, 1 pera de succión, 1 bureta graduada de 25 mL, 1
pinza para bureta, 1 soporte universal, 1 agitador magnético,
1 frasco lavador, 1 probeta graduada de 25 mL, 1 cámara
cromatográfica, 2 placas de cromatografía, 3 capilares,
placa de agitación, pH metro y horno; y los siguientes reac-
tivos y/o sustancias: HCl 0,2 N (valorado), NaOH 0,2 N
Bureta.
(valorado), soluciones de aminoácidos en agua 0,1 M (ej:
glicina y glutamato), sílica gel-60, soluciones de aminoáci-
dos en agua al 2% (ej: triptófano, glicina, tirosina) mezcla
de solventes: n-butanol, ácido acético y agua (relación
12:3:5) y reactivo de ninhidrina: 0,2 g disueltos en 100 mL Vaso de
precipita-
de acetona (solución fresca). do.
El primer procedimiento llamado Titulación de un ami- pHmetro.
noácido, consistió en desarrollar el protocolo de trabajo, en Plancha de
el cuál se calibró el pH metro, luego, en un vaso de precipi- agitación y
de calen-
tado de 100 mL se colocaron 50 mL de la solución del ami- tamiento.
noácido (0,1 M), se empezó la agitación, se leyó el pH ini-
cial y se registró. Usando una bureta se agregó HCl 0,2 M, Figura 1. Montaje experimental - Titulación.
adicionando cada vez 1 mL y se determinó el pH después de
cada adición (figura 1). Se continuó agregando ácido hasta
pH 1,5 aproximadamente. Se registraron los valores de pH y
de ácido adicionado (mL). Se lavó el electrodo con agua
destilada y se titularon de la misma manera otros 50 mL de
la solución del mismo aminoácido agregando, esa vez hi- Placa.
dróxido de sodio 0,2 M, hasta pH 12,5.
El segundo procedimiento llamado Separación cromato-
gráfica de aminoácidos, consistió en preparar la cromato-
grafía, se adicionó la mezcla de solventes en una cámara Cámara para
para cromatografía y se cerró. La cámara se mantuvo sin cromatografía
perturbaciones por aproximadamente 20 minutos, esto per-
mitió saturar la atmósfera dentro de la cámara con el solven-
te. Se tomó la placa y con un lápiz se trazó cuidadosamente
una línea recta a través de lo ancho de la placa a aproxima-
damente 1,5 cm del borde inferior, esta línea se denominó Figura 2. Montaje experimental – Cromatografía.
línea de base. Usando capilares distintos para cada muestra
de aminoácidos, se colocaron diminutas gotas (siembras)
 Aminoácidos: curva de titulación y separación por cromatografía

3. Resultados y análisis 43 9,429

A continuación, se agruparon los datos obtenidos 44 9,52
de pH y volumen (mL) durante la titulación de la 45 9,593
Glicina en una tabla: 46 9,675
47 9,746
48 9,816
49 9,884
Tabla 1. Volumen y pH en la Titulación de Glicina. 50 9,948
51 10,021
Volumen (mL) pH 52 10,096
-1 3,718 53 10,167
-2 3,454 54 10,248
-3 3,254 55 10,332
-4 3,115 56 10,424
-5 2,995 57 10,534
-6 2,899 58 10,666
-7 2,817 59 10,815
-8 2,748 60 10,994
-9 2,672 61 11,254
-10 2,609 62 11,509
-11 2,547 63 11,718
-12 2,489 64 11,867
-13 2,431 65 11,978
-14 2,377 66 12,060
-15 2,327 67 12,126
-16 2,276 68 12,187
-17 2,224 69 12,232
-18 2,173 70 12,276
-19 2,123 71 12,310
-20 2,075 72 12,345
-21 2,029 76 12,370
-22 1,999 74 12,398
-23 1,940 75 12,423
-24 1,898 76 12,442
-25 1,854 77 12,466
-26 1,811 78 12,482
-27 1,772 79 12,500
-28 1,738
-29 1,702
-30 1,67
-31 1,638 Las medidas presentadas en la tabla fueron mediciones
directas arrojadas por los siguientes instrumentos de labora-
-32 1,609
torio con sus respectivas incertidumbres:
-33 1,584
-34 1,563
Tabla 2. Incertidumbre de los instrumentos.
-35 1,537
-36 1,488 Instrumento Incertidumbre
37 8,444 pHmetro ± 0.005 pH ± 0.01 pH
38 8,746 Pipeta graduada de 25mL ± 0.030 mL
39 8,964 Probeta graduada de 25mL ± 0.50 mL
40 9,104 y Bureta graduada de 25mL ± 0.03 mL
41 9,236
42 9,338
 Aminoácidos: curva de titulación y separación por cromatografía
14
12
10
8 La segunda etapa de la titulación corresponde a la elimina-
pH
6 punto medio de esta etapa es 9,60, igual al del grupo −𝑁𝐻3
4 La titulación es prácticamente completa a un pH alrededor
2 𝐻2 𝑁 − 𝐶𝐻2 − 𝐶𝑂𝑂 − . (Nelson, D.L. and M.M. Cox)
0
0 20 40 60 80 100
Volumen OH- o H+ (mL)
Grafico 1. Curva de titulación de la Glicina.
La curva de titulación de la Glicina, el aminoácido más
simple, a valores pH bajos, ambos grupos ácidos-básicos de
la Glicina están completamente protonados. Durante el
curso de la titulación con una base fuerte como el 𝑁𝑎𝑂𝐻 y
un ácido fuerte 𝐻𝐶𝑙 , la glicina pierde sus protones en eta-
pas, en las formas características de los ácidos poliproticos.
(Mora, 2007)
Al observar la curva de titulación se distinguen varios pun-
tos importantes en relación con la capacidad reguladora del
aminoácido. Para la Glicina, hay dos puntos en los que los
cambios de la concentración de los equivalentes de NaOH
no alteran el pH de la solución. Se alcanza un punto de
inflexión en que el pH es igual al pKa del grupo protonado
que se está titulando. (Mora, 2007)
Se puede asegurar que la Glicina posee capacidad amorti-
guadora alrededor de un pH de 2,34 y de un pH de 9,60. Por
lo que tiene dos regiones de capacidad tamponante. Lo que
indica que la Glicina es un buen tampón cerca de estos dos
rangos (1,34-3,34) y (8,60-10,60) de los valores de pH.
La gráfica tiene dos etapas distintas, que corresponden a la
desprotonación de dos grupos diferentes de la glicina. A pH
muy bajo, la especie iónica predominante de la glicina es
+𝐻3 𝑁 − 𝐶𝐻2 − 𝐶𝑂𝑂𝐻, la forma totalmente protonada.
En el punto medio de la primera etapa de la titulación, en el
que el grupo -COOH de la glicina pierde su protón, se en-
cuentran presentes concentraciones equímolares del dador
de protones (+𝐻3 𝑁 − 𝐶𝐻2 − 𝐶𝑂𝑂𝐻) y del aceptor de pro-
tones (+ 𝐻3 𝑁 − 𝐶𝐻2 − 𝐶𝑂𝑂𝐻 − ). A medida que avanza
la titulación se alcanza otro punto importante a pH 5,97.
Aquí hay otro punto de inflexión en el que la eliminación
del primer protón es prácticamente completa mientras que
tan sólo se ha iniciado la eliminación del segundo. A este
pH la Glicina se encuentra mayoritariamente en forma del
ión dipolar (zwitterion) +𝐻3 𝑁 − 𝐶𝐻2 − 𝐶𝑂𝑂𝐻 − . (Nelson,
D.L. and M.M. Cox).
ción de un protón del grupo -NH3 de la glicina. El pH en el
de 12, en donde la forma predominante de la glicina es
Un punto importante de reconocer en la curva de titulación
es el punto isoeléctrico (pI) que, como su nombre lo indica,
es el valor en el cual el aminoácido se encuentra en su for-
ma eléctricamente neutra (es decir, la suma la suma de las
cargas de los grupos protonables o desprotonables –carga
neta- es igual a 0). (Jaime Fornaguera y Georgina Góm,
2007)
En el punto isoeléctrico cualquier cambio de carga (varia-
ción del número de equivalentes de OH- o H+) cambia las
propiedades ácido- base del aminoácido, y provoca un cam-
bio brusco de pH; dicho de otro modo es el punto de menor
capacidad amortiguadora del aminoácido.
El punto isoeléctrico para la curva de titulación se calculó
mediante la siguiente relación:
𝟏
𝒑𝑰 = 𝟐 (𝒑𝑲𝟏 + 𝒑𝑲𝟐 ) (1)
Siendo el Punto isoeléctrico:
1
𝑝𝐼 = (2.34 + 9,60)
2
𝒑𝑰 = 𝟓, 𝟗𝟕
La glicina tiene una carga neta negativa a cualquier pH por
encima de su pI, por lo que se desplazará hacia el electrodo
positivo (ánodo) cuando se coloque en un campo eléctrico.
A cualquier pH por debajo de su pI, la Glicina tiene una
carga neta positiva, y se desplazará hacia el electrodo nega-
tivo (cátodo). Cuanto más alejado esté el pH de una disolu-
ción de glicina de su punto isoeléctrico, mayor será la carga
eléctrica neta de la población de moléculas de glicina. (Nel-
son, D.L. and M.M. Cox)-
 Aminoácidos: curva de titulación y separación por cromatografía

| 𝟎,𝟐𝟑−𝟎,𝟐𝟗 |
Glicina. Glicina: 𝑬= 𝒙 𝟏𝟎𝟎
𝟎,𝟐𝟑

Metionina. E= 26,08%

Arginina.
Todas las siembras presentaron error puesto que en cada
Problema.
una hubo diferencia entre el Rf esperado y el Rf obtenido en
la práctica de laboratorio de cromatografía.

A partir de la técnica de Cromatografía en capa fina de los

Aminoácidos: Glicina, Metionina y Asparagina. Se compa-
Figura 3. Cromatografía en capa fina raron los valores Rf de los mismos para reconocer el Ami-
noácido problema.
Antes de comparar los valores de los Rf obtenidos para
Se calcularon los valores de Rf de los Aminoácidos sem- determinar la muestra problema, se notó que hubo un error a
brados en la cromatografía en capa fina: la hora de llevar a cabo la siembra de los aminoácidos, ya
que se sembró antes de la línea de base. Por lo que la línea
base no estuvo con las muestras sembradas encima del sol-
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒑𝒓𝒐𝒃𝒍𝒆𝒎𝒂 vente, lo que no permitió que hubiese una correcta separa-
𝑹𝒇 = (2)
𝑫𝒊𝒔𝒕𝒂𝒏𝒄𝒊𝒂 𝒓𝒆𝒄𝒐𝒓𝒓𝒊𝒅𝒂 𝒑𝒐𝒓 𝒆𝒍 𝒇𝒓𝒆𝒏𝒕𝒆 𝒅𝒆𝒍 𝒅𝒊𝒔𝒐𝒍𝒗𝒆𝒏𝒕𝒆 ción de la mezcla de los Aminoácidos Problema.
De esta manera a partir de las observaciones cuantitativas
sepudo identificar que el valor del Rf del Aminoácido pro-
1,6 blema está más cercano al valor del Rf de la Asparagina
Glicina 𝑅𝑓 = 5,5= 0,29 (Rf=0,49) sobre pasando solo en cinco décimas al valor del
Rf problema, lo cual no es una diferencia tan significativa
1.9 en este tipo de pruebas.
Metionina 𝑅𝑓 = = 0,34
5,5 Sin embargo el Aminoácido problema no contiene Aspara-
gina por lo que el error en la siembra no arrojó los aminoá-
2,7 cidos correctos que conformaban la mezcla problema (Gli-
Arginina 𝑅𝑓 = 5,5 = 0,49
cina y Metionina) que como se ve en los valores Rf no se
acercan al Rf Problema.
2,4
Problema 𝑅𝑓 = 5,5 = 0,44
4. Conclusiones
Tabla 3. % de error de los Rf esperados y obtenidos.  Los puntos de la curva de titulación en los
cuales no se produce cambio de pH, a pe-
sar del aumento en la concentración de
% de
Aminoácidos Rf esperado Rf obtenido equivalentes ácidos (o básicos) en la solu-
error ción, indican los valores de pK.
Glicina 0,23 0,29 26,08%  El punto isoeléctrico de la Glicina
Metionina 0.51 0,34 33,3% (pI=5,97) indica el valor de pH en que la
Arginina 0,25 0,49 96% carga neta del aminoácido es 0, pequeños
cambios en la concentración de OH- o H+
0,51 13,7%
Problema 0,23
0,44 ocasionan cambios bruscos de pH que no
91,3% le confiere capacidad amortiguadora al
aminoácido.
 Mediante la cromatografía se puede evi-
Ejemplo. ERROR Rf esperado – Rf obtenido: denciar la polaridad de cada aminoácido,
el desplazamiento indica qué tan polar es
cada aminoácido respecto al solvente.
| 𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒓𝒂𝒅𝒐 − 𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒐𝒃𝒕𝒆𝒏𝒊𝒅𝒐 |
𝑬= 𝒙 𝟏𝟎𝟎
𝒗𝒂𝒍𝒐𝒓 𝒆𝒔𝒑𝒆𝒓𝒂𝒅𝒐
 Aminoácidos: curva de titulación y separación por cromatografía

5. ANEXO

¿Cuál es la utilidad del punto isoeléctrico en la separación

de aminoácidos?

El punto isoeléctrico, designado pI, es el pH en que la carga

neta del aminoácido es nula; en este punto el aminoácido se
encuentra en forma de ion dipolar, así como en pequeñas
cantidades equimolares de aniones y cationes y una pequeña
fracción de aminoácido no ionizado. El pI de los aminoáci-
dos neutros se localiza a pH ≈ 6-8.
El hecho de que la carga neta de un aminoácido varíe con el
pH del medio, y de que venga determinada por los valores
pK de los grupos ionizables, implica que los aminoácidos se
pueden separar por electroforesis. (Nelson & Cox, 2009)

6. Referencias.
Horton, R., Moran, L., Scrimgeour, G., Perry, M., & Rawn,
D. (2008). Principios de Bioquímica. Mexico:
Pearson.
Jaime Fornaguera y Georgina Góm. (2007). Bioquímica: la
ciencia de la vida. UENED.
Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio
para Bioquímica. San José, Costa Rica: UENED.
Nelson, D., & Cox, M. (2009). Lehninger principios de
bioquímica. Barcelona: omega.
Suárez López, M. M., Kizlansky, A., & López, L. B.
(2006). Evaluación de la calidad de las proteínas en
los alimentos calculando el escore de aminoácidos
corregido por digestibilidad. Nutrición hospitalaria,
21(1), 47-51.