DETECCIÓN DE LA CITOQUINA INTERLEUQUINA-6 A PARTIR DE UN

DISPOSITIVO DE FIBRA ÓPTICA MODIFICADO.

Trabajo de investigación personal para la asignatura de Biología Celular.

24 de Noviembre de 2017.
RESUMEN

Las citoquinas son proteínas encargadas de la comunicación intercelular, entre este grupo de proteínas se

encuentra la interleucina-6, la cual es una molécula pleiotrópica con acciones proinflamatorias y

antiinflamatorias. En este artículo se presenta la importancia, propiedades y el efecto de la proteína de la

interleucina-6 en diferentes enfermedades, se presenta un método para la detección de esta citoquina a partir de

un dispositivo de fibra óptica modificado con nanopartículas de oro, dicha fibra es diseñada para ser introducida

dentro de un catéter intratecal con agujeros micrométricos lo cuales son perforados para permitir un intercambio

de fluido entre el interior y el exterior del catéter.

Palabras clave: Detección de citoquina, interleuquina-6, nanopartícula, fibra óptica.

INTRODUCCIÓN las principales funciones de la interleuquina-6 se

Es bien sabida la importancia que para el cuerpo destacan: estimuladora de la producción de la

del ser humano representa el sistema inmunológico mayoría de las proteínas de fase

en su totalidad, es por eso se hace especial énfasis aguda (encargadas de destruir o inhibir el

en las proteínas encargadas de coordinar la crecimiento de microorganismos),regulador

respuesta del sistema inmune ante un agente importante de la termogénesis corporal, promueve

extraño: las citoquinas (específicamente la la diferenciación y maduración de los linfocitos T y

Interleuquina-6). ¿Qué actividades representa la B, estimula la producción de inmunoglobulinas por

interleucina-6 dentro del sistema inmune?¿Porqué parte de las células B,la IL-6 se encuentra también

es constantemente objeto de estudio en muchas involucrada en la patogénesis de enfermedades

investigaciones ?. como, alteración del estado mental y fatiga,

La interleucina-6 representa especial importancia hiperglucemia, resistencia a la insulina, disfunción

dentro del campo de la investigación médica miocárdica, atrofia muscular esquelética, anorexia

debido a que es considerada una citoquina y caquexia del cáncer .

pluripotencial, ya que tiene acciones tanto Las citoquinas son medidas mediante

proinflamatorias como antiinflamatorias. Dentro de inmunoensayos, el más comúnmente usado se

denomina ELISA (prueba dónde se usan complejos

antígeno:anticuerpo para medir la presencia de un
Células precursoras Proliferación de
hematopoyéticas. progenitores de ratón de
analito específico en una muestra).
granulocito/macrofágos.
Estimulación de
En este caso específico se va a presentar la
formulación de colonias
por la IL-3 (en humano y
detección de la citoquina interleuquina-6, basados
ratón).
en el principio usado por la prueba ELISA con
Hepatocitos Inducción de proteínas de
fase aguda. Proliferación
algunas mejoras que consisten en la elaboración de
transitoria in-vitro.
un dispositivo con una fibra de silicona òptica
Linfocitos-T Restauración de células-T
depletadas de células
modificado con nano partìculas de oro usando un accesorias. Estimulación de
respuestas en células T
sistema similar a la presentación de un sandwich.
citotóxicas e inducción del
receptor para la IL-2 y
producción de la misma
para proliferar.
INTERLEUQUINA-6
Timocitos Proliferación en la
La interleucina-6 es una citocina con una masa presencia de lecitinas,
sinergismo con la IL-1 e
molecular aproximada de 26 kDa, es secretada por IL-4. Diferenciación de
precursores de células T
los macrofágos, células T, células endoteliales y citotóxicas.
fibroplastos, es considerada como una de las Otras Inducción de fiebre,
diferenciación e inhibición
citoquinas más pleiotrópica (ejerce una amplia de la proliferación de
carcinoma y células
variedad de respuestas biológicas) .Por lo tanto, es leucémicas, inducción de
genes del MHC clase I en
una de las más importantes moléculas en integrar fibroblastos, actividad
semejante al factor de
respuestas fisiológicas en situaciones tales como la crecimiento de nervios,
estimulación de la
defensa del organismo en la infección. proliferación de células
mieloides dependientes de
factor, elevación de los
estados inflamatorios,
PROPIEDADES DE LA INTERLEUCINA-6 sinergia con la IL-1 para
ofrecer radio protección en
ratones irradiados.
Muestra Blanco Respuestas Biológicas
En estudios realizados a células tumorales se ha
Hibridomas de células Mejora in-vitro su
B. crecimiento. Total evidenciado que las células tratadas con la
dependencia de la IL-6 para
algunas líneas celulares. interleuquina-6 sufren una rápida diferenciación
Linfocitos-B. Incrementa la producción
morfológica acompañada por un incremento en la
de inmunoglobulinas.
actividad fagocitica y en la expresión del ARNm.
Líneas de células B Mejora su crecimiento a
linfoblastoides baja densidad celular.
En tumores sólidos se ha observado que la
inducidas por el virus. Incrementa la secreción de
inmunoglobulinas.
interleuquina-6 actúa como un factor autocrino
(forma de comunicación celular sobre la propia leptina y reduce la adiponectina; en análisis in-vivo

célula) y/o paracrino (forma de comunicación (seres humanos) aumenta la oxidación de grasas en

celular sobre una célula vecina ) para varios todo el cuerpo y produce un aumento de la

tumores humanos incluyendo mieloma múltiple. concentración de ácidos grasos y triglicéridos

La interleuquina-6 también puede ejercer efectos circulantes.

antitumorales ya que la administración de

interleuquina-6 en sistemas animales

experimentales produce un decremento en la

apariencia del tumor .

En el sistema inmune a ciertos niveles actúa como

un mecanismo de defensa pero la inflamación

crónica actúa como un proinflamatorio.Activa y

controla la infiltración de neutrófilos (tipo de

glóbulos blancos encargados de defender el cuerpo

de infecciones bacterianas y micóticas).Bloquea la

Figura 1. Efectos de la interleuquina-6 en la
actividad de las células T (glóbulos blancos que
autorregulación energética. La interleuquina-6
sólo pueden atacar un tipo de virus) y promueve el
producida en el músculo esquelético por la
desarrollo de las células T helper que están
contracción muscular o en el tejido adiposo en una
implicadas en el desarrollo de estados de
situación de obesidad aumenta los niveles
inflamación crónica y de las enfermedades
circulantes de esta citoquina. Tiene efectos
autoinmunes.
sistémicos en el hígado, el WAT (tejido adiposo
En el sistema muscular la interleuquina-6 es la
blanco) y en el músculo esquelético y actúa en el
citoquina presente con mayor concentración y está
páncreas , donde en un primer momento aumenta
relacionada con la oxidación de grasas (cambios
la secreción de insulina, pero si la concentración
metabólicos sufridos por el ejercicio y adaptación a
circulante de interleuquina-6 se mantiene elevada
este).
durante largos períodos acaba produciendo el
La mayoría de la interleuquina-6 derivada del
efecto opuesto. Está implicada en la lipólisis y en
tejido adiposo es producida por fracción de células
la secreción de otras adipoquinonas en el tejido
del estroma vascular.En cultivos de tejido adiposo
adiposo y en la oxidación de ácidos grasos
la interleuquina-6 incrementa la secreción de
mediada por AMPK (proteína quinasa activada), y
en el aumento de captación de glucosa inducida osteoblastos y células sinoviales. Los efectos de la

por insulina en el músculo. Participa en la interleuquina-6 en la remodelación de huesos son

resistencia a la insulina en diferentes complejos y pueden ocurrir en diferentes

tejidos.También puede tener efectos en el cerebro direcciones dependiendo de las condiciones

relacionados con el control de la ingesta y el gasto experimentales. Sin embargo, resultados de

energético. estudios realizados en animales y humanos

soportan un efecto negativo por parte de la

FUNCIÓN DE LA INTERLEUQUINA-6 EN interleuquina-6 en los huesos.

ALGUNAS ENFERMEDADES. Estrés

Asma El incremento de la producción de las citoquinas

La interleuquina-6, una citoquina producida por periféricas y otras señales pro-inflamatorias han

células inflamatorias también es producida por sido vinculadas con trastornos psiquiátricos como

células epiteliales pulmonares en respuesta a trastorno depresivo mayor y trastorno de estrés

variedad de diferentes estímulos incluyendo postraumático. Algunos datos sugieren que los

alérgenos, virus respiratorios y ejercicio. adultos con casos de maltrato durante su infancia

Estudios genéticos soportan que el rol de la exhiben una elevada inflamación como respuesta al

interleuquina-6 en el asma debido a sua naturaleza estrés. La interleuquina-6 es una citoquina

pleiotrópica juega un papel determinante en la fundamental durante la respuesta inflamatoria al

progresiva pérdida de la función pulmonar en estrés. Los mecanismos por los cuales el estrés

pacientes no tratados. inicia una respuesta por parte de la citoquina

Artritis Reumatoide (inflamación exagerada) aún sigue siendo objeto de

La interleuquina-6 juega un papel importante en investigación.

manifestaciones locales y sistemáticas de artritis Cachexia

reumatoide. La interleuquina-6 interactúa de La cachexia está relacionada con la pérdida de

manera compleja con las células envueltas en la masa muscular y tejidos adiposos que en muchos

remodelación de los huesos. casos están asociados con enfermedades como

En la artritis reumatoide la interleuquina-6 puede cáncer, fallas del corazón, HIV, etc.

promover indirectamente osteoclastogénesis La interleuquina-6 se ha convertido en un factor

aumentando la liberación de RANKL (molécula crítico para el mantenimiento de la masa corporal

relacionada con el metabolismo óseo) por durante la enfermedad. Cuando el sistema

musculoesquelético se contrae se convierte en una funcionalizadas con la citoquina interleuquina-6 un

fuente estable de síntesis de interleuquina-6 que se anticuerpo de captura para formar la interfaz de

libera durante el ejercicio; la mayoría de las veces detección. Este dispositivo de captura de citoquinas

estos niveles de interleuquina-6 aumentan de puede ser insertado dentro de un catéter con

manera exponencial. Se establece que bajo niveles agujeros a micro escala a lo largo de su longitud,

crónicos de interleuquina-6 la aceleración de la realizados por un láser.

progresión de la enfermedad se hace más fuerte, en

lugar de regular el cambio de proteínas en el

sistema musculoesquelético.

FIBRA ÓPTICA Y NANOPARTÍCULAS DE

ORO

Las fibras ópticas están diseñadas para el transporte

Figura 2. Catéter Intratecal con agujeros.
y manipulación controlada de la luz, esta
Los agujeros realizados al catéter se realizan con el
manipulación está controlada dentro de un cable,
fin de permitir el intercambio de fluidos entre el
con terminaciones especiales y en placas especiales
interior y el exterior de dicha sonda. El catéter
que hacen que la transmisión sea posible. Una de
puede ser removido en cualquier fase y un nuevo
las partes más importantes del cable son las fibras,
dispositivo de captura puede ser reintroducido para
ya que es el medio por donde se transmite la
una segunda o nueva medida, la diferencia entre el
información. Puede ser de silicio (vidrio) o plástico
diámetro del catéter y la fibra es de 155
muy procesado. Aquí se producen los fenómenos
micrómetros, dando una fricciòn muy baja entre la
físicos de reflexión y refracción, la pureza de este
fibra y el catéter. Este dispositivo es el encargado
material es lo que marca la diferencia para saber si
de transportar los analitos (citoquina IL-6) para
es buena para transmitir o no.
poder ser detectados mediante fluorescencia.
En este estudio se diseña un dispositivo inmuno
Nanotecnología es un término que engloba el
sensible para el monitoreo de la concentración de la
conjunto de ciencias y técnicas que se aplican a
citoquina localizada en la IL-6. Este dispositivo de
escala atómica, molecular y macromolecular, estas
captura de citoquinas se compone de una fibra
partículas han despertado gran interés en los
óptica revestida modificada con una capa de
sectores biomédico y alimentario, donde se ha
nanopartículas de oro las cuales son
descrito su utilización en el tratamiento frente al
cáncer o como parte integrante de envases la salud y el medio ambiente.. Por ello, se impone

resistentes a la abrasión, con propiedades la necesidad de evaluar los riesgos potenciales de

antimicrobianas. Para poner en contexto esta escala las AuNPs y del resto de nuevos nanomateriales a

de medida, un nanómetro es la millonésima parte fin de comprobar su potencial de riesgo, es por ello

de un milímetro, una longitud 80.000 veces más que apenas se encuentra en estudio su utilización

pequeña que el diámetro de un cabello humano y en fibras ópticas para la detección de citoquina IL-

10 veces el diámetro de un átomo de hidrógeno. 6.

Las nanopartículas de metales nobles y, más A continuación se presenta el proceso de

específicamente, las nanopartículas de oro fabricación del dispositivo de captura de citoquinas

(AuNPs), exhiben excelentes propiedades físicas, IL-6.

químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño Fabricación de la interfaz de detección

nanométrico, además, las AuNPs pueden ser
(Fibra óptica):
producidas en distintos tamaños y formas y pueden
Este proceso se llevó a cabo en varias etapas.
ser fácilmente funcionalizadas con un amplio

abanico de ligandos (anticuerpos, polímeros,

sondas de diagnóstico, fármacos, material genético,

etc.). Hoy en día, las nanopartículas de oro

destacan especialmente por sus propiedades

fototerapéuticas. En presencia de luz láser las

Figura 3. Esquema de la preparación de la tira de
AuNPs se activan y desprenden calor, siendo muy
ensayo de citoquinas basada en la fibra óptica.
útiles en el tratamiento selectivo de células
Inicialmente se sumergió la fibra óptica (o el
tumorales, también pueden utilizarse en la
cubreobjetos de vidrio utilizado en las
elaboración de partículas nanoestructuradas para el
caracterizaciones preliminares) en una solución de
transporte y la vectorización selectiva de fármacos
piranha (H2SO4 al 95% y H2O2 al 30% mezclado
y macromoléculas terapéuticas, así como en terapia
a una relación en volumen de 4:1) durante 12 horas
génica (vehiculización de plásmidos, DNA, RNA,
para limpiar el vidrio y Para formar grupos
etc.) En virtud de sus numerosas aplicaciones,
hidroxilo en su superficie. Después de enjuagar con
debemos asumir que la exposición humana a las
H2O desionizada y etanol y secar bajo corriente de
AuNPs aumentará de forma sustancial en los
N2, la fibra óptica/cubreobjetos limpiados se
próximos años, pudiendo tener repercusiones para
sumergió en aminopropiltrietoxisilano (5% v/v) en
tolueno durante 6 h para formar una monocapa interfaz de detección. Con el fin de confirmar la

autoensamblada terminada en amina. Después, la presencia del anticuerpo de captura, la interfaz de

fibra/cubreobjetos se enjuagó con tolueno y etanol detección se incubó con la solución de anticuerpo

para eliminar los monómeros no unidos de la secundario anti-IL-6 (marcada con fluoróforos

superficie. La fibra óptica modificada con verdes) (1: 100) en PBS durante 2 h. A

aminopropiltrietoxisilano se sumergió continuación, la interfaz se lavó tres veces con PBS

posteriormente en una solución de 1 ml de AuNP y H2O desionizada, respectivamente, y finalmente

(10 nm) durante 5 h. Tras la eliminación, la se secó y se formó una imagen por microscopía

fibra/cubreobjetos se lavó abundantemente con confocal.

H2O desionizada y finalmente se secó por soplado
Medición de citoquinas.
con N2. La fibra óptica/cubreobjetos modificada
Después de la modificación de la superficie de
con AuNP así preparados se incubó entonces en
fibra óptica / cubreobjetos con los anticuerpos de
solución de ácido 6-mercaptohexanoico 0,1 mM
captura anti-IL-6, la fibra óptica / cubreobjetos se
durante la noche, y finalmente se lavó tres veces,
incubó en solución de PBS o suero que contenía
en etanol y H2O desionizada, respectivamente.
IL-6 en diferentes concentraciones durante 2 h. A
Para activar el Carboxílico sobre la fibra
continuación, la fibra / cubreobjetos se lavó con un
óptica/cubreobjetos, se incubó la fibra preparada en
tampón de lavado (PBS, Tween-20 al 0,1%) y se
la solución de tampón MES 25 mM (pH 6,0) que
secó mediante corriente de N2. Por último, la fibra
contenía EDC (10 mg ml -1) / NHS (10 mg ml -1)
óptica / cubreobjetos se expuso a las nanopartículas
durante 30 min. A continuación, la
magnéticas de Dragon Green cargadas con
fibra/cubreobjetos se lavó dos veces en el tampón
anticuerpo de detección de IL-6 durante 1 hora
MES. Finalmente, se sumergió la fibra
lavando (con tampón de lavado % Tween-20) y
óptica/cubreobjetos fabricados en la solución de
H2O desionizada antes de las mediciones de
anticuerpo de captura anti-IL-6 (50 μg mL-1) en el
fluorescencia descritas a continuación.
tampón MES (pH = 6,0) a temperatura ambiente
Mediciones de Fluorescencia
durante 3 h y se lavó dos veces con H2O
Los espectros de fluorescencia para el ensayo de
desionizada.
citoquinas basadas en fibra / cubreobjetos se
Posteriormente, la superficie de fibra/cubreobjetos
recogieron a longitudes de onda de excitación de
se bloqueó en una solución de BSA al 0,25%
493 nm para colorante verde (NL493) con el rango
durante 3 h para completar la preparación de la
de emisión de 510-650 nm y 480 nm para Dragon
Green con el rango de emisión de 500-650 nm Evaluación del desempeño del inmunosensor de

Utilizando un sistema Fluorolog Tau3 (JY Horiba, interleuquina-6 en la superficie de vidrio

Edison, NJ) en cubetas de cuarzo de 10 mm a La detección de la citoquina interleuquina-6

temperatura ambiente. Los pasos de banda primero se produjo en un cubreobjetos de vidrio en

espectral fueron de 0,5 nm tanto en excitación lugar de fibra óptica, el cual también fue

como en emisión. El voltaje PMT se ajustó a 950 ensamblado con nanopartículas de oro y fue

V. Las muestras de fibra óptica se formaron modificado con aminopropiltrietoxisilano y con

imágenes utilizando un microscopio confocal SP2 ácido 6-mercaptohexanoico con una posterior

(Leica) con objetivo HC PL FLUOTAR, incubación en el anticuerpo de captura anti

ampliación 10x, NA 0,3, resolución xy 651 nm, interleuquina-6 incluyendo una incubación en el

agujero 1 × disco Airy y campo De la vista 1500 × anticuerpo marcado con partículas fluorescentes.

1500 μm2. La pila z de 10 planos z sobre 125 μm La caracterización de la concentración de las

de altura se recogieron, con la separación de citoquinas se realizó por espectrofotometría de UV-

alrededor de 12,5 μm entre los planos. Las diez Vis, dónde se llegó a la conclusión que este ensayo

imágenes fueron procesadas para calcular el valor puede usarse para cuantificar concentraciones de

máximo de píxel de estos 10 planos. Este valor interleuquina-6 in vitro.

máximo de píxel se asignó entonces como el valor

de píxel en la imagen combinada (proyección Z en

ImageJ). Para cada concentración de IL-6, dos

lugares diferentes fueron imágenes de manera que

3 mm de longitud de fibra en total se tomó

imágenes para cada medición de citoquinas. Se

cuantificó la intensidad de los puntos verdes que

representan las etiquetas fluorescentes de Dragon

Figura 4. Relación entre la intensidad de
Green integrando sobre una ventana espacial de
fluorescencia y la concentración de interleuquina-
450 μm utilizando el software ImageJ y Matlab. De
6. Se puede apreciar que la concentración más
este modo se realizó la resolución espacial de 450
baja detectada fue de 1 pg/ml.
μm.
Rendimiento del sensor fabricado en superficie
RESULTADOS
de fibra óptica.
Con el fin de poder realizar la detección localizada La intensidad de la señal presentada aumentó de

de citoquinas (experimentos realizados in-vivo) el acuerdo aumentaba la concentración de la

dispositivo de detección se realiza sobre una fibra interleuquina-6, como se muestra en la figura 7.

óptica tal como se describió en la sección anterior

(fabricación de la interfaz de detección). La fibra

resultante fue caracterizada por microscopía

confocal.

Figura 7. Cambio en la intensidad de la señal de

fluorescencia con una concentración creciente de

la interleuquina-6.

Figura 5. Imágenes confocales para la

modificación de la fibra óptica. a) fibra óptica CONCLUSIONES

original, b) fibra óptica modificada con El análisis de citoquinas desarrollado con base en

nanopartículas de oro, c) fibra óptica modificada fibra óptica, ofrece sensibilidad aceptable, lo cual

con anticuerpo de captura de la interleuquina-6 podría permitir futuros análisis de concentraciones

después de la incubación con los fluoróforos de de citoquina localizada en vivo.

dragon green ( partículas fosforescentes), d) Este tipo de tecnología proporciona una nueva

superficie de la fibra sin modificación del estrategia de monitorear espacialmente

anticuerpo de captura de la interleuquina-6 y e) la concentraciones de productos secretados por

fibra óptica modificada con anticuerpo de captura células, lo cual puede ser desarrollado como un

de la interleuquina-6 después de la exposición al punto de amplia importancia para múltiples

anticuerpo secundario marcado con colorante condiciones de salud.

verde.

De acuerdo a lo observado en la figura 5 la BIBLIOGRAFÍA

intensidad de la fluorescencia es usada para 1. Albanese A., Sykes E.A., Chan W.C. Rough

realizar la cuantificación de la interleuquina-6. around the edges: The inflammatory response of

microglial cells to spiky nanoparticles. ACS Nano. 7. Mateo, Diego; Morales, Paloma; Ávalos, Alicia;

2010;4(5):2490-2493 Haza, Ana I. Nanopartículas de oro: aplicaciones y

2. James A. Carson and Kristen A. Baltgalvis. citotoxicidad in vitro. 8 de septiembre de 2013

“Interleukin 6 as a Key Regulator of Muscle Mass 8. Publio Giovanni Saavedra Ramírez, Gloria

during Cachexia” Division of Applied Physiology, María Vásquez Duque, Luis Alonso González

Department of Exercise Science, Integrative Naranjo. “Interleucina-6: ¿amiga o enemiga? Bases

Muscle Biology Lab, University of South Carolina, para comprender su utilidad como objetivo

Columbia, SC. (2010) . terapéutico”.Iatreia Revista Médica Universidad de

https://dx.doi.org/10.1097%2FJES.0b013e3181f44f Antioquia.(30 de 2010).

11 9. Guozhen Liu, Kaixin Zhang, Annemarie Nadort,

3. Linda L Carpenter, Cyrena E Gawuga, Audrey R Mark R. Hutchinson, and Ewa M. Goldys.

Tyrka, Janet K Lee, George M Anderson and “Sensitive Cytokine Assay Based on Optical Fiber

Lawrence H Price. “Association between Plasma Allowing Localized and Spatially Resolved

IL-6 Response to Acute Stress Detection of Interleukin‑6”. ACS SENSORS.

and Early-Life Adversity in Healthy Adults”. (Diciembre 20, 2016).DOI:

Neuropsychopharmacology (2010). doi: 10.1021/acssensors.6b00619.

10.1038/npp.2010.159. 10. “Interleuquina-6” Accedido 22 de Noviembre

4. Mercedes Rincon and Charles G. Irvin. “Role of de

IL-6 in Asthma and Other Inflammatory 2017.http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/11

Pulmonary Diseases”. International Journal of 6320/bfv1de1.pdf?sequence=1&isAllowed=y.

Biological Sciences. (2012.10.25). doi:

10.7150/ijbs.4874

5. Benoit Le Goff, Frédéric Blanchard, Jean-Marie

Berthelot, Dominique Heymann, Yves Maugars.

“Role for interleukin-6 in structural joint damage

and systemic bone loss in rheumatoid arthritis”.

Joint Bone Spine Journal. (4 May

2010).https://doi.org/10.1016/j.jbspin.2010.03.002

6. Asis Rodriguez. Fibra óptica, que es y como

funciona. 10 Junio 2012.