Este documento resume una investigación que evaluó la fermentación sumergida para producir la enzima α-amilasa usando la cepa Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor de 3 L. Se determinaron los fenómenos de transporte como el coeficiente de transferencia de película de 1,71 W/K.m2, coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s, y potencia disipada con aireación de 0,1936 W. Esto permitió un rendimiento de 0,060 kg de enzima por cada 3L de
Este documento resume una investigación que evaluó la fermentación sumergida para producir la enzima α-amilasa usando la cepa Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor de 3 L. Se determinaron los fenómenos de transporte como el coeficiente de transferencia de película de 1,71 W/K.m2, coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s, y potencia disipada con aireación de 0,1936 W. Esto permitió un rendimiento de 0,060 kg de enzima por cada 3L de
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Este documento resume una investigación que evaluó la fermentación sumergida para producir la enzima α-amilasa usando la cepa Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor de 3 L. Se determinaron los fenómenos de transporte como el coeficiente de transferencia de película de 1,71 W/K.m2, coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s, y potencia disipada con aireación de 0,1936 W. Esto permitió un rendimiento de 0,060 kg de enzima por cada 3L de
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SUMERGIDA PARA OBTENER ENZIMA α-AMILASA BACTERIANA
Lena Prieto Contreras1*, Renata Grebechova 2 y Luz Mary Figueroa3
1,2,3 Universidad de La Salle. Bogotá, Colombia. Dirección: Calle 10 # 2 – 70 Tel. 3535360, Ext. 2553 1* lprieto@lasalle.edu.co
RESUMEN
En esta investigación se evaluó la fermentación sumergida para obtener enzima α-
amilasa con la cepa de Bacillus subtilis ATCC 21556 en un biorreactor New Brunswick modelo BioFlo 110, con 3 L de medio de cultivo que contenía lactosa como sustrato y con adición permanente de 1 L/min de oxígeno. En estas condiciones, se hallaron los fenómenos de transporte desarrollados, así: coeficiente de transferencia de película entre la pared del biorreactor y el medio de 1,71 W/K.m2 para un calor generado de 0,2413 W; coeficiente de transferencia de masa de 4,24 x 10-4 m/s; y una potencia disipada con aireación de 0,1936 W; para un rendimiento de 0,060 kg de enzima/3L de medio de cultivo.
Palabras claves: Bacillus subtilis, enzima α-amilasa, fenómenos de transporte
I. INTRODUCCIÓN potencia, calor transferido y oxígeno
disipado en la operación durante el Los fenómenos de transporte definen proceso de producción y aislamiento de la los comportamientos de una fermentación enzima α-amilasa con B. subtilis ATCC sumergida para proponer nuevos 21556. Además, se obtendrá volúmenes de producción a nivel conocimiento sobre los principios de industrial. Entre los criterios de ingeniería de la fermentación sumergida producción utilizados con mayor éxito que compone el proceso de Biotecnología están: potencia por unidad de volumen, para su aplicación a nivel industrial tiempo de mezcla, coeficiente volumétrico (Scragg 2000), y será un aporte en este de transferencia de masa y velocidad de campo importante hoy en día en la la punta del impulsor. Por ello, la industria de los alimentos. aplicación de estos criterios requiere un profundo conocimiento del proceso y la Es así como, se destacan algunos forma de obtención del producto. estudios sobre el efecto de la utilización de la enzima α-amilasa en la industria de Por consiguiente, el objetivo de esta alimentos y su efecto sobre los investigación fue: determinar el carbohidratos, en la Universidad de comportamiento de la fermentación desde Buenos Aires (Pilosof y Barthlomai 2002); los fenómenos de transporte: consumo de también se investiga el efecto de involucrar esta enzima en alimentos con concluyeron que la cepa ATCC 21556 sorgo, en Venezuela (Plata et al. 2004); y produce significativamente más cantidad obtención de dextrinas a partir de de enzima que la cepa La Salle. arracacha mediante el empleo de α- Grebechova y Prieto (2003b) evaluaron la amilasa, en la Universidad Católica de actividad amilolítica de la α-amilasa Santa María en Perú (Oporto y Zuzunaga producida por la bacteria B. subtilis ATCC 2002). 21556. Grebechova y Prieto (2004) optimizaron los parámetros para Además de lo anterior, se han fermentación sumergida a pequeña realizado investigaciones sobre escala (250 mL de medio de cultivo) fermentaciones para la obtención de empleando B. subtilis ATCC 21556. enzimas con destino a diferentes procesos industriales, como: optimización Por último, se destaca mostrar con los de la producción de α-amilasa que se fenómenos de transporte de la utiliza en la industria textil para el fermentación sumergida para obtener ablandamiento de tejidos, utilizando un enzima α-amilasa, las características subproducto de la industria láctea como reológicas del medio de cultivo, la es el suero ácido de queso y la harina de velocidad de agitación, el flujo de aire amaranto como aporte fundamental de para evaluar los números de potencia y factores de crecimiento del de Reynolds, el calor requerido para microorganismo (Ferreyra et al. 2005); y favorecer el clima de crecimiento de los en la industria alimentaria, se ha microorganismos que producen los investigado sobre la adición de α-amilasa productos de interés, la diferencia de y gluten vital en diferentes tipos de harina temperatura entre el biorreactor y el trigo para la elaboración de pan de molde medio ambiente, el área disponible para (Acosta et al. 2004). transferencia de calor, las cantidades de oxígeno que permiten el crecimiento de En Colombia, se investigó la los microorganismos a través del producción de la α-amilasa con células metabolismo que desarrollan, la oxidación libres y con células inmovilizadas de de la fuente de carbono y su Thermus sp. (Poutou et al. 1996). Por otra transformación en productos que parte, se está investigando la producción establecen una demanda de oxígeno que y caracterización de α-amilasa obtenida es esencial satisfacer a través de la de cepas nativas de Bacillus sp., por aireación durante la realización de la ejemplo, una cepa nativa se aisló de una fermentación en el biorreactor. mina aurífera (Montoya y López 2001, Vanegas et al. 2001). En la Universidad II. MATERIALES Y MÉTODOS. De La Salle, se tiene la línea de Investigación en Biotecnología de Se partió con los resultados del mejor Enzimas, y se han realizado varias medio líquido experimental (E-1) de la investigaciones sobre la producción de investigación de “Biotecnología de las enzimas obtenidas a partir de enzimas microbianas pectinasa y amilasa” microorganismos (pectinasa y amilasa). (Grebechova y Prieto 2004), que Grebechova y Prieto (2003a) evaluaron contiene: lactosa 6%, extracto de dos cepas (ATCC 21556 y La Salle) de B. levadura 1%, extracto de maní 1% y sales subtilis para la obtención de α-amilasa y 1,252%; y se realizó la fermentación sumergida con la cepa B. subtilis ATCC Brunswick BioFlo 110, como diámetro del 21556 en un biorreactor New Brunswick vaso, diámetro del agitador y área de la modelo BioFlo 110, con volúmenes de 3 L chaqueta de calentamiento. por triplicado, a las condiciones estudiadas de: temperatura 37 oC, pH 6,0 2.1 Potencia de agitación. - 6,5 y agitación entre 170 a 200 rpm (Grebechova y Prieto 2004). Para la cuantificación, se determinaron características principales del biorreactor Inicialmente se pesaron los como: diámetro, tipo de impulsor, número componentes del medio líquido y se de impulsores, distancia entre impulsores, preparó 3 L de volumen. Después, se número de paleta por impulsor, diámetro alistó el inóculo con 300 mL del medio de del impulsor, longitud del eje de rotación, cultivo líquido y la cepa de B. subtilis número de deflectores y ancho de los ATCC 21556 en estado de esporulación, deflectores. es decir, a las 24 horas de su incubación a 37 oC. Se inoculó el medio de cultivo en Además, se cuantificó el volúmen del el biorreactor para comenzar la medio líquido y la altura del mismo en el fermentación durante 72 horas. A las biorreactor. fermentaciones realizadas se halló las cantidades de: sustrato, biomasa, 2.2 Transferencia de calor. producto, nutrientes, y energía empleada, para calcular los balances de materia y de Para evaluar esta parte, se hallaron: el energía durante la multiplicación área de transferencia de calor disponible bacteriana. por la camisa del biorreactor, el calor generado por el cultivo, el oxígeno Con los cálculos balances de materia y consumido, el calor generado por la de energía, se determinaron los agitación del medio, el calor entregado al fenómenos de transporte que medio por la dispersión del aire, el comprenden: la potencia durante la diámetro de la manguera que lleva el aire, agitación, los coeficientes de el flujo de aire, la densidad del aire y el transferencia de masa o de oxígeno que calor total generado en el biorreactor. se utilizó, y de transferencia de calor que actuó en la fermentación sumergida. 2.3 Transferencia de masa.
Para hallar estos valores, se hallaron Para este componente de los
los valores de viscosidades del medio de fenómenos de transporte, se hallaron cultivo (viscosímetro de caída de una durante el desarrollo de la fermentación esfera de acero inoxidable marca sumergida: el caudal de aire para definir Gilmont k esfera líquido t caida ), la velocidad superficial del gas, el diámetro de las burbujas de aire, el área densidades (picnómetro), caudales de de la superficie de separación gas-líquido oxígeno (1 L/min se empleó y se leyó por unidad de volumen de dispersión, el constantemente en el rotámetro del coeficiente de transferencia de masa y el biorreactor), velocidades de agitación, y coeficiente volumétrico de transferencia temperaturas cada 8 h durante la de masa. fermentación; y por último, se midió las características físicas del biorreactor New III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN gaseado fue de 0,1936 W con un número de aireación de 0,029, para la agitación La fermentación sumergida para la del biorreactor a 180 rpm. obtención de la enzima α-amilasa a partir del crecimiento de la bacteria B. subtilis ATCC 21556 en el medio líquido E-1, 3.2 Transferencia de calor. produjo 0,060 kg de enzima/3 L de medio de cultivo; este rendimiento se estableció La fermentación sumergida recibió por medio de balance de materia. La calor por medio de la camisa que fermentación se desarrolló en un envuelve al biorreactor, la cual se calienta biorreactor New Brunswick BioFlo 110, el eléctricamente, sus medidas son: 0,62 m cual cuenta con 2 impulsores y 6 paletas de largo y 0,18 m de ancho. El área de en cada impulsor, estos se encuentran transferencia de calor fue de 0,09 m2, separados 13 cm; además, tiene 4 calculada con el diámetro del biorreactor y deflectores de 2 cm de ancho cada uno. la altura del medio líquido. El calor Los fenómenos de transporte presentados generado por el cultivo de bacterias fue durante la fermentación se presentan a de -0,021 W, las cuales consumieron continuación. 1,55x10-5 mol/L.s de oxígeno.
3. 1 Potencia de agitación. El calor generado por la agitación del
medio de cultivo fue de 0,1936 W para El biorreactor cuenta con un agitador cada litro por minuto. Otro calor de impulsores de turbina doble: una en la cuantificado fue el entregado al medio por base y otra en la zona media. Este la dispersión del aire de 0,026 W, donde agitador dispersa el calor y el oxígeno en se consideró que el aire ingresa por una el medio líquido, por esto, la velocidad del manguera de 5/16 de pulgada de mismo es importante evaluarla así como diámetro con una velocidad de 0,338 m/s. su consumo de potencia. El caudal de La pérdida de presión de las burbujas de aire fue de 1 L/min y se leyó aire en el biorreactor para la altura del constantemente en el rotámetro del medio (0,164 m) fue de 0,233 lbf/in2. Por biorreactor. Las ecuaciones que se consiguiente, el calor total generado en el emplearon en los cálculos de potencia biorreactor fue de 0,2413 W. Todas las están propuestas en Doran (1998) y condiciones anteriores definieron un Duarte (1995). coeficiente de transferencia de calor de 1,71 kW/m2.K entre el medio y la El volumen del medio fue de 0,0039 superficie interna del biorreactor m3, donde se originó un número de encamisado y, esto mostró que el calor Reynolds de 7170,63 y como este número generado fue suficiente y no se requiere es > 1000, por consiguiente, el factor de área adicional pues el área de potencia fue de 5,7 (Duarte 1995) para el transferencia disponible en la camisa fue impulsor de turbina con 4 deflectores. de 0,09 m2 > 1,76 x 10-5 m2 requeridos. También, se encontró la potencia disipada por el impulsor en el líquido sin gasear 3.3 Transferencia de masa. que fue de 0,101 W pues no se presentaron vórtices durante la agitación; Para los cálculos de la transferencia de y la potencia disipada en el líquido oxígeno en el medio de la fermentación sumergida, se hallaron: la velocidad amilasa, se proponen en el caso de pasar superficial de 7,06x10-4 m/s; la retención a fermentaciones con volúmenes más de gas de 0,0046 con un diámetro de grandes, tanto de planta piloto como burbujas de aire de 3,65x10-3 m; la industriales, donde se busca relacionar separación gas-líquido por unidad de estos fenómenos en los diversos tamaños volumen de dispersión de 7,56 m-1. Todas de producción. Es así como, se establece las características mencionadas que el coeficiente de transferencia de determinaron un coeficiente de calor varíe proporcionalmente al cuadrado transferencia de masa de 4,24x10-4 m/s y del diámetro del biorreactor, y que el un coeficiente volumétrico de coeficiente de transferencia de masa transferencia de masa de 3,65x10-3 s-1. varíe proporcionalmente al cubo del diámetro (Quintero, 1981), por lo cual se Los valores anteriores se establecieron propone las siguientes relaciones, por medio de la aplicación de los diversos respectivamente: modelos matemáticos propuestos por investigadores como: Nagata, McCabe, Smith, Van’t Riet, Nagai, Humphrey, Ackley, Calderbank y Moo-Young (Prieto y Grebechova 2006, Doran 1998, Duarte 1995); los cuales explicaron los Otra relación propuesta por fenómenos de transporte presentados en investigadores, es la potencia disipada una fermentación sumergida de 3 L de por unidad de volumen proporcional al volumen de medio de cultivo líquido, y volumen del fermentador (Duarte, 1995), que satisfacieron los requerimientos del para el caudal de 1 L/min de aire en la microorganismo B. subtilis ATCC 21556 fermentación estudiada se encontró una para pasar a través de la biosíntesis del relación de potencia-volúmen 0,0645, sustrato de lactosa a la enzima α-amilasa puesto que se espera que a mayor como producto principal. volumen de la fermentación la potencia de trabajo del agitador disminuye (Quintero, Finalmente, se recomiendan los 1981); por lo tanto, la otra relación siguientes factores geométricos del propuesta es: biorreactor empleado: diámetro del impulsor/diámetro del biorreactor=1/3; ancho de deflectores/diámetro del biorreactor=1/9; altura entre la base y el primer impulsor/altura entre impulsores=1; y número de deflectores=4; para revisar los cambios que se presenten en fermentaciones sumergidas de volúmenes Los coeficientes de transferencia de mayores de producción. calor en fermentaciones se recomiendan entre 3 y 5 kW/m2.K, y en la investigación IV. CONCLUSIONES se determinó un coeficiente de transferencia de calor de 1,71 kW/m2.K, Los fenómenos de transporte valor cercano al límite inferior (Quintero evaluados en la fermentación sumergida 1981, Scragg 2000). Entonces, es estudiada para producir enzima α- conveniente para nuevos volúmenes evaluar estos parámetros propuestos de los fenómenos de transporte y así α-amilasa y pectinasa producidas por establecer más criterios para cambiar a bacterias del género Bacillus y por nuevas escalas de producción (Mukesh, hongos del género Aspergillus para 2002). aplicación en procesos alimentarios. Revista de Investigación de la V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Universidad De La Salle Bogotá, suplemento, 3, 45 – 58. Acosta et al. (2004). Efectos de la variedad de trigo, α-amilasa y gluten Grebechova, R. y Prieto, L. (2004). vital para el proceso de panificación en Biotecnología de las enzimas la molinera de México, Celaya, Gto. microbianas pectinasa y amilasa. 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