FACULTAD DE

CIENCIA E ING.
EN ALIMENTOS
MODIFICACIÓN GÉNICA DE ENZIMAS PROTEOLÍTICAS
PROVENIENTES DEL TRACTO DIGESTIVO DE GANADO
PORCINO PARA SU EXPRESIÓN EN LA ESPECIE BACILLUS
SUBTILIS Y SU POSTERIOR APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA
DEL CUERO

Chonata Erica

Núñez Monica

Ramos Eliana

Sánchez Ma. Isabel

BIOPROCESOS
FACULTAD DE CIENCIA E ING. EN
ALIMENTOS
 ÍNDICE

OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 2
OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................ 2
JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................................. 2
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................. 3
ESTADO DEL ARTE ......................................................................................................................... 4
MATERIALES Y EQUIPOS ................................................................................................................ 4
Aislamiento e identificación de bacterias productoras de enzimas proteoliticas .................... 4
Extracción de ADN ..................................................................................................................... 5
Secuenciación y amplificación de DNA ..................................................................................... 5
Subclonación y construcción de vectores de expresión. .......................................................... 5
Trasformación y expresión de la bacteria ................................................................................. 6
Cuantificación de ARN ............................................................................................................... 6
Purificación de las enzimas expresadas .................................................................................... 6
Análisis electroforético.............................................................................................................. 6
RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................................ 6
CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 10
Se modifico genéticamente enzimas proteolíticas que se obtuvieron a partir del tracto digestivo de ganado
porcino ubicado en la granja de Cerdos “San Marcos” de la provincia de Tungurahua ; por medio de
técnicas de aislamiento; pudiendose identificar la capacidad de los microorganismos de producir enzimas
proteolíticas por medio de la aparición de un halo transparente alrededor de la zona de crecimiento. ... 10
BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................................. 10
ANEXOS ....................................................................................................................................... 13
Anexo 2: Protocolo de extracción de ADN .............................................................................. 13
Anexo 3 Secuenciación automática ........................................................................................ 14

1
OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL
Modificar genéticamente enzimas proteolíticas provenientes del tracto digestivo de ganado porcino para
su expresión en la especie Bacillus Subtilis y su posterior aplicación en la industria del cuero

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Aislar la secuencia de ADN del gen PRSS1 de Escherichia Coli, utilizando técnicas de PCR,
electroforesis y enzimas de restricción, para su ampliación, verificación y corte.

Potenciar la expresión del gen PRSS1 que codifica enzimas proteolíticas usando técnicas de clonación
para la inserción del gen transformado en el ADN cromosómico del huésped.

JUSTIFICACIÓN
Debido a la gran demanda de enzimas proteolíticas en la industria del cuero en la ciudad de Ambato, se
ha visto la necesidad de incrementar la producción de dichas enzimas, utilizando para ello tanto métodos
físicos como técnicas de Ingeniería Genética en el que se utilizan plásmidos como vectores de clonación
para la inserción de genes de interés relacionados con la expresión de proteínas.

Entre las técnicas de Ingeniería Genética que han permitido el aislamiento, la producción y mejoramiento
de propiedades biológicas y naturales de proteínas específicas provenientes de fuentes naturales tales
como animales, microorganismos o plantas se encuentra la tecnología del ADN recombinante que ha
logrado grandes avances en la modificación de proteínas, mediante la manipulación de genes con el fin
de obtener grandes cantidades de estas biomoléculas. Según Guerrero, (2004), se considera una
proteína recombinante o proteína heteróloga aquella proteína cuya síntesis se realiza en un organismo
distinto al organismo nativo.

Las proteasas producidas por Bacillus han demostrado ser, desde hace años una herramienta
biotecnológica útil, no solo para mejorar la eficacia de los detergentes, sino también han sido utilizadas
ampliamente en otro tipo de industrias, alcanzando y/o superando los métodos tradicionales. La demanda
tan grande de las industrias (detergentes, textil, médica) hace que sea económicamente atractivo el uso
de proteasas con mejor estabilidad que las actuales. (Carmona, 2011)

En Ambato existen alrededor de 25 curtiembres; en las cuales la calidad del cuero procesado es
excelente, ya que la materia prima que se utiliza en la mayoría de las industrias es de fácil acceso.
Cordero, (2015). El alimento de los animales resulta ser un factor importante de los costos de producción
y la presión que se ha ejercido al respecto en función de los continuos incrementos en los precios de las
materias primas, que según Rojas, (1926) resultan ser insuficientes con respecto a la gran demanda en
su aplicación en las técnicas de curtición; de forma tal que se requiere mejorar simultáneamente la
eficiencia de aprovechamiento del alimento por los animales, es así como en conjunto estos factores han
incentivado el desarrollo científico de enzimas para animales.

2
Según Guijarro & Prieto, (2012) mensualmente producir un kilogramo de un cuero de buena calidad en un
proceso que va desde el remojo hasta los cavados cuesta alrededor $2 776, en el que el valor solo de las
enzimas proteolíticas es de $50. Con la manipulación genética de estas enzimas se puede conseguir que
la producción se eleve pues se mejoraría el rendimiento y la calidad notablemente.

El presente proyecto considera de trascendental importancia la manipulación de enzimas proteolíticas

aisladas del colon de ganado porcino con las que se han obtenido rendimientos favorables del 90% Commented [GGCF1]: De
Kunst, (1997) en comparación con los rendimientos actuales de las proteasas extraídas a partir de
Bacillus Subtillis que según Haard, (1992) oscila entre 60-70%, por lo que al lograr la sobreproducción de
estas enzimas traerá beneficios significativos en los procesos de curtición, mediante la inserción de
vectores de clonación con genes codificantes de proteasas de un porcino en una cepa de Bacillus
Subtillis , ya que en la actualidad se obtiene mayor cantidad de enzimas proteolíticas por la producción
estos microorganismos.

INTRODUCCIÓN
La Ingeniería Genética es una parte de la biotecnología que se basa en la manipulación genética de
organismos con un propósito predeterminado, aprovechable por el hombre. La técnica del ADN
recombinante permite aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en
otro diferente. De esta manera hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo, o un virus,
produzcan una proteína que le sea totalmente extraña. Se emplea normalmente para la producción de
proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y
lograr una superproducción (Almeida, 2010).

En la actualidad, las curtiembres deben mantener un mercado interno y hacer proyecciones hacia un
mercado internacional, elaborando el cuero con la calidad requerida y al mismo tiempo preocuparse de
disminuir el gran impacto ambiental que genera el tratamiento de pieles con agentes químicos que
afectan a la calidad y a la relación costo-beneficio. Por su parte, la sobreexpresión recombinante de
proteínas es una herramienta básica de la biotecnología mediante la cual es posible generar grandes
cantidades de proteína nativa o mutante tanto para aplicaciones diagnósticas, farmacéuticas,
determinación de estructura, entre otras (Lewin, 1997). Mediante la manipulación in vitro del DNA es
posible recombinar genes de organismos distintos y conseguir la expresión del gen de interés

Antiguamente, el tratamiento de la piel de ganado en la industria de la curtiembre fue manipulado con

extractos acuosos de desechos biológicos de perros y aves, cuyos componentes activos eran enzimas
extraídas del aparato digestivo, particularmente del páncreas, produciendo una serie de sustancias
activas capaces de degradar las proteínas y lípidos.

Las proteasas son enzimas degradativas que catalizan la hidrólisis total de otras proteínas, ocupan una
posición esencial con respecto a sus funciones fisiológicas, así como sus aplicaciones comerciales.
Realizan funciones degradantes y sintéticas. Dado que son fisiológicamente necesarios para los
organismos vivos, las proteasas se expresan en una amplia diversidad de fuentes tales como plantas,
animales y microorganismos. Con la manipulación genética de estas enzimas se puede conseguir que la
producción se eleve, pues se mejoraría el rendimiento y la calidad notablemente y disminuiría la
contaminación que conlleva estos procesos, ya que no se usaría técnicas de depilado usando químicos,
sino el uso de las enzimas que ayuda a que lípidos que ocupan casi por completo el espacio intercelular
entre los queratinocitos y desempeñan un importante papel como barrera hidrofóbica sean degradados
fácilmente y así evitar que el cuero obtenido tenga rayaduras o presente fallas que hechan a perder el
producto obtenido.

3
El presente proyecto considera de trascendental importancia la manipulación de enzimas proteolíticas
aisladas del colon de ganado porcino, ya que al ser un individuo monogástrico su estructura del aparato
digestivo difiere de los individuos poligástricos en la manera en como metabolizan los productos
alimenticios y la relación simbiótica mutuamente beneficiosa para el individuo y para los microorganismos,
obteniéndose rendimientos favorables del 90%.Los microorganismos como Bacillus Subtillis son una
fuente atractiva de proteasas debido al espacio limitado requerido para su cultivo y su fácil susceptibilidad
a la manipulación genética. Su aplicación en la industria del cuero para la desaireación y el
desprendimiento de pieles para sustituir los productos químicos tóxicos actualmente utilizados es un
desarrollo relativamente nuevo y ha conferido una importancia biotecnológica añadida

ESTADO DEL ARTE

La industria de las enzimas tiene un valor a nivel mundial estimado en $1 billón de dólares, del cual el
75% corresponde a enzimas hidrolíticas; las proteasas representan uno de los tres grupos de enzimas
industriales y ocupan el 60% del mercado (Muhammad, 2007).

Ciertos microorganismos alcalófilos han sido estudiados para ser utilizados en diferentes aplicaciones
industriales, por lo que el género Bacillus ha resultado ser el que prevalece debido a la capacidad de
producir proteasas alcalinas.

Según un estudio realizado en México, (Zambare y col, 2007) obtuvieron de una cepa de Bacillus cereus
una proteasa de uso potencial para la degradación de pelo animal la cual dejaba completamente vacíos
los folículos teniendo una remoción completa del pelo de búfalo en este caso, sin embargo la enzima era
estable solo hasta 35ºC. Este proceso, es menos perjudicial que los métodos tradicionales que emplean
sulfuro de sodio y otros ácidos orgánicos, que contaminan los efluentes de la industria.

En Ecuador, un estudio realizado en la Escuela Superior Politécnica de Chimborazo por (Tayupanda,

2010) afirma que en el proceso de curtiembre se utilizan enzimas proteolíticas sobre residuos de madera
y cloruro de amonio que permiten un aflojamiento y ligera peptización de la estructura del colágeno, así
también limpia la piel de restos de proteínas, pelo y grasa que hayan quedado.

En un trabajo realizado por Fernández, (2007) en la provincia de Santa Elena se aislaron e identificaron
bacterias aerobias halófilas de un ambiente un hipersalino con una concentración de 236 g/L en piscinas
de sal de la industria ECUASAL, del total de bacterias aisladas el 55 % presentaron actividad proteolítica,
dichas especies aisladas fueron pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Aeromonas y
Agrobacterium.

En la provincia de Tungurahua el proceso de curtiembre es un poco más tradicional puesto que el

proceso consiste en el tratamiento del cuero curtido con productos químicos y recurtientes naturales y así
obtener un cuero más resistente al agua y flexible que facilite el teñido dentro de la industria textil.

MATERIALES Y EQUIPOS

Aislamiento e identificación de bacterias productoras de enzimas

proteoliticas
Los contenidos de colon se obtuvieron a partir de cerdos (13 semanas de edad) criados en régimen de
confinamiento granja de Cerdos “San Marcos” de la provincia de Tungurahua. Inmediatamente después

4
de la muerte de los cerdos. El contenido de tracto digestivo se recogió del colon de los cerdos por
procedimientos asépticos y se mantuvieron en bolsas de plástico anaeróbicas y estériles.

Se diluyó una muestra de 10 g con 190 ml de un medio anaerobio de un fluido de glucosa de la panza en
un frasco Erlenmeyer de 250 ml con tapa plástica. La mezcla se agitó vigorosamente por 3 min bajo una
atmósfera de CO2. Las diluciones seriadas fueron realizadas de acuerdo a estos parámetros.

Las diluciones se cultivaron a 37ºC durante 3 días en placas de Petri de 8 cm de diámetro, conteniendo
medio suplementado con gelatina y agar (30 g de peptona bacteriológica, 20 g de agar, 1L de agua
destilada), previamente autoclavado. Tras 24 horas de incubación se revelaron las placas con HCl,
detectando la actividad proteolítica mediante la aparición de un halo transparente alrededor de la zona de
crecimiento.

Características morfológicas y fisiológicas de las colonias aisladas fueron determinadas por

procedimientos estándares.

Extracción de ADN
Con un asa de siembra o punta de pipeta estériles se recogió inóculo de una de las colonias identificadas
con actividad proteolítica y se pasó a 5 ml de medio líquido LB (Anexo 1), se incubó en agitación durante
24 horas a 37ºC. Tras esto, se procedió con el protocolo de extracción de ADN. Para aislar el ADN del
cultivo líquido se utilizó el Gen Elute™ Bacterial Genomic DNA kit de Sigma Aldrich®. El protocolo se
divide se presenta en el anexo 2.

Secuenciación y amplificación de DNA

Se utilizaron primers derivados de la secuencia de ADN del gen PRS11 (Numero de registro del gen en
NCBI: 5644), mismo que codifica para enzimas proteolíticas, para aislar el gen. Los primers se
adquirieron en un kit en Origene, articulo identificado como: PRSS1 (NM_002769) qPCR Template
Standard)

La reacción PCR (100 ml) contenía 500 ng de ADN genómico como molde, 100 Pmole de cada cebador o
primer que delimiten el fragmento a amplificar, 5 U de ADN polimerasa AmpliTaq, Tris - HCl 10 mM, pH
8,3, KCl 50 mM, MgCl 12,5 mM y 200 mM de cada dNTPs (Producto de Promega). La reacción fue
realizada por el sistema GeneAmp PCR 2400. El programa térmico incluyó 1 ciclo a 94ºC (3 min), 30
ciclos a (94 °C por 0,8 min, 54 ° C por 1 min y 72 ° C por 2 min y 1 ciclo a 72 ° C por 10 min.

Para comprobar que la PCR ha funcionado y se ha amplificado el fragmento del tamaño adecuado, se
realiza la separación de los productos de la reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se
cortó la porción de gel que contenía la banda de tamaño esperada y el ADN se eluyó con el kit
GENECLEAN II. En el método de PCR los productos se secuenciaron utilizando secuenciación cíclica
automática Taq Cycle, que es similar a una amplificación normal como se muestra en el anexo 3.

Subclonación y construcción de vectores de expresión.

Los productos de PCR se clonaron en un vector pGEM T-easy vector de Promega de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y transformado con TOP10F9 para seleccionar colonias positivas. Los
fragmentos del gen aislados se insertaron en el plásmido pHT01, (Movitec) en los sitios EcoRI y KpnI,
como se describe por la instrucciones del fabricante. Los constructos se sembraron en placas sobre
medio Czapek-dox que contenía 25 mg caseina / ml. Las colonias positivas se hicieron crecer para
preparar el ADN para la transformación

5
Trasformación y expresión de la bacteria
Bacillus subtillis creció en medio LB y se prepararon para la transformación de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Dos mg de plásmido de ADN se linealizó usando BglII y luego se transformó
en Bacillus por electroporación. Después de incubación durante 3 horas a 30 °C en 1M de sorbitol sin
agitación, las células se sembraron en medio con agar LB caseína para la integración del gen
transformado en el ADN cromosómico del huésped. Después de dos días las células transformadas se
incubaron en un medio mínimo con glicerol. Después que el medio liquido alcanzo una densidad de
aproximadamente 2.5 x 108 cel/ml, las células se centrifugaron (3500g por 5 min), y entonces se
suspendieron en una solución de 0,5 % de metanol para inducir la expresión del gen.

Cuantificación de ARN
Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4 ◦ C. El gen PRSS1 expresado en Bacillus Subtilis, se
suspendieron en Tris 50 mM -HCl, pH 7 con una saturación del 25% de sulfato de amonio. La suspensión
se centrifugó a 25.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se mezcló con sulfato de amonio saturado al
75% bajo agitación durante 12 h, y la mezcla se centrifugó a 25.000 rpm durante 20 min. El sedimento se
suspendió luego en 10 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 7 y se dializó durante la noche contra el mismo tampón.
La columna de DEAE-Sepharose se equilibró con Tris-HCl 25 mM, pH 7. Después de lavar la columna
con 200 ml del mismo tampón, se eluyó la proteasa unida con NaCl 1 M en Tris-HCl 25 mM, pH 7. Se
agruparon fracciones que exhibían las mayores actividades de proteasa ácida y se dializaron contra Tris-
HCl 25 mM, pH 7,5 durante la noche para los siguientes estudios.

Purificación de las enzimas expresadas

Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4 ◦ C. El gen PRSS1 expresado en Bacillus Subtilis, se
suspendieron en Tris 50 mM -HCl, pH 7 con una saturación del 25% de sulfato de amonio. La suspensión
se centrifugó a 25.000 rpm durante 20 min. El sobrenadante se mezcló con sulfato de amonio saturado al
75% bajo agitación durante 12 h, y la mezcla se centrifugó a 25.000 rpm durante 20 min. El sedimento se
suspendió luego en 10 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 7 y se dializó durante la noche contra el mismo tampón.
La columna de DEAE-Sepharose se equilibró con Tris-HCl 25 mM, pH 7. Después de lavar la columna
con 200 ml del mismo tampón, se eluyó la proteasa unida con NaCl 1 M en Tris-HCl 25 mM, pH 7. Se
agruparon fracciones que exhibían las mayores actividades de proteasa ácida y se dializaron contra Tris-
HCl 25 mM, pH 7,5 durante la noche para los siguientes estudios.

Análisis electroforético
La concentración de proteínas se midió por el método de Lowry . Se realizaron electroforesis en gel no
desnaturalizante y SDS-PAGE (15%) como se describe por Laemmli . Las proteínas en SDS-PAGE se
tiñeron con azul brillante Coomassie R-250. La actividad de proteasa ácida en bandas del gel no
desnaturalizante se detectó como anteriormente. Después de la electroforesis, el gel se incubó durante
20 minutos a 25 ° C en 0,2% de naftilfosfato 0,1% de Garnet GBC, 1 mM de CaCl2 y 0,5 M de tampón
Tris-HCl a pH 7,0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Commented [GGCF2]: Resultados y Metodología

modificado no coinciden, se evidencia que se copió el
Aislamiento e identificación del gen productor de enzimas proteoliticas documento de la bibliografía sin que se haya leído el mismo.

En el primer medio suplementado con gelatina se pudo identificar la capacidad de los microorganismos Calificación : 0
de producir enzimas proteolíticas que degradan la gelatina ya que según Torres, (2013) al precipitar con
HCl, las proteínas intactas dan un precipitado opaco y la actividad proteolítica se detecta por la aparición

6
de un halo transparente alrededor de la zona de crecimiento. Como se puede observar en la figura 1
donde se identifican 30 colonias con actividad proteolítica.

P
P2
1

P3

P4

Figura 1 Placa con gelatina como sustrato

Nota: Se codificaron las colonias a ser utilizadas: P1, P2, P3, P4

Identificación del gen PRSS1

Se identificó que el gen responsable de la expresión de las enzimas proteolíticas del tracto digestivo fue
el denominado tripsinógeno catiónico (PRSS1), obteniendo su secuencia en la base de datos de NCBI
con número de acceso 5644

Figura 2 Secuencia gen PRSS1

Extracción y amplificación de DNA

Para la purificación del ADN se escogieron 4 de las 30 colonias que presentaron actividad proteolítica:
P1, P2, P3 y P4 como se observa en la figura 1 con su respectiva ubicación, utilizando el kit Gen Elute™
Bacterial Genomic DNA de Sigma Aldrich® como se presenta en metodología

Con respecto a la amplificación se utilizaron primers derivados de la secuencia de ADN del gen PRS11.
Figura 1 para aislar el gen en la reacción de PCR con un kit de Promega, en esta reacción se colocó el
ADN genómico con actividad proteolítica de cada colonia escogida. Transcurrida la reacción con el fin de
comprobar la eficiencia se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1 % con un kit Gene Clean II
colocando un control positivo (muestras de genes con actividad prtA / protease), un negativo, un
marcador de tamaño molecular y las cuatro muestras aisladas.

7
 339 pb

Figura 4 Gel de agarosa de la electroforesis de los productos de PCR

Nota: Carril 1: Marcador, carrill 2: Control negativo, carriles 3, 4, 5, 6 enzimas con actividad proteolítica: P1, P2, P3, P4, Carril 7: Control positivo

Los resultados obtenidos demuestran que el proceso de extracción y amplificación de ADN se realizó con
éxito los carriles pertenecientes a las enzimas proteolíticas en estudio presentan bandas amplificadas en
la posición correspondiente al peso molecular del gen PRSS1 (339 pb), de la misma manera se verifica
que no hubo contaminación pues en el control negativo no se presenta ninguna banda de ADN.

Subclonación, trasformación y expresión de la bacteria

Para la transformación se utilizaron los genes de interés P1, P2, P3 Y P4 productos de la electroforesis
en gel de agarosa insertándolos en un plásmido pHT01 con un marcador de selección (gen de resistencia
a anficidina), posteriormente se siembra en medio Czapek-dox suplementado con ampicidina, y se
escogen las células transformadas resistentes a dicho antibiótico.
Para la transformación en Bacillus Subtillis se utilizó la técnica de electroporación para que los vectores
con el gen de interés puedan ingresar a las células huésped, posteriormente se sembraron medio con
agar LB caseína para la integración del gen transformado en el ADN cromosómico de B. Subtillis.

Transcurridos dos días de que las células transformadas estuvieron en medio con glicerol, y alcanzaron
una densidad de aproximadamente 2.5 x 108 cel/ml, las células se centrifugaron y se suspendieron en
una solución de 0,5 % de metanol para inducir la expresión del gen.

Cuantificación de ARN.

Se utilizó a los transformantes PRSS1 para extraer el ARN total terminada la inducción. El
autorradiograma expuso la membrana a una pantalla intensificadora de la placa FUJI Imaging de BAS-III
durante 10 horas. Los resultados fueron normalizados por los niveles relativos de 18S rRNA. El que se
utilizó como estándar para permitir la valoración de la cantidad de secuencia blanco con relación a la
secuencia celular y el control de la eficiencia de extracción para cada muestra. Los valores de
expresión son directamente proporcionales a la cantidad absoluta de transcrito.

Purificación de las enzimas expresadas.

El gen PRSS1 expresado en Bacillus Subtilis, permitió agrupar fracciones que exhibían las mayores
actividades de proteasa ácida para dializarlas contra Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 durante la noche. En la

8
Tabla 1 se muestran los valores de actividad enzimática obtenidos para el fraccionamiento subcelular
realizado para purificar parcialmente las proteasas bacterianas. Estos resultados obtenidos muestran que
la fracción en la cual se encuentra mayoritariamente la actividad proteásica corresponde a la fracción
periplásmica (FP), lo que estaría indicando que la proteasa estaría unida a alguna zona de la membrana
de la célula bacteriana (Costa L., at al, 2002).

Análisis electroforético.

En este estudio se determinó que la proteasa purificada tiene un peso molecular de 49,5Kd
aproximadamente, lo que fue determinado por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). La
mayor concentración de la proteína se encuentra en la fracción citoplasmática la cual se midió por el
método de Lowry. (Costa L., at al, 2002).

Tabla N°1 Resultados del fraccionamiento subcelular realizado para purificar parcialmente las proteasas

Fracción Actividad proteolítica ( m Mp-NA/2 Concentración de proteínas ( m g/mL)

h)
Pellet esferoplastos 43,0 ---
Fracción de las membranas, FM 0,0 86,9
Fracción citoplásmática, FC 31,5 375,3
Fracción periplásmica, FP 119,0 244,1

Según un estudio realizado por Zambare y col, 2007 que estudio un organismo del genero de bacillus
para la producción de proteasas para su aplicación en el deshilado de piel de búfalo. Con este
microorganismo se obtuvo un resultado de una producción máxima de proteasa de 176,05 ± 4,24 U/mL.
En este estudio, también se observó que la piel tratada con proteasa facilita la depilación enzimática y no
dañó la capa de colágeno.

Por lo cual el uso de proteasas obtenidas a partir de bacillus subtilis ayudan considerablemente a eliminar
el cabello de la piel. Por el método químico, microscópicamente es visible que el cabello se distorsionó o
se rompió las piezas mientras que el cabello tratado con enzima estaba intacto, con raíz del pelo, vástago
y vaina. En informes previos, la epidermis, el eje del pelo y las ampollas se eliminaron completamente con
una mejor división de fibras por la acción de proteasa (Chandrasekaran y Dhar1985).

Figura N°5 Comparación en el uso de métodos químicos y métodos enzimáticos en la depilación de cueros

9
En la figura 5; En A se observa el depilado químicamente mientras que en la figura B de observa el
depilado enzimáticamente. (1) corte de piel de control tratada sin enzima, en agua del grifo, (2) depilada
enzimáticamente después de 12 h, (3) pelada enzimáticamente deshidratada después de 21h lo que
indica que el aflojamiento del cabello se debió a la acción de la enzima y no debido al hinchamiento o
modificación de la vaina.

CONCLUSIONES

Se modifico genéticamente enzimas proteolíticas que se obtuvieron a partir del tracto digestivo de ganado
porcino ubicado en la granja de Cerdos “San Marcos” de la provincia de Tungurahua ; por medio de
técnicas de aislamiento; pudiendose identificar la capacidad de los microorganismos de producir enzimas
proteolíticas por medio de la aparición de un halo transparente alrededor de la zona de crecimiento.

Se aislo la secuencia de ADN del gen PRSS1 de Escherichia Coli, utilizando técnicas de PCR,
electroforesis en gel de agarosa 1% y por primers derivados de la secuencia de ADN del gen; los cuales
permitieron ampliar la secuencia de ADN e identificar la banda de tamaño esperada que fue de 339 pb.

Se potencio la expresión del gen PRSS1 que codifica enzimas proteolíticas usando técnicas de clonación
para la inserción en un plásmido pHT01 con un marcador de selección, para la transformación en Bacillus
Subtillis se utilizó la técnica de electroporación para que los vectores con el gen de interés puedan
ingresar a las células huésped.

BIBLIOGRAFIA

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12
ANEXOS

Anexo 2: Protocolo de extracción de ADN

1. Se centrifuga 1,5 ml de un cultivo líquido de bacterias dos minutos a 13.000 rpm. Eliminar el
sobrenadante completamente.
2. Añadir 20 μ l de solución RNasa, mezclar e incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
3. Añadir 20 μ l de solución de Proteinasa K a la muestra. Mezclar e incubar 30 minutos a 55ºC.
4. Añadir 200 μl de solución de Lisis C, mezclar con vórtex 15 segundos, incubar a 55 ºC durante
10 minutos.
5. Depositar la columna en un tubo de 2 ml y añadir 500 μ l de la solución de preparación de la
columna. Centrifugar a 11.000 rpm, 1 minuto. Desechar el eluído.
6. Añadir 200 μ l de etanol 95-100% al lisado (paso 4) y mezclar en vórtex durante 5-10 segundos.
Es importante que se mezcle bien.
7. Transferir todo el contenido del tubo del paso anterior a la columna. Centrifugar a 8.000 rpm, 1
minuto. Desechar el tubo conteniendo el eluído y poner la columna en un tubo nuevo de 2 ml.
8. Añadir 500 μ l de Solución de Lavado 1 a la columna y centrifugar 1 minuto a 8.000 rpm. Retirar
y conservar la columna, desechar el eluído del tubo.
9. Añadir 500 μ l de Solución de Lavado 1 a la columna y centrifugar 3 minutos a 13.000 rpm.
Retirar y conservar la columna, desechar el eluído del tubo. Centrifugar de nuevo sin añadir nada
a la columna durante 1 minuto adicional para eliminar cualquier resto de etanol. Desechar el tubo
de 2 ml y poner la columna en un nuevo tubo.
10. Añadir 200 μ l del tampón de elución (Tris HCl 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH 9,0) directamente en el
centro de la columna y dejar incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar a 8.000 rpm
para eluir el ADN
Almacenar a 4ºC para usarlo a corto plazo y a -20ºC para usarlo a largo plazo. El tampón de elución
estabiliza el ADN a estas temperaturas. La congelación y descongelación pueden dañar el ADN.

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Anexo 3 Secuenciación automática

Figura 7 Secuenciación automática

Para la reacción se necesitan la ADN polimerasa termorresistente, el ADN molde (producto de la

amplificación anterior), los 4 dNTPs y el tampón de la polimerasa. Pero en la secuenciación cíclica se
utiliza un único oligonucleótido iniciador, de manera que solo se sintetiza una cadena por reacción.
Además de los dNTPs, en esta reacción se añaden ddNTPs (dideoxirribonucleótidos) marcados con un
fluorocromo diferente cada uno, que cuando son incorporados por la ADN polimerasa interrumpen la
síntesis de ADN. Si los ddNTPs estánmarcados por fluorocromos diferentes se lleva a cabo una única
reacción, si no es así, se llevan a cabo cuatro reacciones separadas. Los fluorocromos permiten
identificar el nucleótido añadido en la última posición. Ajustando las condiciones de la reacción, el
resultado será una mezcla de fragmentos de todos los tamaños posibles que se diferencian en un
nucleótido. Para secuenciar la cadena complementaria se repite el proceso.
Los fragmentos obtenidos se separan en función de su tamaño, generalmente por electroforesis capilar,
al ser sometidos a un campoeléctrico. Los de menor tamaño se desplazan más rápido que los de mayor
tamaño a través de la matriz que rellena el capilar. Al final de éste, los fragmentos van pasando por un
haz de rayos láser que excita el fluorocromo que tiene cada fragmento en el terminador, lo que provoca la
emisión de luz de longitud de onda diferente según el fluorocromo. A medida que los fragmentos van
pasando por el láser en orden de tamaño, un detector capta la señal emitida, que se transforma y procesa
mediante un programa informático, que indica el orden de salida y el terminador que emitió la señal
fluorescente, obteniéndose así la secuencia de nucleótidos. El programa informático genera un
“cromatograma”, donde se muestran los picos correspondientes a los sucesivos fragmentos, utilizando un
código de colores que identifica a los distintos nucleótidos terminales. Por encima de los picos se muestra
la secuencia.

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