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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE


DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Apostila de Técnicas de microscopia vegetal

Profa. Fabiane Nepomuceno Costa

Diamantina – 2010
Apostila de Farmacobotânica

MICROTÉCNICA VEGETAL

CONSIDERAÇÕES GERAIS
As Ciências Morfológicas descrevem as relações espaciais dos elementos estruturais.
Esses elementos formam um sistema hierárquico, cujos componentes apresentam dimensões
diferentes. De acordo com a estrutura que vai ser analisada, instrumentos diferentes são
necessários para sua observação.
De um modo geral, órgãos vegetais são visíveis a olho nu ou com microscópio
estereoscópico. Tecidos ou células são visualizados com microscópio óptico e organelas
celulares com microscópio eletrônico.
Desse modo, o material botânico deve ser coletado e preparado adequadamente para uma
boa observação.

COLETA
Sempre que possível deve-se coletar um mínimo de exemplares de uma planta em seu
estado mais perfeito e completo. A coleta deve ser adequada ao objetivo do trabalho a ser
desenvolvido. Assim podemos ter a planta inteira ou partes como ramos, porções do caule etc.

CONSERVAÇÃO
O material botânico pode ser conservado herborizado (prensado e desidratado) ou em
líquidos de preservação, como etanol 70%, formaldeído a 10% ou FAA (formaldeído a 40%,
ácido acético e etanol 95%).
Os líquidos de preservação podem ser fixadores, ou seja, substâncias químicas que
promovem a morte das células e sua preservação estrutural em estado próximo do material
fresco. Na fixação ocorre coagulação ou precipitação das proteínas ou de outros componentes
celulares. As principais substâncias fixadoras são formol, álcool, iodo, bicromato de potássio e
os ácidos: acético, pícrico crômico e ósmico. A escolha do uso de soluções depende dos
objetivos do trabalho a ser realizado. Atenção para evitar o contato das soluções fixadoras com a
pele, pois a maioria das substâncias citadas é tóxica.
O material fresco presta-se para observações rápidas ou que não dependem da
conservação para verificação posterior.

Composição do FAA
Etanol 95% ...........................................................50,0ml

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Ácido acético glacial............................................... 5,0ml


Formaldeído ..........................................................10,0ml
Água destilada .......................................................35,0ml

TIPOS DE PREPARAÇÕES
Para se observar o material em microscopia óptica, este deve ser suficientemente delgado
para que a luz possa passar através dele. A observação de algumas estruturas só é possível após o
preparo destas, envolvendo seccionamento (cortes histológicos), diafanização ou dissociação
(maceração) de órgãos ou tecidos.
Muitas vezes é aconselhável a coloração dos materiais, cuja finalidade é acentuar os
contrastes entre os vários tipos de células e tecidos da planta. Os corantes ou reagentes mais
largamente empregados são o cloreto de zinco iodado, Sudam III ou IV, Lugol, hematoxilina,
verde-firme, azul de alcião, fucsina básica, orange G, entre outros.

1. Seccionamento (cortes histológicos)


É difícil interpretar estruturas tridimensionais pelo estudo de cortes delgados que podem
fornecer uma falsa impressão da arquitetura do órgão. Por exemplo, uma simples fatia de um
objeto como um ovo poderá dar a determinada pessoa que nunca tenha visto este objeto uma
interpretação errada de sua estrutura. Assim, quando se estuda um órgão, é indispensável a
utilização de cortes realizados em diferentes partes e em diferentes planos, ou então seriados.
Quando a estrutura ou órgão apresenta formato laminar achatado, os cortes podem ser:
transversal (perpendicular ao maior eixo da estrutura), longitudinal (paralelo ao maior eixo da
estrutura) ou paradérmico (paralelo à superfície plana e ao maior eixo da estrutura ou órgão)
Figura 1). Em órgãos cilíndricos podem-se obter os seguintes tipos de cortes: transversal
(perpendicular ao maior eixo da estrutura), longitudinal tangencial (paralelo ao maior eixo da
estrutura ou órgão e que não passa pelo centro do mesmo) ou longitudinal radial (paralelo ao
maior eixo da estrutura ou órgão, passando pelo centro do mesmo) (Figura 1).
Pode-se utilizar o micrótomo para obtenção de cortes finos, mas para realização dos
cortes neste equipamento, o material vegetal deve estar devidamente desidratado e incluído em
um suporte (mais comum: parafina). Geralmente obtêm-se cortes à mão livre, com auxílio de
uma lâmina de barbear e/ou um suporte (isopor, pecíolo de embaúba, medula do caule de
sabugueiro).

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Longitudinal Longitudinal
radial tangencial

Transversal

Figura 1. Planos de corte em órgão cilíndrico.

2. Diafanização
A diafanização consiste em tratar amostras biológicas de modo a torná-las
semitransparentes. É muito utilizada no estudo de venação, epidermes e estruturas reprodutoras.

3. Dissociação (maceração)
A dissociação ou maceração é o processo pelo qual há dissolução da substância
intercelular (lamela média) separando-se, assim, as células que compõem o tecido. Há vários
métodos para a se efetuar a dissociação de material vegetal.

PREPARAÇÕES HISTOLÓGICAS
As preparações histológicas para microscopia óptica podem ser permanentes, semi-
permanentes e temporárias.
Nas preparações temporárias utilizam-se cortes de material que são montados e no seu
próprio líquido de inclusão ou no próprio corante ou reagente, que pode ser água, glicerina 50%,
etanol 70% etc. As preparações temporárias podem ser coradas com cloreto de zinco iodado,
Sudam II ou IV, lugol etc.

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As preparações do tipo semi-permanente e permanente são aquelas que requerem um


processo especial de preparação. Essas preparações têm a vantagem de se manterem em boas
condições de observação por muitos anos e são montadas em gelatina glicerinada e bálsamo-do-
canadá, respectivamente. Corantes como safranina, hematoxilina, verde-firme, azul de alcião,
fucsina básica e orange G são freqüentemente empregados.

TÉCNICA DE CORTES À MÃO LIVRE


Por ser uma das maneiras mais simples, rápida e pouco dispendiosa, o procedimento de
obtenção de cortes à mão livre é a metodologia que normalmente é escolhida para se iniciar um
estudo em anatomia vegetal.
A técnica para seccionar um material vegetal à mão livre pode variar. Algumas regras
básicas podem auxiliar o trabalho e devem ser seguidas:
a. Verificar a orientação desejada pelo conhecimento prévio da morfologia do órgão em
estudo, antes de cortar o material;
b. Caso o material a ser cortado seja muito pequeno ou escorregadio e não possa ser
mantido com firmeza entre os dedos da mão, recorremos a suportes (Figura 2);
c. A superfície a ser cortada deverá ser igualada com uma lâmina de barbear antes de
realizar os cortes;
d. Colocar uma gota de água sobre o material e fazer o corte, segurando a lâmina de barbear
entre os dedos polegar e indicador. Devem ser utilizadas lâminas de barbear novas, pois
uma lâmina já usada impede a obtenção de um bom corte;
e. Durante o corte, a lâmina de barbear deve deslizar suavemente sobre a superfície do
material. Exercer pouca pressão. O suficiente para cortar e se obter cortes bem delgados;
f. Deve-se fazer um grande número de cortes para posterior seleção dos mais delgados.
Estes são mais transparentes e dobram quando suspensos por um pincel ou estilete;
g. Á medida que os cortes forem sendo feitos, transferi-los, com o auxílio de um pincel ou
estilete, para uma placa de Petri ou vidro de relógio, contendo água ou qualquer outro
líquido de inclusão;
h. Colocar a placa de Petri sobre um fundo que permita visualizar melhor os cortes e
selecionar os mais finos;

TÉCNICA DE CLAREAMENTO
A célula vegetal contém inúmeras substâncias que possuem cor, dentre elas os
pigmentos. Para facilitar a observação das estruturas, vários métodos de coloração podem ser

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empregados, entretanto para que sejam eficientes, é necessário que os tecidos estejam livres de
outras cores.
O clareamento dos cortes é feito utilizando solução de hipoclorito de sódio comercial ou
cloral hidratado. O transporte dos cortes mais delgados para a solução de hipoclorito deve ser
feito com o auxílio de estilete e não com pincel, para não danificar suas cerdas. Transferir os
cortes em seguida para outro recipiente com água destilada e enxaguar abundantemente. Com o
objetivo de corrigir o pH para que não haja interferência na eficácia do corante, passar os cortes
em solução de ácido acético diluído, enxaguando em água em seguida.

TÉCNICA DE COLORAÇÃO
Uma dupla coloração simples e fácil de ser realizada é a que emprega como corantes o
azul de alcião e a fucsina básica.
a. Retirar os cortes do meio de fixação ou preservação, lavar com água destilada e colocar a
solução de hipoclorito de sódio comercial, até que fiquem clarificados;
b. Lavar várias vezes em água destilada;
c. Gotejar azul de alcião 0,5% e deixar por 1 a 3 minutos;
d. Lavar em água destilada;
e. Gotejar fucsina básica 0,1% em etanol 50% e deixar por 1 minuto;
f. Lavar em etanol 50% e depois em água destilada até o corante não ser mais eliminado;
g. Colocar, com um conta gotas, uma gota de glicerina 50% sobre a lâmina histológica;
h. Transferir para a lâmina, com o auxílio de um pincel, o corte a ser examinado;
i. Cobrir com lamínula: encoste um dos lados da lamínula no bordo da gota de líquido de
montagem e espere que este se espalhe ao longo da lamínula e, então, desça-a lentamente
para evitar a formação de bolhas de ar;
j. Se necessário, retirar o excesso do meio de montagem com papel de filtro;
k. Algumas vezes é interessante manter a lâmina para observações posteriores. Para tanto
deve-se vedar toda a lamínula com esmalte de unha incolor.

REAGENTES E CORANTES
Reagentes:
a. Cloreto de zinco iodado (Composição: Cloreto de zinco, iodeto de potássio, iodo e água
destilada).

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É usado para detectar lignina (coloração amarelo-acastanhada) e celulose


(coloração cinza-azulado). Os grãos de amido são corados em marrom ou azul-negro pela
presença de iodo na composição do reagente.
b. Floroglucina acidificada (Composição: etanol 95%, floroglucinol e ácido clorídrico
37%).
É usado para detectar lignina (coloração vermelha).
c. Lugol (Composição: iodo, iodeto de potássio e água destilada).
É usado para detectar grãos de amido (coloração marrom a azul-negra).

Corantes:
a. Azul de alcião (Composição: azul de alcião, ácido tartárico e água).
É usado para detectar celulose (coloração azul).
b. Fucsina básica (Composição: fucsina básica e etanol 50%).
É usado para detectar lignina (coloração vermelha).
c. Sudam IV (Composição: Sudam IV, etanol 80% e glicerina).
É usado para detectar cutina e suberina (coloração marrom-avermelhada).
d. Safranina (Composição: safranina e etanol 50%).
É usado para corar material dissociado e detectar lignina, suberina e cutina
(coloração avermelhada).

Obs.: O corante que será mais utilizado em nossas aulas é o safrablau. Trata-se de uma solução
composta por dois tipos de corantes: o azul de astra ou azul de alcião, que cora paredes
celulósicas em azul, e a safranina, que cora paredes lignificadas, suberificadas e cutinizadas em
vermelho.

DESENHOS
As práticas de Anatomia Vegetal são realizadas mediante a observação de várias
estruturas vegetais em diversos grupos, portanto é necessária a documentação das observações
através da confecção de desenhos.
Os desenhos devem ser simples e levar em consideração a forma do objeto e as
proporções dos componentes dos cortes. Outro aspecto importante é a inclusão de legendas, para
que se possa reconhecer as estruturas desenhadas.
Dois tipos de desenho podem ser empregados nas aulas práticas:

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a. Desenho detalhado: Tem o objetivo de representar a estrutura da maneira mais próxima


ao material observado. Deve ser incluído o maior número possível de detalhes.
b. Desenho esquemático: Fornece uma idéia global de forma simplificada do material em
estudo. Leva em consideração a forma e a proporção dos diferentes componentes. Para
este tipo de desenho, pode-se empregar a convenção de Metcalfe & Chalk para a
representação de tecidos conforme segue abaixo.

Parênquima

Colênquima
Esclerênquima

Felema ou súber

Xilema

Floema

Epiderme

Sempre anote qual material vegetal e o tipo de corte que estão sendo observados. Anote
outras informações que forem importantes no estudo que estiver sendo realizado.

TECIDOS VEGETAIS

CONSIDERAÇÕES GERAIS

A epiderme origina-se da protoderme e reveste a superfície do corpo vegetal em estágio


primário. Nos órgãos que não apresentam crescimento secundário, a epiderme persiste por toda a
vida da planta. A epiderme acha-se formada, geralmente, por uma só camada de células, sendo
constituída por células epidérmicas comuns e células especializadas, dispersas entre as primeiras,
tais como estômatos e tricomas, entre outras. A característica mais importante da parede das
células epidérmicas das partes aéreas é a presença de cutina, substância graxa encontrada nos
espaços interfibrilares e intermicelares da celulose, e posteriormente depositada externamente,
formando a cutícula.

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A periderme é o tecido de revestimento de órgãos em crescimento secundário e substítui


a epiderme. A substituição, portanto, ocorre quando o órgão já apresenta crescimento em
espessura, decorrente da atividade cambial, o que provoca a compressão das camadas periféricas.
A periderme ocorre em plantas herbáceas e lenhosas, geralmente nas partes mais velhas das
raízes e caules, e se forma à partir da diferenciação de um ou mais felogênios. Portanto ela é
constituída por este meristema lateral e os seus produtos: feloderme, situada para dentro do corpo
vegetal, e súber, situado para fora.
O parênquima é constituído de células, em geral isodiamétricas, que podem possuir
formatos diversos. As células parenquimáticas, geralmente, possuem paredes delgadas,
compostas de celulose, hemicelulose e substâncias pécticas. O tecido parenquimático está
distribuído por quase todos os órgãos da planta e podem apresentar características especiais que
possibilitam o desempenho de atividades esenciais na planta como fotossíntese, reserva,
transporte, secreção e excreção. De maneira geral, podem distinguir-se três tipos de parênquima:
de preenchimento ou fundamental, clorofiliano e de reserva.
O colênquima origina-se do meristema fundamental; é o tecido de sustentação
constituído por células vivas que apresentam parede primária bem espessada. A característica
mais marcante deste tecido refere-se ao espessamento desigual das paredes ceulares: áreas bem
espessadas alternam-se com áreas pouco espessadas. A plasticidade da parede celular das células
colenquimáticas possibilita o crescimento do órgão ou tecido até atingir a maturidade.
O esclerênquima é também um tecido de sustentação que, como o colênquima, tem
origem primária, diferindo deste último porque geralmente suas células não mantém seus
protoplastos vivos na maturidade e apresentam parede secundária lignificada, cujo espessamento
é uniforme.
Durante o crescimento da planta, a plasticidade da parede celular (do colênquima) é
muito importante pois as células sofrem alongamento, porém quando atinge a maturidade, a
célula deve assumir uma forma definida e, neste caso, a elasticidade da parede (do
esclerênquima) é mais relevante que a plasticidade. Uma aprede elástica pode ser deformada por
tensão ou pressão, mas reassume sua forma e tamanho originais quando esas forças desaparecem.
Se um órgão maduro fosse constituído unicamente de tecidos plásticos, as deformações causadas
pelos mais variados agentes como vento, passagem de animais e outros, seriam permanentes. Por
outro lado, a planta deve oferecer resistência às peças bucais, unhas e ovopositores de animais. A
presença de esclerênquima como uma camada protetora ao redor do caule, sementes e frutos
imaturos evita que os animais e insetos se alimentem deles, porque a lignina não é digerida,
sendo um mecanismo de defesa da planta.

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O xilema é o tecido especializado na condução de água e sais minerais. Ele e o floema


formam o sistema vascular, que se estende por todo o corpo da planta. O xilema é um tecido
complexo, constituído de diversos tipos celulares: elementos traqueais (traqueídes e elementos
de vaso), células parenquimáticas e células esclerenquimáticas. Pode ser de origem primária,
sendo derivado do procâmbio, ou secundário, quando derivado do câmbio vascular. Devido às
paredes lignificadas de suas células, o xilema é mais conspícuo que o floema: pode ser estudado
mais facilmente e é melhor preservado nos fósseis. É também utilizado na identificação de
plantas, especialmente as que têm hábito arbóreo.
O floema é o tecido especializado na condução de produtos derivados da fotossíntese. O
floema, assim como o xilema, é um tecido complexo, constituído de diversos tipos celulares:
elementos crivados (células crivadas e elementos de tubo crivado), células parenquimáticas e
células esclerenquimáticas. Assim como o xilema, o floema pode ser de origem primária ou
secundária.
As células secretoras podem ser individualizadas, constituindo os idioblastos, ou ser
encontradas compondo estruturas secretoras multicelulares – de formas variadas – tricomas,
emergências, cavidades, bolsas e canais. O material secretado (exsudato) possui composição
química variável e complexa, a exemplo da água, soluções salinas, néctar, mucilagem e, ou
goma, proteínas, óleos, resinas etc.

ROTEIRO DA AULA PRÁTICA: CARACTERIZAÇÃO DOS PRINCIPAIS TECIDOS VEGETAIS

1. Lâmina com corte paradérmico de folha de Ocimum basilicum L. – Lamiaceae (manjericão)


com dupla coloração (safrablau).
a. Observe as células epidérmicas e esquematize-as.
b. Observe os tricomas glandulares e tectores presentes na epiderme do manjericão.
Esquematize (em 400x).

2. Corte transversal de folha de Croton sp. com dupla coloração (safrablau).


a. Observe todos os tecidos presentes.

3. Seção transversal de caule de Bidens pilosa L. (picão – Asteraceae) com dupla coloração
(safrablau).
a. Identifique na seção os seguintes tecidos: parênquima, colênquima e de revestimento.
Esquematize.
b. Compare com as observações efetuadas na aula anterior sem o emprego de corantes.

4. Seção transversal de pecíolo de Ricinus communis L. (mamona) com dupla coloração


(safrablau).

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a. Observe os cortes ao microscópio e identifique os tipos de parênquima e colênquima


encontrados. Esquematize.

5. Seção transversal do caule de Ruta sp. (arruda) com dupla coloração.


a. Localize os tecidos vasculares. O órgão se encontra em crescimento primário ou
secundário?
b. Esquematize uma cunha do xilema e floema.
c. No córtex há células delimitando grandes espaços. O que são essas estruturas?

6. Seção transversal do caule da jaboticaba-do-mato (Myrtaceae) em estrutura secundária, com


dupla coloração (safranina e azul de astra).
a. Identifique os seguintes tecidos: tecido de revestimento, parênquima de preenchimento,
esclerênquima (esclereídes e fibras) e tecidos vasculares. Esquematize uma cunha da
seção observada e não se esqueça de colocar legenda.

ANATOMIA DE RAÍZES, CAULES E FOLHAS

1. Seção transversal da raiz de Tradescantia sp. (Commelinaceae), com dupla coloração


(safranina e azul de astra).
a. Identifique os tecidos presentes. Esquematize

2. Seção transversal da raiz de Emilia sp. (Asteraceae), com dupla coloração (safrablau).
a. Localize o córtex e o cilindro vascular (nestes cortes o tecido de revestimento encontra-
se danificado!).
b. Esta raiz se encontra em crescimento primário ou secundário?
c. Identifique os tecidos presentes e compare a anatomia desta raiz com a da
monocotiledônea observada anteriormente.

3. Seção transversal do caule de Bambusa sp. – Poaceae (bambu), com dupla coloração
(safrablau).
a. Identifique todos os tecidos presentes. Esquematize.

4. Seção transversal do caule, em estrutura primária, de Bidens pilosa – Asteraceae (picão), com
dupla coloração (safrablau).
a. Identifique os tecidos presentes. Observe a organização dos feixes vasculares.
Esquematize.

5. Seção transversal do caule de Cupressaceae (pinheirinho, cipreste), com dupla coloração


(safranina e azul de astra).
a. Identifique os tecidos presentes. O caule encontra-se em crescimento primário ou
secundário? Esquematize.

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6. Seção transversal de folha de Saccharum officinarum - Poaceae (cana-de-açúcar) com dupla


coloração (safranina e azul de astra).
a. Identifique os tecidos presentes no mesofilo. Atente para a distribuição de xilema e
floema e para a estrutura Kranz. Esquematize.

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