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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC

¨FACULTAD DE INGENIERÍA

Escuela Académico Profesional de Ingeniería


Agroindustrial

“Año de la consolidación del Mar de Grau”

PREPARACIÓN DE INOCULO

INFORME : 01

ASIGNATURA : Laboratorio de Biotecnología

DOCENTE : Ing. Víctor Hugo Sarmiento Casavilca

ESTUDIANTE : CÓDIGO

 CCENTE ORTIZ Jhasminy Elizabeth 121060

SEMESTRE : 2016-I

F. DE EJECUCIÓN PRÁCTICA: 18-12-15

F. DE ENTREGA DE INFORME: 28-12-15

ABANCAY – APURÍMAC

2016
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURÍMAC
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICA PROFESIONAL AGROINDUSTRIAL

PREPARACIÓN DE INOCULO

I. SUMMARY
In the present report entitled inoculum preparation, three objectives were studied; The first
being to obtain identical phenotypic copies of an Aspergillus niger strain, where it was seeded
in the PDA culture medium with an incubation period for 48 hours at 28 ° C; From which a
spore count was performed by the Neubauer chamber method where 114.5*104 células/ml,
was obtained because the Aspergillus niger spores resulted in a lower concentration of 10
106 esporas/ml, it is not necessary to carry out the dilution according to the established
protocol.

II. RESUMEN
En el presente informe titulado preparación de inoculo, se estudió tres objetivos; siendo la
primera obtener copias fenotípicas idénticas de una cepa de Aspergillus niger, donde se sembró
en el medio de cultivo PDA con un periodo de incubación durante 48 horas a 28°C.; del cual se
realizó un conteo de esporas por el método de la cámara de Neubauer donde se obtuvo
114.5*104 células/ml, debido a que las esporas de Aspergillus niger resultaron a una
concentración menor 106 esporas/ml, no es necesario realizar la dilución según el protocolo
establecido.
III. INTRODUCCIÓN
El Aspergillus niger se encuentra en el grupo sustrato (suelo, plantas, alimentos) y un
de los aspergillus negros, el cual se clasifica micelio aéreo donde se forman las esporas
dentro de la familia moniliaceae, orden (sexuales y asexuales) (Alexopulos,1966)
moniliales, clase hyphomicetes, filum
El Aspergillus es filamentoso (compuesto de
deuteromycota. (Kwon-Chung, 1992).
cadenas de células, llamadas hifas, el tipo de
hongos opuesto a las levaduras, que se
La mayoría de los hongos, sin embargo, son
componen de una sola célula redonda). (Sáez
pluricelulares o filamentosos y se caracterizan
Vega, Flórez Valdés, & Cadavid Rendón,
por estar constituidos por filamentosos
2002)
ramificados o hifas que se desarrollan y
entrelazan formando el micelio. Existe un
Para realizar un conteo de esporas, se puede
micelio vegetativo adosado a la superficie del
usar la cámara de Neubauer. Para determinar la

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concentración se usa un hemacitómetro, con el Cuando el cultivo está muy concentrado


cual se hacen conteos de esporas en campos de (>106 cél/mL) se diluye la muestra con agua de
dimensiones conocidas, que darán el número de mar o destilada (según sea el caso).
esporas por ml de la suspensión inicial. De esta Generalmente una dilución 1:10 es suficiente,
forma, por medio de diluciones se obtiene el pero es necesario verificar que la concentración
inóculo en la concentración deseada. resultante sea suficiente para obtener una
(Arredondo Vega & Voltolina, 2007) precisión adecuada (Lund et al., 1958).
OBJETIVOS:
La cámara consta de dos campos de conteo,
 Obtener copias fenotípicas idénticas de una
cada uno con nueve cuadros que, a su vez,
cepa de Aspergillus niger.
están divididos en cuadros más pequeños.
 Aprender a usar la cámara de Neubauer.
Tanto los cuadros grandes como los pequeños
 Obtener un inoculo de esporas de Aspergillus
tienen dimensiones conocidas, de tal modo que
niger a una concentración de 106 esporas/ml.
por medio de fórmulas se puede obtener el
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
número de esporas por ml (Gilchrist et al, 2005).
La práctica de preparación de inoculo fue
desarrollada en el laboratorio de
Una de las dificultades para el recuento al
Biotecnología de la UNAMBA.
microscopio es obtener una buena
Materiales
reproducibilidad, por lo cual es importante saber
Para su realización se usó los siguientes
seleccionar el tamaño de la muestra, la dilución,
Materiales:
el tipo de cámara de recuento, el objetivo del
Material biológico
microscopio y la técnica de llenado de la
-Cepa de Aspergillus niger.
cámara. En algunos casos, puede ser necesario Material vegetal
corroborar el volumen de la cámara que se está -60 gr de papa blanca pelada.
utilizando. (Arredondo Vega & Voltolina, 2007) Material químico
PDA:
Características del hematocitómetro -4 gr Agar Agar
-4 gr Glucosa Anhidro
(Neubauer): Volumen 0.9 μL; profundidad:
Material de laboratorio
0.1mm; Área: 9 𝑚𝑚2 ; tamaño celular: 2-30 μm;
-Probetas
cel. /ml: 104 − 107 (Guillard y Sierracki, 2005) -Pipetas
-Gradillas
-Matraces
-Cámara de Neubauer

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-Portaobjeto  Una vez disuelta los agares en el medio


-Asa de siembra
PDA, este se traspasa a 10 tubitos con
Equipos
tapa rosca, colocamos los tubitos en un
-Autoclave vaso precipitado para pasar a
-Vartex
-Balanza analítica. ser esterilizado.
-Microscopio Siembra de cepas de Aspergillus
Material anexo
niger:
-Mandil.
-Gorro.  Una vez estéril el medio de
-Barbijo. PDA, debido a que esta esta
Procedimientos: solidificada, calentamos los
Preparación de Agar (PDA) papa dextrosa: medios con ayuda de un
 Ya pelada la papa y cortada en microondas, y
Figura 1. Cepa de Aspergillus niger
cuadraditos, pesamos 60 gr de ella. los tubitos se
 La papa se agregó a un vaso precipitado solidificaran de nuevo a temperatura
con 100ml de agua destilada y se llevó a ambiente de forma que esta queda en
ebullición (400°C) durante 15 minutos forma de pico.
 Se filtró el agua de la papa y se elimina la  Tomamos la cepa de Aspergillus niger y
papa picada y pelada, quedándonos con el con la ayuda de una asa de siembra
agua de la papa, traspasamos a un procedemos a sembrar cepas en los
matraz, a esta seguidamente se le añade tubitos, todo esto en un ambiente estéril,
el 4gr de agar agar y 4gr de glucosa tapamos los tubitos semiabiertos y se llevó
anhidro, más 100 ml de agua destilada a incubación durante 48 horas a 28°C.
disolvemos bien para asegurarnos que no Selección de cepas:
se produzcan grumos agares, esto  Seleccionamos un tubito de los 10 tubos con
formara el medio PDA. esporas, teniendo en cuenta a la cepa que
se desarrolló mejor.
 Se le agregó 1ml de agua estéril a este
tubito, y con la ayuda del Vartex
homogenizamos el agua y las esporas, con
la finalidad de que haya suspensión de
esporas.
Conteo en cámara de Neubauer

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 Del tubo de ensayo anterior (esporas + agua


estéril) se sacó 0.1 ml con la ayuda de una V. RESULTADOS
pipeta estéril de 1ml, y se gotea a la cámara En el conteo de la cámara de Neubauer, se
de Neubauer, asegurándonos de que no se obtuvo los siguientes resultados:
derrame y se disperse a todas las cámaras
de ella.
 Colocamos a un portaobjetos y lo llevamos Cuadro N°1: Resultados del conteo de
a un microscopio, y con el debido protocolo esporas en las celdas del primer espejo.
de identificación, Celda 1er 2do
situamos la espejo espejo
muestra dentro, 1C 8 9
donde se centró en 2C 5 7
el primer espejo 3C 14 3
que posee 25 4C 11 0
cuadrados, siendo
5C 2 3
la técnica de
6C 5 3
conteo de derecha Figura 2. Técnica de conteo
7C 2 4
a izquierda en de la siguiente manera:
8C 7 5
 Evitamos contar las
9C 1 9
células que están
10C 1 0
encima de las líneas de
11C 1 8
delimitación, no se
cuentan. 12C 4 3
13C 2 15

Figura 3. Esporas dentro de un espejo de la cámara 14C 1 11


de Neubauer 5 2
15C
 Una vez realizado el conteo del primer
16C 4 2
espejo, pasamos al segundo espejo.
17C 8 9
 Promediamos los dos resultados del primer
y segundo objetivo, debido a que esta es 18C 2 0

114.5 no se realiza la dilución, ya que no 19C 1 6

supera en cantidad para llegar a los 106 de 20C 1 2


colonias.

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21C 1 24 Según Lund et al., 1958; Cuando el cultivo está


22C 1 1 muy concentrado (>106 cél/mL) se diluye la

23C 6 1 muestra, en este caso se obtuvo 114.5*104

24C 6 2 células/ml; una solución que no están

25C 1 1 concentrada, por lo cual no fue necesario

100 129 realizar una dilución respectiva.


Total
Cuadro N°2: Características de las
VII. BIBLIOGRAFÍA
esporas de Aspergillus niger.
Color Negro
Forma Redonda Arredondo Vega, B. O., & Voltolina, D. (2007).
CONCENTRACIÓN, RECUENTO CELULAR Y TASA
DE CRECIMIENTO. ResearchGate.
Según el Cuadro N°1, podemos observar que el
2do espejo hay mayor cantidad de esporas que Sáez Vega, A., Flórez Valdés, L., & Cadavid Rendón, A.
(2002). Caracterizacion de una cepa nativa de
en el espejo 1er. Espejo. Aspergillus niger y evaluacion de acido citrico.
Universidad EAFIT.
Hallamos el promedio de entre los dos espejos:
100 + 129
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 = = 114.5 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠
2
Entonces podemos decir que en los espejos hay
114.5*104 células/ml
104 = Factor de conversión de 0.1 μL a 1 mL
No se realizó la dilución respectiva.
VI. DISCUSIONES
Según Guillard y Sierracki, 2005; las
Características del hematocitómetro (Cámara de
Neubauer), tiene una capacidad de 104 −
107 células /ml, por ello es necesario que la
dilución del inoculo de esporas de Aspergillus
niger tenga una concentración de 106
esporas/ml, ya que más una dilución de 1:10
esta capacidad será completa.

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