PROTOCOLO DE AISLAMIENTO DE BACTERIAS

MARINAS (método propuesto)

Medios de cultivos
Agar Luria Bertani (LB)
TCBS
Mac Conkey
S-S
Caldo peptona

Procedimiento
Las técnicas de aislamiento, purificación y preservación de las cepas de
bacterias fueron empleados según las recomendaciones descritas por
Castañeda et al., 2009.
Paso 1. Recolección de muestras
Las muestras de sedimentos marinos fueron recolectadas con draga
metálica tipo Van Veen a 20 cm de profundidad en playas. La muestra
fue tomada con un hisopo estéril, rotado en el interior del sedimento,
luego inoculado en un tubo previamente estéril con agua peptona da al
10 % como medio de transporte.Todas las muestras fueron conservadas
en refrigeración y transportadas al laboratorio hasta el proceso de
aislamiento.
Paso 2. Aislamiento, purificación y preservación de las cepas
bacterianas.
El aislamiento de las bacterias fue realizada mediante la técnica de
siembra masiva a partir de asadas tomadas del medio de transporte a
medio TSA, posteriormente incubados a 37°C durante 24 horas.
Purificación. Transcurrido el tiempo de incubación las colonias aisladas
fueron trasladas a medios selectivos -S-S (Salmonella-Shigella),-TCBS
(Vibrios), -Mac Conkey (Enterobacterias), Baird- Parker (Cocos gram
positivos) incubadas a 37ºC durante 24horasfinalmente trasladadas a
medio LB (Luria Bertani) para posteriores ensayos.
Preservación. Una colonia bacteriana fue transferida a 50 mL caldo LB
(Luria Bertani), incubadas a 30ºC durante 12 horas a 120 rpm
ajustándose su densidad celular de 0.8 - 1.0 a un O.D de 620 nm.
Transcurrido este período de incubación, 720 µL de cada suspensión fue
transferido a crioviales con 80 µL de glicerol al 10%, los cuales fueron
almacenados a -80ºC. Así mismo, fue implementado como método de
conservación a largo plazo la liofilización, manteniéndose cada cepa a -
20 °C, en el laboratorio.
Paso 3. Identificación microscópica y bioquímica
Para la identificación microscópica fue empleado la tinción de Gram
(bacilos Gram-negativos y cocos Gram positivos), observados en un
microscopio Olympus BX41, de acuerdo con las claves taxonómicas del
Manual de Bergys y Atlas Microbiológico de Koneman, 2008.
Identificación bioquímica
La actividad metabólica de las bacterias fue determinada empleando el
sistema de identificación BBL Crystal™ Kit ID para bacterias Gram
negativas no fermentadoras y Gram positivas, siguiendo las indicaciones
de la casa comercial y Mostafa et al., 2011. Además fueron realizadas la
prueba de Oxidasa, Catalasa, Lactosa y Coagulasa (solo para cocos
gram).

Protocolo y condiciones de conservación de las cepas bacterianas

El diseño y manteamiento de un consorcio de cepas bacterianas
aisladas en ambientes naturales, constituye la base de futuras
investigaciones en las áreas de la salud, toxicología ambiental y
biodiversidad.
1. Conservación en tubo inclinado de agar lb
Una colonia bacteriana con una densidad celular a 0.5 en la escala de
Mc-Farland de las cepas aisladas, fue inoculada en tubos inclinados de
agar LB (Luria Bertani), entre 30 y 37 °C durante 24 horas y luego fueron
conservados a 4 °C.
2. Conservacion en glicerol al 10 %
Una colonia bacteriana de 24 horas de incubación fue inoculada en 20
mL de caldo LB con agitación de 120 rpm durante 12-18 horas, hasta
alcanzar una densidad celular a 0.6-0.8 (620 nm) en la escala de Mc-
Farland. A partir de la suspensión anterior 720 µL fueron transferidos a
tubos eppenderf y se le adiciono 80 µL de glicerol al 10 %, se agito con
vortex por 10 segundos y luego se refrigero a 4°C y posteriormente a -70
°C.
3. Liofilización
Una colonia bacteriana de 24 horas de incubación fue inoculada en 20
mL de caldo LB con agitación de 120 rpm durante 12-18 horas, hasta
alcanzar una densidad celular a 0.6-0.8 (620 nm) en la escala de Mc-
Farland. Posteriormente la suspensión bacteriana es liofilizada al vacío y
conservadas a – 20 °C.