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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS


PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA E FISIOLOGIA

TESE DE DOUTORADO

ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE


LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes
corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais

THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO

ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA

RECIFE
2012
TESE DE DOUTORADO

THIAGO HENRIQUE NAPOLEÃO

ATIVIDADE INSETICIDA E MECANISMOS DE AÇÃO DE


LECTINAS DE Myracrodruon urundeuva CONTRA Nasutitermes
corniger, Aedes aegypti E Sitophilus zeamais

ORIENTADORA: Profª Dra. PATRÍCIA MARIA GUEDES PAIVA

RECIFE
2012
Thiago Henrique Napoleão

“Atividade inseticida e mecanismos de ação de lectinas de Myracrodruon


urundeuva contra Nasutitermes corniger, Aedes aegypti e Sitophilus
zeamais”

Tese apresentada para o


cumprimento parcial das exigências
para obtenção do título de Doutor em
Bioquímica e Fisiologia pela
Universidade Federal de Pernambuco.

Aprovado por:
______________________________________________
Profa. Dra. Patrícia Maria Guedes Paiva
Presidenta

______________________________________________
Profa. Dra. Luana Cassandra Breitenbach Barroso Coelho

______________________________________________
Profa. Dra. Maria Tereza dos Santos Correia

______________________________________________
Profa. Dra. Daniela Maria do Amaral Ferraz Navarro

______________________________________________
Prof. Dr. Roberto Araújo Sá

Data: 27 / 06 / 2012
Dedico esta Tese aos meus pais,
aos meus irmãos,
a toda minha família
e a todos os meus amigos,
por serem a minha razão e inspiração.
para seguir sempre em frente.
AGRADECIMENTOS

A Deus, por me presentear com mais esta oportunidade de evolução neste planeta, pela

família a qual me confiou, pelos amigos maravilhosos que recruta para acompanharem minha

jornada, pela inspiração de serenidade nos momentos necessários, pelos caminhos que me são

apresentados, pelas “dificuldades” encontradas, pelos desafios, pelos sonhos realizados, pela

esperança mantida, enfim, por tudo e todas as coisas.

Aos meus pais, Rosângela e Luiz Carlos, pelo amor, carinho, paciência, apoio e

incentivo; por me compreenderem e apoiarem sempre meus objetivos; pelos valores

ensinados; pelo desafio diário e por toda dedicação com que cuidaram e cuidam de mim. Aos

meus irmãos Daniella e Guilherme, pelo amor e convívio; pelos desafios enfrentados juntos;

pelas tantas emoções divididas; pelo companheirisimo e pela presença e apoio sempre; por

compartilharem a imaginação, as invenções e os sonhos; pela paciência e compreensão; por

fazerem a minha vida mais alegre, divertida e preciosa; enfim, por tudo.

A toda minha família pelo amor, incentivo e confiança; à minha avó Irani e meu avô

Alcides, pelos ensinamentos e por todo amor, cuidado, carinho e incentivo transmitidos; à

minha bisavó, Maria de Lourdes (in memorian), pelo exemplo, pelo carinho e por todo o

tempo em que iluminou nossas vidas e que hoje continua iluminando a todos lá de cima; às

minhas tias Anita, Elisabete, Raquel e Sandra e ao meu tio Roberto por sempre acreditarem

em mim e por todo carinho, apoio e incentivo constantes; aos meus primos Ilka, Talys e

Tacianna, pelo carinho e pela convivência harmoniosa e divertida.

À professora Patrícia Paiva, pelos imensuráveis apoio, estímulo, dedicação, exemplo,

amizade e orientação durante toda a Graduação, Mestrado e Doutorado. E pela confiança e

batalha incessante para me ajudar a alcançar meus objetivos.

À minha amiga Nataly, pela amizade inabalável e sincera; por toda consideração e

toda confiança; pela sua imensa alegria que, infalivelmente, contagia e coloca pra cima em
qualquer momento; pela sua garra, energia e força, que são exemplos para todos nós; por ser

uma das mulheres mais admiráveis que conheço; por toda sua participação ao longo desses

anos de trabalho; pelo olhar vibrante e lindo sorriso; pela cumplicidade; por me honrar com

sua amizade e por todo apoio.

Ao meu amigo Francis, pelo companheirismo, pela confiança, e pela amizade; por

toda sua dedicação e competência nos experimentos dessa Tese e ao longo de toda a jornada

acadêmica desde nossa Graduação.

Ao meu amigão Emmanuel, por ser uma luz em minha vida; pela sua compreensão,

gentileza, lealdade e generosidade; pela enorme paciência, por sua sinceridade e honestidade;

por me ajudar a crescer e ser a cada dia uma pessoa melhor; pelo seu ombro e amigo e seu

sorriso com os quais posso sempre contar; por acreditar em minhas idéias e meus sonhos, me

estimular e me ajudar a executá-los; pelo seu apoio inestimável nos experimentos realizados

para essa Tese e em tantos outros mais; enfim, por presentear meu coração com sua amizade.

À minha amiga Lidiane, pelo carinho e pela compreensão tão preciosos; pelo apoio e

pela mão amiga e gentil; pela paciência; pela doce companhia em tantos momentos

importantes; enfim, pela sua amizade tão importante para mim.

À minha amiga Thâmarah, pelo imenso carinho, confiança e incentivo; pelo

entusiasmo de sempre e pela força em momentos difíceis; pela sua imensa dedicação, pela sua

compreensão e por embarcar comigo e a professora Patrícia em nossas aventuras pelo mundo

da Bioquímica.

Às queridas amigas Luciana, Tati, Thamara, Maiara, Kézia e Belany, pelo carinho,

apoio e incentivo, por embelezarem, suavizarem e alegrarem meu dia-a-dia. Ao meu amigo

Afonso, pela amizade extremamente agradável, pelo companheirismo, por sua gentileza e por

todo apoio. Aos amigos e alunos Bernardo e Lívia, por todo apoio e pela confiança e

paciência; por me proporcionarem o exercício e desenvolvimento de importantes etapas. Aos


grandes amigos Edna, Andreza, Paulo Victor, Emmanuela, Taísa, Nathália e Liana pela

amizade que nos uniu, nos une e unirá para sempre.

A todos os amigos que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Glicoproteínas

durante esses sete anos de convivência, em especial: Giselly, Fernando, Michele, Igor,

Priscila, Dalila, Kaleen, Erika, Andréa Sales, Chrisjacele, Idila, Léo, Carlos Bob, Felipe,

Regina, Rodrigo, Adriana, Lucíola, Ana Luiza, Juliene, Cris, Vanessa, Mariana, Andréa

Santos, Raiana, Mary, Cássia, Mychely, Larissa, Amanda, Cynarha, Marília, Mércia, Carina e

Mariana “Reflita!”. Minha gratidão por todo carinho e consideração, sempre.

A todos os demais amigos, de todos os lugares e épocas: Lígia, Inabelle, João, Edson,

Carla, Carol, Paulo, Syllas, Breno, Thiago Buonafina, Artur, Sheila, Meyriene, e todos os

demais.

Às professoras Luana Coelho, Tereza Correia do Departamento de Bioquímica da

UFPE pelo apoio, incentivo, confiança e consideração. À professora Márcia Vanusa, também

do Departamento de Bioquímica, pelo apoio, incentivo e imenso esforço dedicados. Ao

professor Roberto Sá, do Centro Acadêmico do Agreste da UFPE, pela amizade, incentivo e

confiança, por me introduzir na vida científica e por tudo que proporcionou para o meu

crescimento como pessoa e pesquisador. À professora Daniela Navarro, do Departamento de

Química Fundamental da UFPE, pela disponibilidade, simpatia, exemplo e por sempre abrir

com tanta alegria as portas de seu laboratório e de sua sala para nos receber e nos orientar.

Aos demais professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFPE, em

especial Maria Reis, João Virgínio, Neide, Miron, Djalma e professor Ranilson. À professora

Vera Menezes, e novamente à professoa Patrícia, por toda dedicação e esforço na

coordenação do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e Fisiologia da UFPE durante

seus respectivos mandatos.


À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE)

e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio

financeiro para realização dos trabalhos desta Tese

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão de Bolsa de Estudos através do Programa de Fomento à Pós-Graduação (PROF),

durante meu Curso de Doutorado.


“Nenhum caminho é longo demais quando amigos nos acompanham”.

(Autor desconhecido)

“Aprende – humildemente
Ensina – praticando
Administra – educando
Obedece – prestativo
Ama – edificando
Teme – a ti mesmo
Sofre – aproveitando
Fala – construindo
Ouve – sem malícia
Ajuda – elevando
Ampara – levantando
Passa – servindo
Ora – serenamente
Pede – com juízo
Espera – trabalhando
Crê – agindo
Confia – vigiando
Recebe – distribuindo
Atende – com gentileza
Coopera – sem apego
Socorre – melhorando
Examina – salvando
Esclarece – respeitoso
Semeia – sem aflição
Estuda – aperfeiçoando
Caminha – com todos
Avança – auxiliando
Age – no bem geral
Corrige – com bondade
Perdoa – sempre”.

André Luiz (psicografia de Chico Xavier)


RESUMO

Lectinas, proteínas que ligam específica e reversivelmente a carboidratos, isoladas da


entrecasca (MuBL) e do cerne (MuHL) da aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva)
foram agentes inseticidas contra operários e soldados de Nasutitermes corniger (MuHL) e
larvas de Aedes aegypti (MuBL e MuHL). A presente Tese descreve a purificação da lectina
de folha de M. urundeuva (MuLL), a atividade termiticida de MuBL e MuLL sobre N.
corniger, a atividade larvicida de MuLL sobre larvas de A. aegypti no quarto estágio (L4), o
efeito de MuLL sobre o gorgulho do milho (Sitophilus zeamais) e o estudo dos potenciais
mecanismos de ação inseticida. O procedimento de purificação de MuLL incluiu extração de
proteínas das folhas com NaCl 0,15 M, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia
em coluna de quitina. MuLL foi caracterizada quanto ao perfil eletroforético em condições
nativas e desnaturantes, bem como quanto ao efeito de carboidratos, temperatura e pH sobre a
atividade hemaglutinante. Ensaio de determinação da atividade termiticida de MuBL e MuLL
foi realizado em placas de Petri contendo discos de papel de filtro impregnados com
diferentes quantidades de lectina. Quanto aos mecanismos de ação sobre os cupins, foram
investigados a resistência das lectinas à degradação proteolítica e os efeitos das mesmas sobre
bactérias simbiontes do trato intestinal. Para determinação da atividade larvicida contra A.
aegypti, larvas L4 foram incubadas por 24 h em soluções contendo diferentes concentrações
do extrato de folhas ou de MuLL isolada. A resistência de MuLL à proteólise e o efeito da
lectina sobre as atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina e α-amilase) das larvas
foram investigados. Para determinação da atividade inseticida contra S. zeamais adultos o
extrato ou MuLL foram incorporados a discos de farinha de trigo que serviram como dieta
para os insetos durante 7 dias. Os parâmetros avaliados foram sobrevivência, índice de
deterrência alimentar, taxa de consumo relativo, taxa de crescimento relativo, eficiência na
conversão do alimento ingerido e atividades de enzimas digestivas (proteases, tripsina,
celulases, fosfatases e α-amilase). MuLL, uma lectina ligadora de quitina, é um polipeptídeo
catiônico, glicosilado, de massa molecular 14,2 kDa cuja atividade hemaglutinante é inibida
por glicoproteínas e estável ao aquecimento a 100 °C e em ampla faixa de pH. Atividade
termiticida foi detectada para MuBL (CL50 de 0,974 mg/mL sobre operários e 0,787 mg/mL
sobre soldados) e MuLL (CL50 de 0,374 mg/mL sobre operários e 0,432 mg/mL sobre
soldados). As atividades hemaglutinantes de MuBL, MuHL e MuLL foram resistentes a
extratos de intestino de N. corniger contendo atividade de tripsina e as três lectinas
apresentaram ação bacteriostática (concentração mínima inibitória de 62,5 µg/mL para
bactérias de operários e 125 µg/mL para bactérias de soldados). MuBL e MuHL foram
agentes bactericidas mais eficientes sobre simbiontes de operários (concentração mínima
bactericida de 125 µg/mL) do que MuLL (250 µg/mL), enquanto as três lectinas apresentaram
atividade bactericida similar sobre as bactérias do intestino dos soldados (concentração
mínima batericida de 250 µg/mL). O extrato de folhas e MuLL foram larvicidas contra A.
aegypti com CL50 de 10,9 e 0,202 mg/mL, respectivamente. Estes resultados indicam MuLL
como princípio ativo do extrato de folhas. MuLL foi resistente a hidrólise pelas enzimas do
intestino das larvas, inibiu a atividade proteolítica total e de tripsina (Ki: 2,8 µM) e estimulou
a atividade de α-amilase das larvas. O extrato de folhas matou S. zeamais (CL50 de 72,4 mg de
proteínas/g de farinha de trigo) e apresentou efeito deterrente alimentar moderado enquanto
MuLL apenas exerceu forte efeito deterrente (índices de deterrência de 82% a 91% em
concentrações de 45 a 150 mg/g). A toxicidade do extrato e o efeito deterrente de MuLL
resultaram em perda de biomassa pelos insetos, o que foi refletido em valores negativos para
as taxas de crescimento relativo e eficiências de conversão do alimento ingerido. As
atividades de proteases, tripsina, fosfatase ácida e amilase em extratos do intestino de adultos
alimentados com dieta contendo o extrato ou a lectina foram significativamente (p<0,05)
menores que aquelas detectadas em extratos do intestino de insetos do grupo controle. A
ingestão de dieta contendo MuLL resultou também em diminuição das atividades de
endoglucanase e fosfatase alcalina. Em conclusão, os resultados obtidos revelam (1) MuHL,
MuBL e MuLL como potenciais candidatos a inseticidas biodegradáveis para controle de N.
corniger, A. aegypti e S. zeamais; (2) resistência das lectinas ao ambiente proteolítico do
intestino de N. corniger e A. aegypti; (3) modulação de atividades de enzimas digestivas do
intestino de insetos pelas lectinas; (4) atividade antibacteriana de MuHL, MuBL e MuLL
sobre microorganismos intestinais simbiontes de N. corniger; (5) atividade inseticida contra
N. corniger e A. aegypti por ingestão das lectinas e contra S. zeamais por rejeição da dieta
contendo MuLL. A Tese contribui para o “estado da arte” no estudo da atividade inseticida de
lectinas, fornecendo os primeiros dados para a compreensão dos mecanismos envolvidos nos
efeitos deletérios exercidos por estas proteínas sobre N. corniger, A. aegypti e S. zeamais.

Palavras-chaves: Myracrodruon urundeuva; lectina; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti;


Sitophilus zeamais; mecanismo de ação inseticida.
ABSTRACT

Lectins, proteins that bind specifically and reversibly to carbohydrates, isolated from bark
(MuBL) and heartwood (MuLL) of the “aroeira-do-sertão” (Myracrodruon urundeuva) were
insecticidal agents against workers and soldiers of Nasutitermes corniger (MuHL) and Aedes
aegypti larvae (MuBL and MuHL). This Thesis describes the purification of M. urundeuva
leaf lectin (MuLL), the termiticidal activity of MuBL and MuLL against N. corniger, the
larvicidal activity of MuLL on A. aegypti larvae in the fourth stage (L4), the effect of MuLL
on the maize weevil (Sitophilus zeamais), and the study of the potential mechanisms of
insecticidal action. The MuLL isolation procedure included extraction of leaf proteins with
0.15 M NaCl, precipitation with ammonium sulphate and chromatography on chitin column.
MuLL was characterized for electrophoresis profile on native and denaturing conditions, as
well as for the effect of carbohydrates, temperature and pH in hemagglutinating activity.
Assay for determination of termiticidal activity of MuBL and MuLL was performed on Petri
dishs containing filter paper disks impregnated with different amounts of lectin. Regarding
the mechanisms of action on termites, it was investigated the resistance of lectins to
proteolytic degradation and their effects on symbiotic bacteria from intestinal tract. To
determine the larvicidal activity against A. aegypti, L4 larvae were incubated for 24 h in
solutions containing different concentrations of leaf extract or isolated MuLL. The MuLL
resistance to proteolysis and its effect on the activity of digestive enzymes (proteases, trypsin
and α-amylase) of larvae were investigated. For determination of insecticidal activity against
S. zeamais, the extract or MuLL was incorporated to wheat flour disks that served as diet for
the insects during 7 days. The parameters evaluated were survival, feeding-deterrence index,
relative consumption rate, relative growth rate, efficiency in conversion of ingested food, and
activities of digestive enzymes (proteases, trypsin, cellulases, phosphatases and α-amylase).
MuLL, a chitin-binding lectin, is a cationic and glycosylated polypeptide with molecular mass
14.2 kDa, which hemagglutinating activity is inhibited by glycoproteins and stable towards
heating at 100 °C and broad pH range. Termiticidal activity was detected for MuBL (LC50 of
0.974 mg/mL on workers and 0.787 mg/mL on soldiers) and MuLL (LC50 of 0.374 mg/mL on
workers and 0.432 mg/mL on soldiers). The hemagglutinating activities of MuBL, MuHL and
MuLL were resistant to N. corniger gut extracts containing trypsin-like activity and the three
lectins showed bacteriostatic action (minimal inhibitory concentrations of 62.5 µg/mL on
worker’s bacteria and 125 µg/mL on soldier’s bacteria). MuBL and MuHL were bactericide
agents more effective on worker’s symbionts (minimal bactericide concentration of 125
µg/mL) than MuLL (250 µg/mL) while the three lectins showed similar bactericide activity on
bacteria from soldier gut (minimal bactericide concentration of 250 µg/mL). M. urundeuva
leaf extract and MuLL were larvicidal against A. aegypti with LC50 of 10.9 and 0.202 mg/mL,
respectively. These results indicate MuLL as active principle of leaf extract. MuLL was
resistant to hydrolysis by larval gut enzymes, inhibited total protease and trypsin (Ki: 2.8 µM)
activities and stimulated α-amilase activity. Leaf extract killed S. zeamais (LC50 of 72.4 mg of
proteins per g of wheat flour) and showed moderate feeding-deterrent effect while MuLL only
exerted strong deterrent effect (feeding-deterrence indices from 82% to 91% in concentrations
of 45 to 150 mg/g). The extract toxicity and MuLL feeding-deterrent effect resulted in loss of
biomass by insects, which was reflected in the negative values for relative growth rates and
effciencies in conversion of ingested food. The protease, trypsin-like, acid phosphatase and
amylase activities in gut extracts from adults fed on diet containing extract or lectin were
significantly (p<0.05) lower than those detected in gut extract from insects of control group.
The ingestion of diet containing MuLL also resulted in decrease of endoglucanase and
alkaline phosphatase activities. In conclusion, the results obtained reveal (1) MuHL, MuBL
and MuLL as potential candidates to biodegradable insecticides for control of N. corniger, A.
aegypti and S. zeamais; (2) resistance of lectins to the proteolytic environment of N. corniger
and A. aegypti gut; (3) modulation of digestive enzyme activities at insect gut by lectins; (4)
antibacterial activity of MuHL, MuBL and MuLL on gut symbiont microorganisms of N.
corniger; (5) insecticidal activity against N. corniger and A. aegypti by lectin ingestion and
against S. zeamais by rejection of diet containing MuLL. The thesis contributes to the “state-
of-art” in the study of insecticidal activity of lectins, yielding the first data for the
comprehension of the mechanisms involved in the deleterious effects exerted by these
proteins on N. corniger, A. aegypti and S. zeamais.

Keywords: Myracrodruon urundeuva; lectin; Nasutitermes corniger; Aedes aegypti;


Sitophilus zeamais; insecticidal action mechanisms.
LISTA DE FIGURAS

Pág.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por 27


lectinas. (A) Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos
carboidratos da superfície dos eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de
aglutinação por carboidratos livres.

Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do 34


Cerrado que já perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E)
flores.

Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de 35


aroeira.

Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) 37


e MuHL (B). Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de
poliacrilamida em condições nativas para proteínas básicas (1) e em condições
desnaturantes (2).

Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Rainha de Nasutitermes euphratae 41


(A). Operário (B) soldado (C) e ninho construído no solo (D) de Nasutitermes
corniger.

Figura 6. Ensaio termiticida. O disco de papel de filtro (d), de 4 cm de 42


diâmetro, é impregnado com solução da amostra a ser avaliada.

Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio 43


L4.

Figura 8. Sitophilus zeamais. (A) Inseto adulto explorando grão de milho, 47


com destaque para o rostro (1). (B) Inseto adulto, com destaque para o rostro
(1) e as manchas avermelhadas (2) nos élitros. (C) Adultos em infestação de
grãos de milho armazenados. (D) Fêmea ovipositando dentro do grão de
milho (3), larva em desenvolvimento (4) e pupa (5).

ARTIGO 1

Fig. 1. Chromatography of 60-80% precipitate from leaf extract on chitin 75


column. Washing step used 0.15 M NaCl; arrows represent eluents added.
Fractions (2.0 mL) were collected and evaluated for hemagglutinating activity
(HA). Absorbance (ABS) at 280 nm (◊) and log HA (♦) are represented.
Electrophoresis profiles of MuLL (fractions 90 to 166) on PAGE for native
basic proteins (a), and SDS-PAGE stained with Coomassie Brilliant Blue (b).

Fig. 2. Contact effect of MuBL (A and B) and MuLL (C and D) on N. 77


corniger workers (A and C) and soldiers (B and D). Treatments of MuLL
[0.125 (–), 0.25 (○), 0.35 (♦), and 0.5 (∆) mg mL-1] as well as MuBL [0.1 (–),
0.2 (○), 0.4 (♦), 0.6 (■) and 0.8 (∆) mg mL-1] were used; 0.15 M NaCl was the
negative control (□). Each point represents the mean ± SD of five
experiments.

ARTIGO 2

Fig. 1. Mortality of A. aegypti L4 incubated with M. urundeuva leaf extract 84


(A) and MuLL (B). Lethal protein concentration required to kill 50% (LC50)
of larvae in 24 h was determined by probit analysis with a reliability interval
of 95%.

Fig. 2. Effect of MuLL on A. aegypti L4 digestive enzymes. (A) Protease 84


activity from L4 gut extract in presence of MuLL; inset: zymography for
proteases of L4 gut extract (1) and L4 gut extract incubated with lectin (2).
Arrows indicated the polypeptides bands with reduced intensity of the lytic
zone after incubation of L4 gut extract with MuLL. The 100 % activity of L4
gut protease corresponded to absorbance of 1.019 ± 0.036. (B) Trypsin-like
activity from gut extract towards 8 mM BApNA in presence of MuLL. The
100 % activity of L4 gut trypsin corresponded to absorbance of 0.235 ± 0.014.
(C) Effect of MuLL on α-amylase activity from L4 gut extract.
ARTIGO 3

Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. 117
zeamais adults by determination of feeding-deterrence indices. The insects
were reared on artificial diet consisting on wheat flour disks containing leaf
extract at 10 to 150 mg of protein per g of wheat flour (A) and MuLL at 3 to
150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the mean ± SD of
four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences
between treatments.

Fig. 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets 118


consisting in wheat flour disks (control) or M. urundeuva leaf extract (10 to
150 mg of protein per g of wheat flour). (A) The relative consumption rate
indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg
every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg
gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in
conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food
incorporated by insects as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of
four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences
between treatments.

Fig. 3. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets 119


consisting in wheat flour disks (control) or MuLL (3 to 150 mg per g of wheat
flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food
consumed in mg per insect body weight in mg every day. (B) The relative
growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every day per mg
of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%)
indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass.
Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters
indicate significant (p<0.05) differences between treatments.
LISTA DE TABELAS

Pág.

ARTIGO 1

Table 1. Properties of MuBL, MuHL, and MuLL. 75

Table 2. Trypsin-like activity in gut extracts from N. corniger and 76


hemagglutinating activity of MuBL, MuHL and MuLL after incubation with
termite gut extracts.

ARTIGO 2

Table 1. Protease and MuLL specific haemagglutinating activity from MuLL 85


and L4 gut extract mixture.

ARTIGO 3

Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets 115
containing M. urundeuva leaf extract or MuLL.

Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults


reared on diets consisting on wheat flour disks containining M. urundeuva leaf 116
extract or MuLL.
LISTA DE ABREVIATURAS

AH: atividade hemaglutinante

BApNA: N-α-benzoil-DL-arginil-ρ-nitroanilida

Bs: Bacillus sphaericus

Bti: Bacillus thuringiensis var. israelensis

CL50 (LC50): concentração letal necessária para matar 50% dos insetos

Con A: concanavalina A (lectina de sementes de Canavalia ensiformis)

DNS: ácido 3,5-dinitrosalicílico (do inglês 3,5-dinitrosalycilic acid)

FDI: índice de deterrência alimentar (do inglês feeding-deterrence index)

MBC: concentração mínima bactericida (do inglês minimal bactericide concentration)

MIC: concentração minima inibitória (do inglês minimal inhibitory concentration)

MuBL: lectina de entrecasca de Myracrodruon urundeuva (do inglês M. urundeuva bark


lectin)

MuHL: lectina de cerne de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva heartwood lectin)

MuLL: lectina de folha de M. urundeuva (do inglês M. urundeuva leaf lectin)

NA: meio Ágar Nutriente (do inglês Nutrient Agar)

NB: meio Caldo Nutriente (do inglês Nutriente Broth)

PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida (do inglês polyacrylamide gel electrophoresis)

ρNP: ρ-nitrofenol

SDS: sulfato sódico de dodecila (do inglês dodecyl sodium sulphate)

Tris: Trishidroximetilaminometano

WGA: aglutinina de gérmen de trigo (do inglês wheat germ agglutinin)


SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 20

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ....................................................................................... 23

2.1. Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas .................................................. 23

2.2. Controle de insetos ......................................................................................................... 24

2.3. Lectinas .......................................................................................................................... 26

2.3.1. Purificação e caracterização de lectinas ................................................................... 28

2.3.2. Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas .............................. 29

2.3.2.1. Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação ............................................... 30

2.4. A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva) ........................................................... 33

2.4.1. Lectinas de M. urundeuva ........................................................................................ 36

2.5. Cupins ............................................................................................................................ 38

2.5.1. O gênero Nasutitermes............................................................................................. 41

2.6. Aedes aegypti.................................................................................................................. 42

2.7. O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais ...................................................................... 46

3. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 50

3.1. GERAL........................................................................................................................... 50

3.2. ESPECÍFICOS ............................................................................................................... 50

3.2.1. Purificação de MuLL e caracterização das lectinas de M. urundeuva ..................... 50

3.2.2. Estudo da atividade inseticida contra N. corniger ................................................... 50

3.2.3. Estudo da atividade larvicida de MuLL contra A. aegypti....................................... 51

3.2.4. Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais ...... 51

4. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 53

5. ARTIGO 1 ............................................................................................................................ 71
Termiticidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva against Nasutitermes

corniger and its mechanisms ................................................................................................. 71

6. ARTIGO 2 ............................................................................................................................ 80

Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and digestive enzymes of Aedes

aegypti larvae ........................................................................................................................ 80

7. ARTIGO 3 ............................................................................................................................ 89

Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil,

Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae) ................................................................... 89

8. CONCLUSÕES .................................................................................................................. 120

9. ANEXO .............................................................................................................................. 122

Insecticide Activity of Lectins and Secondary Metabolites ......................................................... 122


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 20

1. INTRODUÇÃO

Insetos e plantas mantêm complexos mecanismos de interações na natureza que

podem ser benéficos para ambos ou para apenas um deles. Dentre estas interações, estão

polinização, abrigo e alimentação. Ao mesmo tempo, as plantas também estão expostas ao

ataque de fitopatógenos, geralmente microorganismos, que causam doenças por meio de

distúrbios no metabolismo celular (através de enzimas, toxinas e fitorreguladores, por

exemplo) e absorção de nutrientes da célula vegetal para seu próprio crescimento. Ainda,

diversos insetos e outros animais se alimentam das partes não-reprodutivas e reprodutivas das

plantas. A fim de aumentar as chances de sobrevivência e reprodução, as plantas

desenvolveram então um vasto “arsenal” de estratégias de defesa em resposta à pressão de

herbívoros e patógenos (EDWARDS & WRATTEN, 1981; AGRIOS, 1997; DEL-CLARO &

SILINGARDI, 2001).

As estratégias de defesa das plantas contra herbívoros envolvem a participação de

fatores físicos, tais como tricomas e espinhos. Em paralelo, grande parte da evolução das

interações entre insetos e plantas tem ocorrido ao nível químico. A defesa química é

proporcionada por substâncias tóxicas e repelentes produzidas pela planta. As toxinas de

origem vegetal podem ser compostos do metabolismo primário, como algumas proteínas de

defesa, ou do metabolismo secundário, tais como alcalóides, taninos, flavonóides e

aminoácidos não-protéicos, como a canavanina e a cianoalanina (HARBORNE, 1993).

Lectinas, proteínas que se ligam reversivelmente a carboidratos, são amplamente encontradas

em plantas e tem sido descritas como participantes da defesa contra microorganismos e

insetos (PEUMANS & VAN DAMME, 1995; PAIVA et al., 2010, 2011a).

Lectinas encontradas em tecidos vegetais naturalmente resistentes ao ataque de insetos

constituem potenciais candidatos a agentes inseticidas eficazes e biodegradáveis. A aroeira-

do-sertão, Myracrodruon urundeuva, é uma árvore “madeira-de-lei”, resistente ao ataque dos


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 21

principais agentes biodeterioradores, tais como os cupins, insetos que degradam a celulose

com o auxílio de simbiontes (bactérias e protozoários flagelados) presentes no trato digestivo.

Lectinas ligadoras de quitina foram isoladas do cerne (MuHL: M. urundeuva heartwood

lectin) e entrecasca (MuBL: M. urundeuva bark lectin) desta planta (SÁ et al., 2008; SÁ et al.,

2009b). MuHL foi capaz de induzir a mortalidade de operários e soldados de Nasutitermes

corniger, espécie de cupim considerada praga urbana (SÁ et al., 2008). MuHL e MuBL

apresentaram atividade inseticida sobre o quarto estágio larval de Aedes aegypti, mosquito

vetor da dengue (SÁ et al., 2009b).

Diferentes mecanismos de ação têm sido propostos para as lectinas inseticidas.

Geralmente, essas proteínas são resistentes à degradação proteolítica, sendo capazes de

exercer seus efeitos deletérios quando ingeridas pelos insetos. Essa resistência pode ser

considerada como um fator defensivo conservado por algumas plantas (MACEDO et al.,

2007). Uma vez presentes no trato digestivo do inseto, as lectinas podem interagir com

glicoconjugados presentes na superfície da membrana de células epiteliais. Quitina e proteínas

glicosiladas contendo resíduos de N-acetilglicosamina presentes na matriz peritrófica são

alvos para lectinas ligadoras de quitina. Lectinas também podem interferir na atividade de

enzimas e afetar indiretamente os mecanismos regulatórios de algumas enzimas devido à

perturbação da organização da membrana peritrófica e da borda escovada (FITCHES &

GATEHOUSE, 1998; FITCHES et al., 2008; PAIVA et al., 2012). Ainda, as lectinas podem

exercer uma ação deterrente sobre a alimentação dos insetos por um efeito pré-ingestão,

envolvendo sensores gustatórios, ou por um efeito pós-ingestão, ao promoverem intoxicação

(SAUVION et al., 2004; MICHIELS et al., 2010; SPRAWKA & GOŁAWSKA, 2010).

Contudo, o mecanismo de ação de lectinas com atividade termiticida sobre N. corniger e

larvicida sobre A. aegypti ainda precisa ser elucidado.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 22

O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais, é uma praga cosmopolita do milho, sendo

capaz de atacar grãos armazenados, bem como antes da coleta, ainda no campo. Os grãos

atacados apresentam valor nutricional e peso reduzidos, baixa porcentagem de germinação e

valor de mercado consideravelmente reduzido (YUYA et al., 2009; TEFERA et al., 2011).

Não são encontrados na literatura estudos concernentes à atividade inseticida de lectinas sobre

S. zeamais.

Os estudos apresentados nesta Tese descrevem os esforços iniciais na identificação de

possíveis mecanismos de ação de lectinas contra N. corniger e A. aegypti, bem como a

primeira avaliação do efeito de uma lectina sobre adultos de S. zeamais. A primeira

investigação reporta o isolamento de uma nova lectina ligadora de quitina extraída das folhas

de M. urundeuva (MuLL: M. urundeuva leaf lectin), a atividade termiticida de MuBL e MuLL

sobre operários e soldados de N. corniger e possíveis mecanismos da ação termiticida das três

lectinas isoladas da aroeira. O segundo trabalho descreve a atividade larvicida de MuLL sobre

o quarto-estágio larval de A. aegypti e seu efeito sobre a atividade de enzimas digestivas das

larvas. A terceira investigação discorre sobre o efeito do extrato de folhas de M. urundeuva e

de MuLL na sobrevivência e comportamento alimentar de S. zeamais, avaliando as alterações

promovidas em parâmetros nutricionais e na atividade de enzimas digestivas deste inseto.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 23

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. Substâncias naturais envolvidas na defesa das plantas

A evolução do conhecimento dentro da Bioquímica Ecológica tem iluminado os

diversos degraus de complexas interações e adaptações co-evolucionárias que ocorrem entre

plantas, animais e microorganismos. As plantas desenvolveram mecanismos de resposta e

defesa a agressões de predadores e infecções por microrganismos. Dessa forma, elas sempre

conseguiram dominar as paisagens do planeta (HARBORNE, 1993; RICKLEFS, 2003). A

dimensão dos danos causados por fitopatógenos e pestes de insetos depende do hábito e do

tamanho da população do agente causador e da resistência da planta ao tipo de ataque

(KOGAN, 1994).

Adaptações morfológicas relacionadas à defesa das plantas contra herbívoros incluem,

por exemplo, espinhos, acúleos, tricomas, caules rígidos e superfícies foliares mais espessas

ou mais lisas (KENNEDY & BARBOUR, 1992; RAVEN et al., 2004). A defesa química das

plantas ao ataque de microorganismos e herbívoros pode ser mediada por diversas

substâncias, incluindo metabólitos primários (por exemplo, proteínas de defesa) e secundários

(por exemplo, alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos, terpenos e rotenóides). Esses

compostos agem de diferentes maneiras, apresentando efeitos repelente, deterrente alimentar,

deterrente de oviposição, inibidor de crescimento e tóxico (HARBORNE, 1993;

CAVALCANTE et al., 2006).

Proteínas de plantas que podem estar envolvidas em mecanismos de defesa são as

lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomos, os inibidores de proteases e glicohidrolases,

as arcelinas, as quitinases, a canatoxina e formas modificadas de proteínas de reserva. Muitas

das proteínas de reserva acumuladas em sementes e frutos também desempenham função de


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 24

defesa contra patógenos e pragas de invertebrados, além de sua função de armazenamento. As

proteínas de defesa podem ser de natureza constitutiva ou sua expressão pode ser induzida em

reposta ao ataque, sendo relativamente conservadas durante o curso da evolução. A maioria

das plantas produzem ou acumulam proteínas protetoras semelhantes estrutural e

funcionalmente, independentemente de suas diferenças morfológicas (VAN LOON et al.,

1999; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2003).

Os metabólitos secundários parecem não participar diretamente no crescimento e

desenvolvimento das plantas, mas estão associados com a adaptação, transporte de íons

metálicos e estabelecimento de simbioses, atuando também como hormônios, efetores

diferenciais e moléculas de defesa (DEMAIN & FANG, 2000). A síntese de metabólitos

secundários com papel de defesa pode ser induzida por estresse hídrico, variações sazonais de

temperatura e luminosidades, ataque de herbívoros e infecção por patógenos (BRAY et al.

2000; BULBOVAS et al., 2005). Após ingestão por herbívoros, os metabólitos secundários

podem afetar o processo de neurotransmissão, induzir modificações no DNA, complexar com

proteínas e afetar a integridade de membranas, induzindo formação de poros e causando

distúrbios na permeabilidade (WINK, 2003).

A variedade de compostos produzidos pelas plantas envolvidos em mecanismos de

defesa contra herbívoros e patógenos pode ser explorada na busca por produtos naturais que

possam ser utilizados na manutenção da fitossanidade e no controle de insetos (REGNAULT-

ROGER et al., 2004).

2.2. Controle de insetos

Uma substância que seja letal, repelente, deterrente ou inibidora para insetos é

classificada como inseticida (ADDOR, 1994). Os inseticidas são amplamente utilizados para
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 25

controlar populações de espécies-praga que atacam construções e plantações, bem como de

espécies que transmitem agentes etiológicos de doenças que acometem humanos e podem

inclusive levar à morte.

Substâncias inorgânicas sintéticas foram utilizadas em larga escala a partir da Segunda

Guerra Mundial para controlar insetos. Em seguida, vários compostos orgânicos passaram a

ser sintetizados, muitos a partir de produtos que ocorrem naturalmente em algumas plantas

(como os análogos de piretróides). O uso de inseticidas químicos sintéticos, tais como

organofosforados, carbamatos (organofosfatos), organoclorados e piretróides, ainda constitui

a principal estratégia para controlar insetos. Entretanto, o uso contínuo em larga escala desses

produtos tem levado à emergência de populações de insetos resistentes, danos ambientais

persistentes, efeitos deletérios sobre organismos não-alvo, bem como distúrbios graves à

saúde humana, principalmente em trabalhadores de grandes lavouras (PRIMACK &

RODRIGUES, 2001; VIEGAS JÚNIOR, 2003; BARROS et al., 2006; LEITE et al., 2007;

LIU et al., 2011).

Neste cenário, a busca por inseticidas naturais e biodegradáveis representa uma

alternativa ecológica promissora e tem sido estimulada visando identificar novos compostos

que promovam a mortalidade dos insetos resistentes (REGNAULT-ROGER et al., 2004;

BERNARDI et al., 2010). Embora os inseticidas naturais (ou bioinseticidas) muitas vezes não

sejam tão efetivos quanto os inseticidas químicos sintéticos, sua utilização minimiza os riscos

de efeitos deletérios sobre espécies não-alvo e reduz os riscos de danos à saúde humana

(MENEZES, 2005; PAIVA et al., 2011a). Ainda, a ampliação do leque de substâncias

naturais inseticidas aumenta as possibilidades de rotatividade, minimizando a aquisição de

resistência pelos insetos (VIEGAS JÚNIOR, 2003; CAVALCANTE et al., 2006).

Os inseticidas de origem vegetal (fitoinseticidas) têm sido intensivamente estudados

em programas de manejo de pragas. Esses produtos geralmente apresentam baixa persistência


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 26

e ação residual, sendo rapidamente degradados. A utilização de extratos de plantas contendo

diferentes princípios ativos pode dificultar a seleção de insetos resistentes, pois a variedade de

compostos presentes se reflete em vários mecanismos de ação (REGNAULT-ROGER et al.,

2004). O uso direto de extratos é também considerado viável quando aplicados de forma

integrada, associado a outros métodos de controle, e particularmente útil em países em que a

planta em estudo tem ampla utilização popular e/ou é encontrada em abundância (ISMAN,

2006).

A identificação e isolamento dos componentes ativos do extrato são importantes para

que os tratamentos se baseiem na aplicação dos componentes ativos de maior eficiência.

Taninos, óleos essenciais, rotenóides, limonóides, flavonóides, terpenos, esteróis,

fenilpropanóides, quinonas e saponinas apresentam efeito deletério sobre insetos. Atividade

inseticida de lectinas de plantas tem sido descrita contra insetos de diversas ordens, como

Lepidoptera (mariposas e borboletas), Coleoptera (besouros), Diptera (moscas e mosquitos),

Homoptera (cigarras, pulgões e cochonilhas) e Isoptera (cupins), dentre outras (PAIVA et al.,

2011a).

2.3. Lectinas

As lectinas são proteínas ou glicoproteínas que se ligam a carboidratos, sendo

capazes de induzir a aglutinação de células ao interagirem com glicoconjugados presentes na

superfície celular (PAIVA et al., 2010). A detecção de lectinas em uma amostra é feita através

do ensaio de hemaglutinação, em que a lectina se liga aos carboidratos da superfície dos

eritrócitos, promovendo a formação de uma rede entre eles (Figura 1A). O ensaio de inibição

da atividade hemaglutinante (Figura 1B) em presença de carboidratos livres em solução


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 27

(monossacarídeos, dissacarídeos ou glicoproteínas) confirma o caráter lectínico do fenômeno

de aglutinação.

Figura 1. Esquema representando a aglutinação de eritrócitos promovida por lectinas. (A)


Rede de aglutinação formada pela ligação de uma lectina aos carboidratos da superfície dos
eritrócitos. (B) Inibição da formação da rede de aglutinação por carboidratos livres.
Fonte: PAIVA et al. (2011b)

As lectinas estão presentes em todos os reinos da natureza, sendo encontradas em

bactérias (IMBERT et al., 2004), algas (HAN et al., 2010), fungos (KHAN et al., 2007),

liquens (SILVA et al., 2009), invertebrados – esponjas (MOURA et al., 2006), cnidários

(FENTON-NAVARRO et al., 2003), moluscos (KONG et al., 2011), crustáceos (XU et al.,

2010) e insetos (OURTH et al., 2005) – e vertebrados – peixes (TERADA et al., 2007),

répteis (NUNES et al., 2011), aves (HOGENKAMP et al., 2006) e mamíferos (OLA et al.,

2007). Em plantas, as lectinas têm sido detectadas em cascas (NASCIMENTO et al., 2008;

SÁ et al., 2009b; VAZ et al., 2010; ARAÚJO et al., 2012), cerne (SÁ et al., 2008), cladônias

(SANTANA et al., 2009), flores (SANTOS et al., 2009), folhas (COELHO & SILVA, 2000;

COSTA et al., 2010), raízes (SOUZA et al., 2011), rizomas (BAINS et al., 2005; SANTANA

et al., 2012) e sementes (COELHO et al., 2009; SANTOS et al., 2009).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 28

Nas plantas, vários papéis fisiológicos têm sido atribuídos às lectinas, dentre os quais

se destacam a possível ação defensora contra microorganismos patógenos e insetos, a

participação no mecanismo de nodulação em leguminosas, a estocagem e mobilização de

proteínas e carboidratos de reserva e o alongamento da parede celular (KENNEDY et al.,

1995; HIRSCH, 1999; ISIDRO et al., 2001; CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; LIMPENS

& BISSELING, 2003). Além disso, as lectinas têm se mostrado importantes na ativação de

algumas enzimas, como fosfatases (AOYAMA et al., 2001), galactosidades (BRECHTEL et

al., 2001) e manosidases (KESTWAL et al., 2007).

2.3.1. Purificação e caracterização de lectinas

A primeira etapa na purificação de lectinas é a extração de proteínas em solução salina

ou tampão. Caso apresentem atividade hemaglutinante inibida por carboidratos

(monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou glicoproteínas), os extratos são

submetidos ao fracionamento de proteínas utilizando sulfato de amônio (SANTANA et al.,

2012) ou desnaturação pelo calor (SANTANA et al., 2008), por exemplo. Em seguida, as

frações obtidas são submetidas à diálise exaustiva, para eliminar pequenas moléculas, como

carboidratos e sal.

Técnicas cromatográficas purificam as lectinas de acordo com tamanho da molécula

(cromatografia de exclusão molecular), carga (cromatografia de troca iônica) e afinidade

específica de ligação a carboidratos (cromatografia de afinidade). Métodos eletroforéticos são

utilizados para a caracterização estrutural das lectinas, assim como para estabelecer o grau de

pureza das mesmas. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas

revela a natureza de carga líquida da proteína purificada e PAGE sob condições desnaturantes

(na presença de dodecilsulfato de sódio) e redutoras (na presença de β-mercaptoetanol ou


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 29

ditioteitrol, por exemplo) desdobra a proteína em suas subunidades constituintes e revela a

massa molecular das mesmas. Além disso, coloração específica com o reativo de Schiff no gel

de poliacrilamida pode indicar a natureza glicoprotéica da proteína (PAIVA et al., 2011a).

As massas moleculares acuradas podem ser obtidas por espectrometria de massas e a

estrutura primária (seqüência de aminoácidos) definida por espectrometria ou degradação de

Edman, por exemplo. Estudos da composição de estruturas secundárias e de conformação

(estruturas terciária e quaternária) podem ser realizados através de técnicas como dicroísmo

circular e cristalografia de raios X (SHIRAI et al., 2009; ROCHA et al., 2011).

O ensaio de hemaglutinação é um método simples, versátil e de baixo custo que

possibilita caracterizar a lectina quanto à especificidade de ligação a carboidratos, estabilidade

em diferentes valores de pH e após aquecimento a temperaturas elevadas, bem como na

presença de enzimas e outras substâncias que podem alterar a atividade da proteína. Ainda,

devido às diferenças nos tipos de carboidratos presentes na superfície do eritrócito, as lectinas

podem apresentar uma afinidade maior por células de determinado animal (KENNEDY et al.,

1995; PAIVA et al., 2011a).

2.3.2. Atividades biológicas e aplicações biotecnológicas de lectinas

Devido às suas diversas propriedades biológicas, as lectinas apresentam uma vasta

gama de aplicações biotecnológicas, com os mais diversos fins. Atualmente, as lectinas

aparecem como ferramentas de destaque no campo da tecnologia de bioreconhecimento. Na

área conhecida como lectinômica, técnicas de microarrays utilizando lectinas têm sido

desenvolvidas como ferramentas eficientes para decifrar o glicocódigo que reflete o estado

fisiológico da célula (GEMEINER et al., 2009). Com base na elevada capacidade de

reconhecimento de carboidratos, as lectinas se tornaram importantes ferramentas no


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 30

isolamento, em estudos estruturais e no mapeamento de oligossacarídeos e glicoconjugados

(HAYUNGA et al., 1986; MONZO et al., 2007; XIE et al., 2009). Colunas das lectinas

imobilizadas de Canavalia ensiformis (QIU et al., 2007) e de Cratylia mollis (LIMA et al.,

1997) foram eficientes na separação de glicoproteínas de soro humano. Uma proteína de soja

(Glycine max) com ação anti-agregante sobre plaquetas foi isolada utilizando matriz de

afinidade contendo a lectina de C. mollis imobilizada em Sepharose 4B (SILVA et al., 2011).

O reconhecimento entre lectinas e carboidratos permite a utilização das lectinas na

Histologia e Patologia como ferramentas em ensaios citoquímicos para localização de

glicoconjugados e resíduos glicosilados e como ferramentas histoquímicas para análises de

estruturas de tecidos humanos normais e alterados (FRANCESCHINI et al., 2000; PEDINI et

al., 2001; LIMA et al., 2010).

As lectinas apresentam diversas atividades biológicas, como: estimulação da

proliferação de linfócitos (MACIEL et al., 2004), macrófagos (ANDRADE et al., 1999) e

neutrófilos (TIMOSHENKO et al., 1995), estimulação da produção de interferon γ por

linfócitos (MELO et al., 2010), atividade antiinflamatória (MELO et al., 2010), antitumoral

(FANG et al., 2010; NUNES et al., 2012), antifúngica (SÁ et al.; 2009a; SANTANA et al.,

2009; SOUZA et al., 2011) antibacteriana (OLIVEIRA et al., 2008; SÁ et al., 2009a; NUNES

et al., 2011), antiviral (SATO et al., 2011), hipotensiva (WANG et al., 1996), antinociceptiva

(FIGUEIREDO et al., 2009) e inseticida.

2.3.2.1. Lectinas inseticidas e seus mecanismos de ação

Atividade inseticida de lectinas tem sido descrita contra estágios de desenvolvimento e

formas maduras de insetos das Ordens Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Homoptera,

Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera e Neuroptera (PAIVA et al., 2011a).

Os mecanismos pelos quais as lectinas exercem seus efeitos inseticidas são pouco
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 31

conhecidos e tem ganhado interesse nos últimos anos. Lectinas entomotóxicas são geralmente

resistentes à degradação proteolítica no trato digestivo de insetos (OLIVEIRA et al., 2011). A

ligação de lectinas a moléculas glicosiladas do trato intestinal dos insetos pode interferir nas

funções de enzimas digestivas e proteínas assimilatórias, inibindo a digestão e absorção de

nutrientes (COELHO et al., 2007).

Quando ingeridas, as lectinas podem interferir nas atividades enzimáticas por: (1)

ligação à porção glicídica de enzimas glicosiladas; (2) ligação às enzimas através de sítios

diferentes do sítio de ligação ao substrato; (3) ligação ao substrato; (4) ligação tanto à enzima

quanto ao substrato, aumentando a afinidade entre eles (MACEDO et al., 2007). A lectina de

folha de Bauhinia monandra estimulou in vitro a atividade de α-amilase em larvas de

Callosobruchus maculatus (MACEDO et al., 2007). Fitches & Gatehouse (1998) reportaram

que, em curto prazo, a lectina de Galanthus nivalis apresentou efeito estimulatório sobre

tripsina, α-glicosidase e aminopeptidase de larvas de Lacanobia oleracea causando, em longo

prazo, uma diminuição na atividade de α-glicosidase. Larvas da mosca do melão (Bactrocera

cucurbitae) apresentaram redução nas atividades de fosfatases ácidas e alcalinas quando

alimentadas com a lectina de tubérculos de Arisaema helleborifolium, enquanto a atividade de

esterases aumentou consideravelmente (KAUR et al., 2006).

A matriz peritrófica constitui uma membrana encontrada no intestino médio de

insetos, exceto os das ordens Hemiptera e Homoptera (BANDYOPADHYAY et al., 2001;

DAMASCENO-SÁ & SILVA, 2007), que separa o conteúdo do lúmen intestinal das células

epiteliais digestivas. A matriz contém uma rede composta por quitina (polímero de N-

acetilglicosamina) e glicoproteínas, como as peritrofinas (TELLAM et al., 1999). Sua

integridade é importante, pois a matriz peritrófica compartimentaliza os processos digestivos,

bem como atua na proteção contra infecções por microorganismos e danos mecânicos

provocados por partículas alimentares abrasivas (HEGEDUS et al., 2009). Lectinas de plantas
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 32

com afinidade por N-acetilglicosamina e propriedade de ligação à quitina são inseticidas para

muitos insetos por se ligarem à quitina e proteínas glicosiladas da matriz peritrófica,

interferindo nos processos de digestão e absorção de nutrientes (PEUMANS & VAN

DAMME, 1995; ZHU-SALZMAN et al., 1998; ZHU-SALZMAN & SALZMAN, 2001;

CARLINI & GROSSI-DE-SÁ, 2002; MACEDO et al., 2004; MACEDO et al., 2007).

Estudos ultraestruturais mostraram anormalidades na formação da matriz peritrófica de

insetos alimentados com a lectina ligadora de quitina de Triticum vulgaris (WGA), tais como

a hipersecreção de muitas camadas desorganizadas em larvas de Ostrinia nubilalis e

alterações morfológicas nas microvilosidades de larvas de Drosophila (HARPER et al., 1998;

LI et al., 2009; VANDENBORRE et al., 2011). Lectina das sementes de Canavalia

ensiformis (Con A) promoveu redução da permeabilidade da matriz peritrófica, assim como

restrição no movimento de nutrientes e enzimas digestivas através dos poros da membrana

peritrófica (EISEMANN et al., 1994)

Lectinas podem cruzar a barreira epitelial por transcitose e entrar no sistema

circulatório do inseto, interferindo com moléculas de autodefesa presentes na hemolinfa

(FITCHES et al., 2001). Lectinas podem também ser internalizadas em vesículas nas células

epiteliais por endocitose e bloquear a proliferação celular (YU et al., 1999).

No caso de afídeos (Homoptera), que não possuem matriz peritrófica, foi demonstrado

que a lectina de Allium sativum se ligou a resíduos de carboidratos de proteínas receptoras

específicas presentes nas vesículas da membrana em borda escovada, o que pode resultar na

diminuição da permeabilidade (BANDYOPADHYAY et al., 2001). Banerjee et al. (2004)

sugeriram que o alvo da lectina de A. sativum sobre o afídeo da mustarda (Lipaphis erysimi)

não é uma molécula produzida pelo próprio inseto, mas uma chaperonina conhecida como

“simbionina” que é produzida pela bactéria Buchnera aphidicola, um simbionte obrigatório

dos afídeos.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 33

2.4. A aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva)

Myracrodruon urundeuva (Figura 2), descrita por Francisco Allemão & Cysneiro em

1862, é uma anacardiácea que pode ser encontrada desde o México até a Argentina

(BARKLEY, 1968; GARRIDO & POGGIANI, 1979). No Brasil, é conhecida como aroeira,

aroeira-do-sertão, aroeira-preta, aroeira-do-campo, aroeira-verdadeira ou urundeúva, entre

outras denominações. A denominação “aroeira” é uma corruptela de “arara” e “eira”, com

significado de “árvore da arara”. Já o termo urundeúva é de origem tupi-guarani e possui o

significado “não se deteriora na água” (LORENZI, 2000; ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007).

Apesar de ser considerada típica de regiões da Caatinga e do Cerrado formando

agrupamentos densos, é também encontrada em formações muito úmidas e fechadas,

incluindo florestas pluviais com até 2000 mm de precipitação anual. Distribui-se em ampla

faixa do território brasileiro, desde o Maranhão até o Paraná, sendo mais freqüente nos

estados de Minas Gerais, Bahia, São Paulo, Mato Grosso e Goiás (LORENZI, 2000). A

aroeira-do-sertão não é encontrada na Floresta Amazônica (RECORD & HESS apud LEITE,

2002).

Na Caatinga e no Cerrado, os indivíduos alcançam de 5 a 15 m de altura e 15 a 60 cm

de diâmetro, enquanto alguns podem chegar a 30 m de altura e 100 cm de diâmetro em

regiões de florestas tropicais (ORGANIZAÇÃO DAS NAÇÕES UNIDAS PARA

AGRICULTURA E ALIMENTAÇÃO, 1986). A aroeira-do-sertão é encontrada regularmente

em solos ricos e sobrevive a longos períodos de baixa umidade (GARRIDO & POGGIANI,

1979; LEITE, 2002). O tamanho da árvore é diretamente proporcional à disponibilidade de

água (MUÑOZ, 1990).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 34

A aroeira-do-sertão é uma árvore decídua (Figura 2B) com um tronco reto e cilíndrico

(LÓPEZ, 1987). As folhas são compostas imparipinadas (Figura 2C), com 10 a 30 cm de

comprimento, ápice ligeiramente acuminado e borda serreada. As inflorescências consistem

em racemos (Figura 2D), formando cachos nas pontas de ramos sem folhas. As flores (Figura

2E) são unissexuais e hipóginas e apresentam 5 pétalas. As sépalas são persistentes e

permanecem ao redor do fruto, uma drupa esférica com 3 a 4 mm de diâmetro (LEITE, 2002).

A B

C D E

Figura 2. Myracrodruon urundeuva. (A) Aspecto geral; (B) indivíduo do Cerrado que já
perdeu parte de suas folhas; (C) folhas; (D) inflorescência; (E) flores.
A, C e D: retirado de Lorenzi (2000). B e E: ©Fernando Tatagiba.

A floração ocorre geralmente após a queda das folhas, entre os meses de Novembro e

Janeiro, no Brasil. Abelhas da espécie Trigona spinips foram descritas como agentes

polinizadores e as sementes são dispersas pelo vento. O tempo de dormência pode variar entre

as variedades encontradas (M. urundeuva var. urundeuva e M. urundeuva var. candollei), com

a germinação ocorrendo após 4 a 7 dias, ou somente após 2 semanas, dependendo das

condições do local (LEITE, 2002).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 35

A casca é marrom-escura (Figura 3A), apresentando escamas nos indivíduos mais

velhos, sendo mais lisa nos mais jovens (RIZZINI, 1978). A infusão da entrecasca é um dos

remédios mais utilizados na medicina popular contra doenças respiratórias e urinárias

(NAPRALERT, 2001). Extratos aquosos da casca apresentaram também atividades

antiulcerogênica, anticolinérgica (MENEZES et al., 1986), antiinflamatória (RAO et al.,

1986), antidiarréica e analgésica (ALMEIDA-CORTEZ et al., 2007).

A madeira de M. urundeuva (Figuras 3B e 3C) não apresenta listras, é muito densa

(densidade de 1,19 g/cm3) e com elevada resistência mecânica, sendo incluída entre as

madeiras-de-lei. O alburno é bem diferenciado do cerne e pode ser facilmente decomposto. O

cerne de M. urundeuva é uniforme, de coloração vermelho-cereja ou, quando exposto ao ar,

vermelho-amarronzado escuro. A madeira é extremamente resistente à biodeterioração,

mesmo quando caída no solo, sendo uma das mais tradicionalmente escolhidas na indústria de

móveis e construção civil, naval e hidráulica. Também é utilizada na produção de carvão

vegetal (LÓPEZ, 1987; MORAIS et al., 1999; LORENZI, 2000).

A B C
Figura 3. Myracrodruon urundeuva. (A) Casca; (B) madeira; (C) toras de aroeira.
A e B: retirado de Lorenzi (2000). C: ©Porto Seguro Madeiras.

Devido à intensa exploração de suas propriedades, principalmente para confecção de

cercas, estacas e postes, a aroeira-do-sertão se tornou uma das espécies de plantas lenhosas

mais ameaçadas no mundo, figurando na lista de espécies ameaçadas de organizações


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 36

(governamentais ou não) de defesa do meio ambiente. Os principais fatores que ameaçam a

aroeira-do-sertão são a destruição do habitat (principalmente no Cerrado e na Caatinga, que

têm sofrido com a devastação e o uso excessivo e/ou inadequado da terra) e a superexploração

da madeira (LEITE, 2002; OLIVEIRA et al., 2007).

A ameaça de extinção e o interesse mundial em fitoterápicos têm estimulado o

desenvolvimento de estratégias de conservação de plantas medicinais. O grande valor da

aroeira-do-sertão relacionado à produção de fármacos e à sua madeira faz dela uma das

espécies que mais precisam de medidas de conservação. Nesse sentido, estudos visando à

obtenção de informações sobre a biologia, ecologia, manejo e silvicultura da aroeira-do-sertão

que sejam relevantes para sua conservação genética e valorização como um recurso

sustentável têm se tornado cada vez mais necessários (OLIVEIRA et al., 2007).

Resultados obtidos no estudo da possibilidade de desenvolvimento de M. urundeuva

em plantações se mostraram contraditórios e o uso de plantações comerciais da aroeira-do-

sertão não tem sido considerado a principal estratégia de conservação, ainda que existam

possibilidades. Leite (2002) considera que a conservação efetiva de M. urundeuva em

território brasileiro se encontra ameaçada devido à falta de conhecimentos sobre a biologia

reprodutiva da espécie e à ausência de medidas mais eficazes das instituições responsáveis

que visem regulamentar a conservação dessa espécie.

2.4.1. Lectinas de M. urundeuva

Extratos salinos da casca, cerne e alburno de M. urundeuva foram avaliados quanto à

atividade hemaglutinante. Apenas o extrato de alburno não foi capaz de aglutinar eritrócitos

(SÁ et al., 2009c). Sá et al. (2009b) isolaram as lectinas de casca (MuBL) e cerne (MuHL) de

M. urundeuva através de cromatografia de afinidade em coluna de quitina e determinaram


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 37

seus padrões eletroforéticos (Figura 4). As lectinas se apresentaram como proteínas básicas

formadas por subunidades de massas moleculares 14,4 (MuHL) e 14,0 (MuBL) kDa. MuBL e

MuHL também adsorveram em matriz contendo N-acetilglicosamina imobilizado em Agarose

(SÁ et al., 2009b).

Figura 4. Cromatografia em coluna de quitina para isolamento de MuBL (A) e MuHL (B).
Eletroforeses de MuBL (a) e MuHL (b) em gel de poliacrilamida em condições nativas para
proteínas básicas (1) e em condições desnaturantes (2).
Fonte: SÁ et al. (2009b).

MuHL apresentou elevada toxicidade para cupins da espécie N. corniger (com maior

efeito nos soldados), mas não promoveu efeito repelente (SÁ et al., 2008). A atividade

inseticida detectada assinala a possibilidade da participação de MuHL na resistência do cerne

de M. urundeuva à biodeterioração por cupins. Adicionalmente, MuHL foi capaz de inibir o

crescimento de espécies de fungos do gênero Fusarium (SÁ et al., 2009a).

MuBL e MuHL apresentaram potente atividade inseticida sobre o quarto estágio larval

de A. aegypti com CL50 de 0,125 e 0,04 mg/mL, respectivamente (SÁ et al., 2009b), mosquito
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 38

de grande importância na saúde pública por ser o vetor de vírus causadores de doenças como

a dengue, a febre amarela e a febre chikungunya.

2.5. Cupins

Os cupins ou térmitas (Ordem Isoptera) constituem um grande grupo de insetos

eusociais que vivem em colônias compostas por várias castas e indivíduos em diferentes

estágios de desenvolvimento (HOJO et al., 2005). Os cupins vivem em ninhos ou cupinzeiros

e as tarefas relacionadas à reprodução, defesa e limpeza estão divididas entre as castas, que

são diferenciadas morfologicamente (BERTI FILHO, 1993).

A cabeça é livre, de forma e tamanho variáveis. Olhos compostos estão presentes nas

formas aladas e, nos cupins superiores, em lugar dos ocelos, há uma depressão chamada

fontanela, que possui um poro central no qual se abre uma glândula cefálica que secreta um

líquido com função de defesa. O aparelho bucal é mastigador e bem desenvolvido e o tórax

achatado, com o protórax destacado. O órgão auditivo está situado na tíbia anterior. O abdome

é volumoso, séssil e com 10 segmentos. Os dois pares de asas são membranosos e o

desenvolvimento é por paurometabolia (ovo→ninfa→adulto) (GALLO et al., 1988).

Os indivíduos alados (aleluias) são temporários e responsáveis pela reprodução

sexuada da colônia. Os reprodutores voam do ninho no crepúsculo. Após o vôo, caem no

chão, livram-se de suas asas e então realizam a primeira cópula, ao encontrarem um parceiro.

Formado o casal real, eles encontram um local adequado e iniciam a instalação do ninho, que

inicialmente consiste em poucas galerias e uma câmara nupcial, onde a fêmea realiza as

posturas e o casal copula outras vezes. Os novos indivíduos constituirão as demais castas e o

cupinzeiro cresce rapidamente, podendo atingir milhões de indivíduos. A rainha, que quando

completamente desenvolvida pode apresentar uma relação entre o abdome e o resto do corpo
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 39

de 200:1 em algumas espécies, pode viver de 6 a 10 anos, ovipositando até cerca de 50 mil

ovos em toda sua vida (ZANETTI et al., 2002).

As formas ápteras são permanentes e podem ser férteis ou estéreis. Dentre as férteis,

estão o casal real após o vôo e as rainhas e os reis de substituição, que substituem o casal

quando esse morre ou uma colônia é fragmentada. Dentre os indivíduos gerados, encontram-

se algumas ninfas que se desenvolverão em formas aladas, as quais, por sua vez, formarão

novas colônias. As formas estéreis constituem as castas de operários e soldados. Os soldados

defendem a colônia. São cegos e apresentam mandíbulas bem desenvolvidas, que são

utilizadas para defesa e não para mastigação. Os operários são também, normalmente, cegos e

cuidam da prole, forrageiam alimento e constroem o ninho. Por serem fototrópicos negativos,

desenvolvem suas atividades na escuridão (PFDAT, 1985; GALLO et al., 1988; BERTI

FILHO, 1993; ZANETTI et al., 2002).

Os cupins são capazes de se alimentar de materiais ricos em celulose como madeira,

papel, plantas vivas e de matéria orgânica em decomposição. A capacidade de aproveitar a

celulose como fonte energética se deve à presença de uma comunidade simbiótica de

microrganismos encontrada no trato intestinal dos cupins (FRÖHLICH et al., 2007). Essa

microbiota é capaz de hidrolisar a celulose e a hemicelulose, fermentar e despolimerizar

produtos a ácidos graxos de cadeia curta, que são absorvidos pelo hospedeiro, e fixar

nitrogênio, além de estar envolvida no metabolismo de hidrogênio (BRUNE, 1998;

FRÖHLICH et al., 2007; WARNECKE et al., 2007).

A Ordem Isoptera compreende sete famílias: Mastotermitidae, Kalotermitidae,

Termopsidae, Hodotermitidae, Serritermitidae, Rhinotermitidae e Termitidae, que estão

subdivididas em quatorze subfamílias (GRASSÉ, 1986; KAMBHAMPATI & EGGLETON,

2000). Os cupins das seis primeiras famílias são chamados “cupins inferiores”, enquanto que

os cupins da família Termitidae são denominados “cupins superiores”. Essa designação


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 40

refere-se à presença de protozoários flagelados simbiontes que auxiliam na degradação da

celulose no trato digestivo de térmitas inferiores, enquanto nos térmitas superiores, apenas

bactérias simbiontes estão presentes (COSTA-LEONARDO, 2002).

O papel ecológico dos térmitas é dos mais importantes. Juntamente com as formigas,

atuam na reciclagem dos nutrientes acumulados em enorme parte da biomassa nos

ecossistemas tropicais, funcionando como consumidores primários e decompositores.

Também promovem benefícios no solo, aerando, drenando e transportando nutrientes

(VASCONCELLOS et al., 2005). Por outro lado, cerca de 10% das espécies conhecidas de

isópteros estão registradas como pragas. Os cupins estão entre os mais severos agentes

destruidores da madeira (PAES & VITAL, 2000) e também danificam uma variedade de

materiais que variam de telas de papel a materiais não-celulósicos tais como o betume do

asfalto e folhas de metal (BULTMAN et al. apud CHENG et al., 2007).

Os cupins atacam madeiras não-resistentes penetrando no tronco da árvore através de

duas rotas principais: a casca e as raízes. Alguns cupins são capazes de penetrar pelas raízes

das árvores e construir galerias no interior do tronco, destruindo o cerne e deixando as árvores

ocas. Quando mortas, essas madeiras se tornam ainda mais suscetíveis ao ataque. Estimou-se

que os prejuízos causados pela ação de cupins sobre madeiras e outros materiais contendo

celulose excederiam US$ 50 bilhões anuais mundialmente (KORB, 2007).

O controle de cupins tem sido convencionalmente feito com inseticidas

organofosforados e piretróides, que podem ser tóxicos para outros seres vivos e apresentam

considerável risco de contaminação ambiental. Extratos de diversas partes das plantas,

extrativos de madeiras e entrecascas, feromônios, análogos do hormônio juvenil e inibidores

da síntese de quitina são tidos como potenciais componentes de produtos alternativos para

combater espécies-praga de cupins, sem oferecer grande perigo ao meio ambiente (SOGABE

et al., 2000; CABRERA et al., 2001; CHEN et al., 2004).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 41

2.5.1. O gênero Nasutitermes

Os cupins nasutos da subfamília Nasutiterminae (Família Termitidae), a mais

diversificada da ordem Isoptera (KAMBHAMPATI & EGGLETON, 2000), são assim

chamados porque a cabeça dos soldados se estreita na parte anterior, em uma projeção

semelhante a um nariz, que é utilizada para defesa, emitindo substâncias adesivas ou tóxicas

(HOJO et al., 2005).

O gênero Nasutitermes (Figura 5) tem distribuição mundial e é um dos mais ricos em

espécies. O número de indivíduos em um ninho (Figura 5A) pode chegar a 3 milhões e a

longevidade máxima das colônias de Nasutitermes varia de 40 a 80 anos (KAMBHAPATTI

& EGGLETON, 2000). Constroem ninhos no tronco ou no sistema radicular de árvores e

acima ou abaixo do nível do solo (SCHEFFRAHN et al., 2002; ALBUQUERQUE et al.,

2005). Enquanto gênero, os Nasutitermes são morfologicamente bem diferenciados da grande

maioria dos cupins pelo aspecto bem característico da cabeça nos soldados (Figura 5C), mas a

classificação ao nível de espécie não é uma tarefa fácil (CONSTANTINO, 1992; MIURA et

al., 2000; SCHEFFRAHN et al., 2002).

A B C D

Figura 5. Cupins do gênero Nasutitermes. Ninho (A), operário (B) e soldado (C) de
Nasutitermes corniger. (D) Rainha de Nasutitermes euphratae.
Fontes: A: © Reginaldo Constantino. B e C: Thiago H. Napoleão. D: Michele D.C. Silva.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 42

Os Nasutitermes têm sido favorecidos pelo desequilíbrio ambiental, demonstrando

acentuados sinais de nocividade. Por isso, têm sido considerados como uma nova ameaça aos

centros urbanos. Buscam preferencialmente as partes altas das edificações, sendo visíveis em

telhados, forros e vãos estruturais (FIGUEIREDO, 2004). No Semi-Árido brasileiro, os

Nasutitermes têm invadido o meio urbano, atacando móveis e estruturas de construções

(PAES et al., 2002). Colônias de N. corniger também foram encontradas atacando estruturas

de madeira de museus (BRAZOLIN et al., 2004).

Atividade inseticida sobre operários e soldados de N. corniger tem sido descrita para a

lectina do cerne de M. urundeuva (MuHL), bem como para as lectinas isoladas do líquen

Cladonia verticillaris, das raízes secundárias de B. monandra e dos cladódios de Opuntia

fícus indica (SÁ et al., 2008; SILVA et al., 2009; PAIVA et al., 2011c; SOUZA et al., 2011).

Nos testes, os cupins soldados e operários são colocados em contato com discos de papel

impregnados com a solução líquida das lectinas em diferentes concentrações (Figura 6).

Figura 6. Ensaio termiticida. O disco de papel de filtro (d), de 4 cm de diâmetro, é


impregnado com solução da amostra a ser avaliada.
Foto: Thiago H. Napoleão

2.6. Aedes aegypti

O mosquito A. aegypti é originário do norte da África e é uma espécie cosmopolita,

amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais (FORATTINI & BRITO, 2003).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 43

O desenvolvimento do A. aegypti ocorre através dos estágios de ovo, larva (quatro estágios:

L1, L2, L3 e L4), pupa e adulto (Figura 7A). Em condições favoráveis de temperatura,

umidade e disponibilidade de alimento, o período entre o estágio de ovo e a emergência do

adulto varia entre 10 a 13 dias (FORATTINI, 1965).

Figura 7. (A) Ciclo de vida do A. aegypti. (B). Larva de A. aegypti no estágio L4.
Fontes: A: Secretaria de Saúde e Defesa Civil do Estado do Rio de Janeiro. B: Nataly D.L. Santos & Thiago H.
Napoleão.

O corpo da larva é composto de cabeça, tórax e abdômen (Figura 7B). O abdômen das

larvas L4 é dividido em oito segmentos, com brânquias anais presentes no último segmento.

Um sifão ou tubo de sucção ou de ar é utilizado para a respiração. Para respirar, a larva vem

até superfície da água fazendo movimentos em forma de S durante seu deslocamento. As

larvas são sensíveis a movimentos bruscos na água e se movem rapidamente em reposta a

feixes de luz, procurando refúgio no fundo do recipiente. O tamanho do corpo do mosquito é

dependente de fatores genéticos, bem como da alimentação das larvas e da temperatura

durante o período de desenvolvimento (KAMIMURA et al., 2002; ALTO et al., 2008).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 44

Após a fase larvária, surgem as pupas, que não se alimentam. A pupa tem um par de

tubos respiratórios ou trompetas, que atravessam a água e permitem a respiração. Logo após

emergir do estágio pupal, o inseto adulto procura pousar sobre as paredes do recipiente, assim

permanecendo durante várias horas, o que permite o endurecimento do exoesqueleto e das

asas. O macho se distingue essencialmente da fêmea por possuir antenas plumosas e palpos

mais longos (SERVICE, 1996; SANTOS, 2009). O macho alimenta-se de carboidratos

extraídos dos vegetais. As fêmeas se alimentam mais freqüentemente de sangue (repasto

sangüíneo). A maior parte dos animais vertebrados constitui fonte de repasto, mas há uma

grande afinidade pelo homem. O repasto sangüíneo das fêmeas fornece proteínas para o

desenvolvimento dos ovos (SANTOS, 2009).

A. aegypti é o vetor dos vírus causadores da febre amarela e da febre da dengue. A

febre amarela é uma arbovirose caracterizada por hepatite grave, insuficiência renal,

hemorragia e eventos terminais rápidos, com choque e falência de múltiplos órgãos. A

prevenção é feita através da vacina e de medicamentos antivirais, tais como ribavirina,

tiazofurina, carboxamida e pirazolina (MONATH, 2008).

A dengue é uma infecção re-emergente no Brasil causada por quatro sorotipos do

arbovírus DEN (Flavivirus), que se manifesta em diferentes formas clínicas (TAUIL, 2002;

ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2009). A forma clássica é uma doença de baixa

mortalidade, enquanto pacientes com a febre da dengue hemorrágica apresentam

manifestações hemorrágicas, hepatomegalia, insuficiência circulatória e mortalidade elevada

(MELTZER & SCHWARTZ, 2009). A dengue é uma importante questão de saúde pública

nos países tropicais e subtropicais. Fatores socioeconômicos e outras variáveis relacionadas à

organização do espaço urbano estão envolvidos na expansão da doença (BRAGA & VALLE,

2007).
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 45

O controle físico, mais conhecido como controle ambiental ou mecânico consiste na

substituição, drenagem ou redução dos locais de reprodução dos insetos. A participação da

população é fundamental na localização e eliminação dos criadouros, principalmente

intradomiciliares e peridomiciliares, que funcionam como os principais focos para

proliferação desse inseto (CONSOLI & OLIVEIRA, 1994; HEMME et al., 2009). A

exposição à luz solar, com conseqüente aumento na temperatura da água afeta negativamente

o ciclo de vida do inseto e esta estratégia pode ser adotada como uma medida adicional para

controlar a população de mosquitos (HEMME et al., 2009).

Estratégias para o controle biológico de mosquitos utilizam organismos predadores

(peixes e copépodas), patógenos e parasitas naturais. Algumas linhagens de bactérias

entomopatogênicas, do gênero Bacillus, produzem toxinas protéicas com um alto grau de

especificidade a insetos vetores que, quando ingeridas, provocam mortalidade das larvas. As

duas espécies mais utilizadas como larvicidas são o Bacillus sphaericus (Bs) e Bacillus

thuringiensis serovar israelensis (Bti). O Bti é estável sob condições normais de

armazenamento e demonstrou excelente persistência em ensaios que mimetizaram condições

de campo (ARAÚJO et al., 2007).

O controle químico de mosquitos com os inseticidas organofosforados, piretróides e

organofosforados é a principal medida adotada em programas de saúde pública. No entanto, o

uso contínuo desses inseticidas tem selecionado larvas resistentes e efeito genotóxico do

organofosforado temefós tem sido reportado em concentrações normalmente utilizadas no

controle de larvas (AIUB et al., 2002; POUPARDIN et al., 2008; MELO-SANTOS et al.,

2010). Dessa forma, a busca por inseticidas naturais, biodegradáveis e isentos de toxicidade

para organismos não-alvo tem crescido. Extratos vegetais, óleos essenciais, saponinas,

flavonóides, limonóides, rotenóides, terpenos, fenilpropanóides, quinonas e lectinas têm sido

avaliados como alternativas aos inseticidas sintéticos (PAIVA et al., 2011b).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 46

2.7. O gorgulho do milho, Sitophilus zeamais

Os gorgulhos do gênero Sitophilus (Ordem Coleoptera, Família Curculionidae) são

insetos cosmopolitas ao longo das regiões tropicais e infestam alguns dos grãos de maior

importância mundialmente: arroz (Sitophilus oryzae), trigo (Sitophilus granaries) e milho

(Sitophilus zeamais). Os Sitophilus são também capazes de atacar sorgo e alimentos

processados, tais como macarrão e biscoitos (FAZOLIN et al., 2010).

Os insetos adultos da espécie S. zeamais (Figura 8A) apresentam um comprimento

variando de 2,5 a 4 mm e manchas avermelhadas nas asas anteriores, denominadas élitros

(Figura 8B). A cabeça se projeta para frente na forma de um rostro curvado (Figuras 8A e

8B), o qual é mais curto e grosso nos machos e mais longo e fino nas fêmeas. São capazes de

voar, infestando rapidamente as espigas no campo e nos locais de armazenamento. Apesar de

bastante similar à espécie S. oryzae, os gorgulhos do milho diferem pelas manchas

avermelhadas mais claramente definidas e pelo tamanho maior, além de diversos outros

detalhes em características anatômicas externas (ANTUNES & DIONELLO, 2010).

Os adultos utilizam os grãos como alimento (Figura 8C) e as formas imaturas se

desenvolvem dentro dos grãos, os quais funcionam como fonte de nutrientes e abrigo (Figura

8D). As fêmeas abrem orifícios nos grãos com a mandíbula e, em seguida, depositam seus

ovos e selam as perfurações com uma secreção produzida por glândulas associadas ao sistema

ovipositor (Figura 8D). As fêmeas podem viver até 140 dias, 104 destes correspondendo ao

período de oviposição, e o número médio de ovos por fêmea é de 282 (BOTTON et al.,

2005). Após a eclosão dos ovos, as larvas se desenvolvem, passando por quatro estágios, e

alcançando o estágio de pupa (Figura 8D). Apenas uma larva conseguirá se desenvolver por

grão, mesmo que mais de um ovo tenha sido depositado. Após completado o desenvolvimento

do adulto dentro do grão, ele emerge e cresce até atingir a maturidade, reiniciando o ciclo
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 47

biológico (ANTUNES & DIONELLO, 2010). Tendo o milho como hospedeiro, o ciclo

biológico do ovo até a emergência do adulto dura em média 34 dias (BOTTON et al., 2005).

Figura 8. Sitophilus zeamais.


(A) Inseto adulto explorando grão de milho, com destaque para o rostro (1). (B) Inseto
adulto, com destaque para o rostro (1) e as manchas avermelhadas (2) nos élitros. (C) Adultos
em infestação de grãos de milho armazenados. (D) Fêmea ovipositando dentro do grão de
milho (3), larva em desenvolvimento (4) e pupa (5).
Fontes: (A) http://davesgarden.com/guides/bf/showimage/93. (B) http://www.plantwise.org (C) © Via Rural. (D)
http://foodquality.wfp.org

S. zeamais, juntamente com outras pragas de grãos estocados, causam uma perda

estimada de 20 a 30% da produção de milho (TEFERA et al., 2011). As perdas ocasionadas

por S. zeamais no armazenamento de grãos são muitas vezes mais graves do que as que

ocorrem na cultura em campo, pois são definitivas e irrecuperáveis. Miranda et al. (1995)

afirmam que a infestação desta praga pode gerar perdas em até 30% de grãos armazenados em
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 48

fazendas. S. zeamais também tem sido encontrado atacando frutos de macieira, pessegueiro e

videira, geralmente no período próximo à colheita (BOTTON et al., 2005).

Estudos relatam prejuízos provocados pelos inseticidas atualmente utilizados no

controle de S. zeamais a organismos não-alvo e ao homem, além da persistência no ambiente.

Ainda, resistência de S. zeamais a inseticidas como Malation, Lindane, deltametrina e fosfinas

(extremamente voláteis e tóxicas) já foi descrita (PEREZ-MENDOZA, 1999). Embora os

níveis de resistência no Brasil ainda sejam considerados baixos, é esperado um considerável

aumento devido ao uso massivo de inseticidas como o fenithorion (PEREIRA et al., 2009;

BRAGA et al., 2011).

Os inseticidas utilizados podem atuar por contato ou serem aplicados através de

fumigação. Alternativamente e/ou paralalelamente ao uso de inseticidas, o controle de pragas

de grãos armazenados tem sido realizado a partir da limpeza e secagem dos grãos,

manutenção da aeração e regulação da temperatura. Outras estratégias alternativas aos

inseticidas sintéticos para controle de S. zeamais incluem fungos entomopatogênicos, uso de

pó de diferentes folhas e diferentes compostos de origem vegetal (ADANE et al., 1996;

KEHINDE & ANGELA, 2004; ILELEJI et al., 2007; NOOMHORM et al., 2009; UKEH et

al., 2009; YUYA et al., 2009; BETANCUR et al., 2010; NUKENINE et al., 2010;

COITINHO et al., 2011).

Procópio et al. (2003) observaram uma repelência de 96% sobre S. zeamais causada

por pó da folha de Eucalyptus citriodora e mortalidade total provocada pelo pó da folha de

Chenopodium ambrosioides. Mortalidade acima de 70% foi detectada após fumigação de

óleos essenciais de Piper hispidinervum e Piper aduncum, bem como após exposição tópica a

estes mesmo óleos (ESTRELA et al., 2006). Apesar de constituírem inseticidas alternativos

amplamente investigados contra diversos insetos, as proteínas bioativas extraídas de plantas


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 49

(tais como lectinas, inibidores de protease, inibidores de amilase, arcelinas, quitinases, entre

outras) ainda não foram investigadas quanto ao efeito sobre S. zeamais.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 50

3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

• Avaliar a atividade inseticida de lectinas isoladas de M. urundeuva sobre N. corniger,

A. aegypti e S. zeamais e possíveis mecanismos de ação envolvidos.

3.2. ESPECÍFICOS

3.2.1. Purificação e caracterização das lectinas de M. urundeuva

• Purificar a lectina de folha (MuLL) através de fracionamento salino e cromatografia

em coluna de quitina.

• Avaliar o perfil eletroforético de MuLL em eletroforese em gel de poliacrilamida em

condições nativas e desnaturantes.

• Isolar as lectinas de entrecasca (MuBL) e cerne (MuHL) de M. urundeuva seguindo

procedimentos previamente estabelecidas.

• Caracterizar MuLL, MuBL e MuHL quanto à inibição da atividade hemaglutinante

(AH) por monossacarídeos e glicoproteínas, especificidade de ligação a eritrócitos

(coelho e humanos), efeito do aquecimento e pH sobre a AH e conteúdo de

carboidratos.

• Avaliar a interação de MuLL com matriz de N-acetilglicosamina imobilizado em

agarose.

3.2.2. Estudo da atividade inseticida das lectinas de M. urundeuva contra N. corniger

• Determinar a atividade inseticida de MuBL e MuLL sobre operários e soldados de N.

corniger através de ensaios de atividades termiticida e repelência.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 51

• Avaliar a presença de atividade de tripsina em extratos de intestinos de operários e

soldados.

• Determinar o efeito dos extratos de intestino sobre a AH de MuBL, MuHL e MuLL.

• Obter culturas das bactérias presentes em extratos de intestino de operários e soldados

de N. corniger.

• Investigar o efeito de MuBL, MuHL e MuLL sobre as bactérias simbiontes.

3.2.3. Estudo da atividade larvicida de MuLL contra A. aegypti

• Investigar o efeito do extrato de folhas de M. urundeuva e de MuLL na sobrevivência

de larvas L4.

• Obter extratos de intestinos de larvas e avaliá-los quanto às atividades proteolítica, de

tripsina e de α-amilase.

• Avaliar a atividade proteolítica em extratos de intestinos das larvas através de

zimografia para proteases.

• Determinar o efeito dos extratos do intestino de larvas contendo proteases sobre a AH

de MuLL.

• Determinar o efeito de MuLL sobre as atividades enzimáticas detectadas por ensaios

in vitro e através de zimografia para proteases.

3.2.4. Estudo da atividade inseticida do extrato de folhas e MuLL contra S. zeamais

• Avaliar a toxicidade por ingestão de dieta artificial contendo o extrato de folhas ou

MuLL.

• Determinar o índice de deterrência alimentar para as dietas contendo extrato e lectina.

• Calcular os parâmetros nutricionais taxa de crescimento relativo, taxa de consumo

relativo e eficiência de conversão do alimento ingerido.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 52

• Obter extratos de intestino de S. zeamais alimentados ou não com o extrato ou lectina.

• Determinar as atividades de proteases, tripsina, α-amilase, celulases (endoglucanase,

exoglucanase e β-glicosidase) e fosfatases ácidas e alcalinas nos extratos obtidos.


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5. ARTIGO 1

Termiticidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva

against Nasutitermes corniger and its mechanisms

ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO “International Biodeterioration and

Biodegradation” (Volume 65, Issue 1, p. 52-59, 2011)

Fator de Impacto: 1.750 (JCR-2010)


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6. ARTIGO 2

Effect of Myracrodruon urundeuva leaf lectin on survival and

digestive enzymes of Aedes aegypti larvae

ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO “Parasitology Research”

Fator de Impacto: 1.812 (JCR-2010)


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7. ARTIGO 3

Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and

lectin on maize weevil, Sitophilus zeamais (Coleoptera,

Curculionidae)

ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO “Comparative Biochemistry and


Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology”

Fator de Impacto: 2.325 (JCR-2010)


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 90

Deleterious effects of Myracrodruon urundeuva leaf extract and lectin on maize weevil,

Sitophilus zeamais (Coleoptera, Curculionidae)

Thiago Henrique Napoleãoa, Bernardo do Rego Belmontea, Emmanuel Viana Pontuala,

Lidiane Pereira de Albuquerquea, Roberto Araújo Sáb, Laura Mesquita Paivac, Luana

Cassandra Breitenbach Barroso Coelhoa, Patrícia Maria Guedes Paivaa,*

a
Departamento de Bioquímica-CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade

Universitária, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil.


b
Centro Acadêmico do Agreste, Universidade Federal de Pernambuco, Nova Caruaru,

55002-970, Caruaru, Pernambuco, Brasil.


c
Departamento de Micologia-CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade

Universitária, 50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil.

*Corresponding author. Tel: +558121268540; fax: +558121268576.

E-mail address: ppaivaufpe@yahoo.com.br


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 91

ABSTRACT

This work reports the effects of diets containing Myracrodruon urundeuva leaf extract (10–

150 mg/g) and lectin (MuLL; 3–150 mg/g) on survival, feeding, and nutrition of storage pest

Sitophilus zeamais. Digestive enzyme activities of gut extracts from insects reared on extract

(25 mg/g) or MuLL (15 mg/g) diets were also evaluated. Leaf extract induced mortality

(LC50: 72.4 mg/g) while MuLL (30 to 150 mg/g) exerted strong feeding-deterrence. Extract

and MuLL promoted loss of biomass, as reflected in the negative values for relative growth

rates and efficiencies in conversion of ingested food. Protease, trypsin-like, acid phosphatase

and amylase activities from insects reared on extract or MuLL diet were significantly

(p<0.05) lower than in control insects. Ingestion of MuLL also reduced significantly (p<0.05)

endoglucanase and alkaline phosphatase activities. In conclusion, leaf extract and MuLL have

potential for S. zeamais control by killing adults and preventing the use of a food source,

respectively. Deleterious effects of extract and lectin on S. zeamais may be linked to enzyme

inhibition and consequent supression of digestive processes.

Keywords: Myacrodruon urundeuva; Sitophilus zeamais; lectin; insecticidal activity;

antifeedancy; digestive enzymes.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 92

1. Introduction

Protection of food crops against attack of storage insect pests and pathogens is a major

concern for the food industry, farmers, landowners, subsistence smallholders, public health

organs and environment agencies. Deterioration, degradation and contamination of grains by

insects and fungi during storage lead to loss of several billion dollars, affect food security and

have a great ecological impact since energy, land, water and non-renewable resources were

used for production of grains that will never be consumed (FAO, 2009).

The weevil Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera, Curculionidae) is a

cosmopolitan insect pest of maize (Zea mays) being also able to attack sorghum, rice and

wheat as well as processed food products like pasta and biscuits (Fazolin et al., 2010). S.

zeamais, together with other storage insect pests, cause an estimated 20–30% loss of maize

and the damaged grains have reduced nutritional value and weight, low percentage

germination and low market value (Yuya et al., 2009; Tefera et al., 2011). The maize weevil

is able to infest the maize already in the field (Giles and Ashman, 1971).

Populations of S. zeamais have developed moderate to high levels of resistance to

chemical synthetic insecticides such as lindane and malathion in Mexico (Perez-Mendoza,

1999) although it is considered that the resistance levels to organophosphates in Brazil are

still low (Pereira et al., 2009). However, an increase in the levels of resistance is expected due

to the massive use of insecticides mainly fenitrothion (Braga et al., 2011). Enhanced activities

of α-amylase, cellulase as well as serine and cysteine proteinase have been associated with

mitigation of physiological costs associated with the resistance mechanisms in S. zeamais

strains (Araújo et al., 2008; Lopes et al., 2010; Silva et al., 2010a,b). Alternative strategies for

control of S. zeamais populations include the use of entomopathogenic fungi, plant extracts,

essential oils, seed oils, leaf powders as well as pressurized carbon dioxide and temperature

management techniques (Adane et al., 1996; Kehinde and Angela, 2004; Ileleji et al., 2007;
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 93

Noomhorm et al., 2009; Ukeh et al., 2009; Yuya et al., 2009; Betancur et al., 2010; Nukenine

et al., 2010; Coitinho et al., 2011)

Plant lectins (carbohydrate-binding proteins) are biodegradable insecticidal agents

against insects from several orders with socio-economic importance (Lam and Ng, 2011;

Paiva et al., 2011). Plant lectins promoted deleterious effects on survival, growth, oviposition

and reproduction of insect storage pests such as the moths Anagasta kuehniella and Corcyra

cephalonica and the weevils Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus (Zhu-

Salzman et al., 1998; Macedo et al., 2002; Sadeghi et al., 2006; Coelho et al., 2007; Macedo

et al., 2007; Oliveira et al., 2011). The mechanisms by which lectins kill insects have been

studied and can involve the interaction with glycoconjugates along the digestive tract,

resistance to proteolysis, and binding to digestive enzymes. These effects may result in

morphological damages at digestive tract, disruption of gut epithelium and peritrophic matrix,

and inhibition or stimulation of enzyme activities promoting metabolic imbalance and

impairing nutrition and feeding behavior (Zhu-Salzman et al., 1998; Carlini and Grossi-de-Sá,

2002; Sauvion et al., 2004; Macedo et al., 2007; Coelho et al., 2009; Napoleão et al., 2012).

Myracrodruon urundeuva (Anacardiaceae) is a tree broadly distributed in Brazil,

popularly known as “aroeira-do-sertão” or “urundel”. The chitin-binding lectin isolated from

M. urundeuva leaf (MuLL) showed insecticidal activity against termite Nasutitermes corniger

(Isoptera) and larvae of Aedes aegypti (Diptera), the dengue mosquito vector. The insecticidal

mechanisms of MuLL were investigated and the authors reported that the lectin was resistant

to degradation by proteases from gut of N. corniger and A. aegypti, were able to kill

symbiotic bacteria found at N. corniger gut and was able to stimulate α-amylase activity and

inhibit protease and trypsin-like enzymes from gut of A. aegypti larvae. In addition, it was

suggested that chitin-binding property of MuLL allows its interaction with the peritrophic

matrix of both insects (Napoleão et al., 2011, 2012).


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 94

This work evaluated the potential of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) in

affect the survival and feeding of S. zeamais adults when incorporated into an artificial diet.

Also, their effects on nutritional (relative consumption rate, relative growth rate, and

efficiency in conversion of ingested food) and biochemical (gut protease, trypsin-like, α-

amylase, cellulase and phosphatase activities) parameters were determined.

2. Materials and methods

2.1. Plant material

Leaves of M. urundeuva (Engl.) Fr. All. (Family Anacardiaceae) were collected in the

State of Maranhão, northeastern Brazil. A voucher specimen (identified by Mr. Gonçalo

Mendes da Conceição) is deposited under number 054 at the Herbarium Aluisio Bittencourt,

Centro de Estudos Superiores de Caxias, Universidade Estadual do Maranhão, Brazil. The

leaves were dried for 7 days (27 ± 2 °C; relative humidity of 70 ± 5%), powdered, passed

through 40 mesh screen, and stored at 28 ºC.

2.2. Insects

S. zeamais adults were obtained from colonies maintained at the Departamento de

Micologia from Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Brazil, and reared in the

Laboratório de Glicoproteínas, Departamento de Bioquímica from the same university. The

colonies were maintained at 28 ± 2 °C in glass containers (1 L capacity) sealed with thin

TNT-type tissue to permit aeration. The diet consisted of maize grains (100 g per container),

selected according to integrity, sanity, size, and absence of contamination with other insects.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 95

2.3. Chemicals

Asialofetuin, Avicel, azocasein, N-benzoyl-DL-arginyl-ρ-nitroanilide (BApNA),

bovine serum albumin, carboxymethylcellulose, chitin powder from shrimp shells, 3,5-

dinitrosalicylic acid (DNS), D(+)-glucose, glutaraldehyde, ρ-nitrophenyl-β-D-

glucopyranoside, ρ-nitrophenyl phosphate, ρ-nitrophenol, sodium bicarbonate, trichloroacetic

acid and Trishydroximethylaminomethane (Tris) were purchased from Sigma-Aldrich (St.

Louis, MO, USA). Acetic acid, ammonium sulphate, chloridric acid, dibasic sodium

phosphate, monobasic sodium phosphate, and sodium chloride were purchased from Vetec

(Rio de Janeiro, Brazil). Calcium chloride, sodium acetate, sodium hydroxide, soluble starch,

and Triton X-100 were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). All reagents were of

analytical grade.

2.4. Isolation of MuLL

MuLL was isolated according to the procedure described by Napoleão et al. (2011).

Powdered leaves (10 g) were suspended in 0.15 M NaCl (100 mL) and the mixture was

homogenized in a magnetic stirrer (16 h at 4 ºC), filtered through gauze (Cremer, Blumenau,

Brazil) and centrifuged (3,000 g, 15 min). Next, the supernatant (leaf extract) was treated with

ammonium sulphate (60-80% saturation) and the precipitated protein fraction was

chromatographed on chitin column. MuLL was eluted with 1.0 M acetic acid and dialyzed

(10-kDa cut-off membrane; Sigma-Aldrich, USA) against four changes of distilled water

every 2 h using a volume of 2 L for dialysis fluid.

2.5. Protein content

Protein concentration was determined according to Lowry et al. (1951) using bovine

serum albumin (31-500 µg/mL) as standard.


Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 96

2.6. Hemagglutinating activity

Hemagglutinating assay was carried out in microtiter plates (TPP-Techno Plastic

Products, Trasadingen, Switzerland) according to Paiva and Coelho (1992) by incubating 50-

µl samples with 2.5% (v/v) suspension of human O-type erythrocytes treated with

glutaraldehyde for 30 min (Bing et al., 1967). One hemagglutinating unit (titer-1) was defined

as the reciprocal of the highest dilution of the sample promoting full agglutination of

erythrocytes. Specific hemagglutinating activity (unit mg-1) was defined as the ratio titer to

protein concentration (mg/mL). HA inhibitory assay was performed by incubation (45 min) of

lectin sample with 0.5 mg/mL asialofetuin solution before erythrocyte suspension addition

(Napoleão et al., 2011).

2.7. Flour disk bioassay

An adaptation of the method described by Xie et al. (1996) was used to evaluate

insecticidal activity. For each assay, it was prepared a suspension of 2.0 g of autoclaved wheat

flour (Dona Benta®, Bunge Alimentos S.A., Benevides, PA, Brazil) stirred in 5 mL of a

solution containing the sample diluted in sterile distilled water. Aliquots of 200 µL of the

suspension were measured using a micropipette fitted with a disposable tip that was cut at the

narrow end to produce an internal diameter of 2 mm. Five aliquots of 200 µL were placed on

a Petri dish (90 mm x 100 mm; PETRIQ®, Boeco, Germany) with known weight to form flour

disks and left in incubator overnight at 56 °C to dry. Next, the dish was weighed again and the

mass of the flour disks was determined. Twelve S. zeamais adults with known weight were

then transferred to the dish. Each assay was performed in quadruplicate and the tested

concentrations of sample in flour disks ranged from 10 to 150 (leaf extract) and 3 to 150

(MuLL) mg/g (mg of protein/g of wheat flour). In controls, only sterile distilled water was
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 97

used. The assays were maintained at 28 ± 2 ºC in darkness during 7 days. After this period,

the mortality rate as well as the weights of broken flour disks and insects were recorded.

2.8. Feeding-deterrence and nutritional indices

The feeding-deterrence index (FDI) was calculated as: FDI (%) = 100 x (A – B)/(A),

where A is the mass of food ingested by insects in control assay and B is the mass of food

ingested by insects in sample assay (Isman et al., 1990). According to the FDI, the sample

was classified as having promoted: no feeding deterrence (FDI < 20%), weak feeding

deterrence (50% > FDI ≥ 20%), moderate feeding deterrence (70% > FDI ≥ 50%) or strong

feeding deterrence (FDI ≥ 70%) (Liu et al., 2007).

The data recorded at the end of the insecticidal assay were also used to calculate the

following nutritional indices (Xie et al., 1996): (a) Relative consumption rate = C/(D × days),

where C is mass of ingested food in mg and D corresponds to the initial insect biomass in mg;

(b) Relative growth rate = E/(D × days), where E corresponds to the biomass gained in mg;

(c) Efficiency of conversion of ingested food = E/(C × 100).

2.9. Gut preparations from S. zeamais

Groups of fifty S. zeamais adults reared for 7 days on artificial diet containing leaf

extract (25 mg/g), MuLL (15 mg/g) or distilled water (control) were collected and

immobilized by placing them at -20 ºC for 10 min. The gut of each insect was hand-dissected

and immediately homogenized with 1 mL of Tris buffer (0.1 M Tris-HCl pH 8.0 containing

0.02 M CaCl2 and 0.15 M NaCl), acetate buffer (0.1 M sodium acetate pH 5.5 containing 0.02

M CaCl2 and 0.15 M NaCl) or sodium phosphate buffer (0.02 M sodium phosphate pH 7.0

containing 0.15 M NaCl) using a 3 mL tissue grinder (Pyrex®, Corning Inc., NY, USA). The
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 98

homogenates were centrifuged at 9,000 g at 4 °C during 15 min. The supernatants (gut

extracts) were collected and evaluated for protein concentration and enzyme activities.

2.10. Enzyme assays

2.10.1. Total protease activity

Total protease activity of gut extract in Tris buffer was determined using azocasein as

substrate according to Azeez et al. (2007). Gut extract (50 µL; 350 µg of protein) was mixed

with 300 µL of 0.1 M sodium phosphate pH 7.5 containing 50 µL of 0.6% (w/v) azocasein.

The mixture was supplemented with 100 µL of 0.1% (v/v) Triton X-100 and incubated at 37

ºC for 3 h. The reaction was stopped by adding 200 µL of 10% (v/v) trichloroacetic acid and

the assay was incubated at 4 ºC for 30 min. Next, it was centrifuged at 9,000 g for 10 min and

the absorbance of the supernatant at 366 nm was determined using a spectrophotometer

(GeneQuantTM 1300, GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA). One unit of

protease activity was defined as the amount of enzyme that gave an increase of 0.01 in

absorbance.

2.10.2. Trypsin-like activity

The presence of trypsin activity in gut extract in Tris buffer was determined in 96-well

microtiter plates (TPP-Techno Plastic Products, Trasadingen, Switzerland) using the synthetic

substrate BApNA as described by Kakade et al. (1969). Gut extract (30 µL, 220 µg of protein)

was incubated (30 min, 37 ºC) with 8 mM BApNA (15 µL) in Tris buffer (55 µL). Enzyme

activity was evaluated by measurement of absorbance at 405 nm using a microplate reader

(µQuant MX200, BioTek Instruments, Inc., VT, USA). One unit of trypsin-like activity was
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 99

defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 µmol of BApNA per minute under the

established conditions. Assays were performed in quadruplicate.

2.10.3. Acid and alkaline phosphatase activities

The activity of phosphatases was determined according to an adaptation of the method

developed by Asakura (1978) described by Koodalingam et al. (2011). Gut extract in sodium

phosphate buffer (50 µL; 300 µg of protein) was mixed with 450 µL of 0.05 M sodium

acetate buffer pH 4.0 (for determination of acid phosphatase activity) or 0.05 M Tris-HCl pH

8.0 (for alkaline phosphatase activity). Next, 500 µL of 12.5 mM ρ-nitrophenyl phosphate

prepared in acetate or Tris buffer was added to the mixtures. After incubation for 15 min at 37

°C in water bath apparatus (500/1D model, Nova Ética, SP, Brazil), the enzyme reaction was

stopped by adding 100 µL of 0.5 M sodium hydroxide and centrifugation (4000 g; 5 min)

ensued. The absorbance at 410 nm of the supernatants was then recorded using

spectrophotometer. The amount of ρ-nitrophenol (ρNP) released by hydrolysis of substrate

was determined using the standard curve Y=0.0013X+0.0648, where Y is the absorbance at

410 nm and X is the ρNP concentration in mg/mL. One unit of acid or alkaline phosphatase

activity was defined as the amount of enzyme required to generate 1 µmol of ρ-nitrophenol

per minute. Assays were performed in triplicate.

2.10.4. Cellulase activities

2.10.4.1. Endoglucanase and exoglucanase activities

Assays for endoglucanase and exoglucanase were carried out according to adaptations

of the methods described by Li et al. (2009) and Wood and Bhat (1988), respectively. The

reactions started by incubating (50 °C, 10 min) gut extract in acetate buffer (100 µL; 600 µg
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 100

of protein) with 400 µL of a 1% (w/v) carboxymethylcellulose (for endoglucanase activity) or

1% (w/v) Avicel (for exoglucanase activity) solutions in sodium acetate pH 5.5 containing

0.15 M NaCl. After incubation, 500 µL of DNS were added to stop the reaction and the

mixtures were heated (100 ºC) for 6 min and immediately cooled on ice (15 min). Then, the

absorbance at 540 nm was measured using spectrophotometer. The amount of reducing sugars

was determined using glucose as standard (Y=0.1261X–0.0157; Y is the absorbance at 540

nm; X is the glucose concentration in mg/mL). One unit of enzyme activity was defined as the

amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Blanks were performed

submitting gut extract to the same reaction steps in absence of substrate.

2.10.4.2. β-Glucosidase activity

An adaptation of the method described by Tan et al. (1987) was used to assess β-

glucosidase activity. Gut extract in acetate buffer (50 µL; 400 µg of protein) was incubated

(50 °C; 10 min) with 400 µL of 0.1 % (w/v) ρ-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside solution in

sodium acetate pH 5.5 containing 0.15 M NaCl. After incubation, 500 µL of 10% (w/v)

sodium bicarbonate were added to stop the reaction and the absorbance at 410 nm from 200

µL-aliquots of each reaction was measured using a microplate reader. The amount of ρNP

released by hydrolysis of the substrate was determined using the standard curve described in

section 2.10.3. One unit of activity was defined as the amount of enzyme required to generate

1 µmol of ρNP per minute. Reaction blanks were performed without substrate.

2.10.5. α-Amylase activity

The assay was carried out based on the method described by Bernfeld (1955). Gut

extract in acetate buffer (100 µL; 600 µg of protein) was incubated at 50 °C for 10 min with

400 µL of a 1% (w/v) soluble starch solution in 0.1 M sodium acetate pH 5.5 containing 0.02
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 101

M CaCl2 and 0.15 M NaCl. The reaction was stopped by adding 500 µL of DNS. Next, the

assays were heated at 100 ºC in boiling water for 6 min and immediately cooled on ice for 15

min. The absorbance was measured at 540 nm using spectrophotometer and the amount of

reducing sugars was determined calculated using the standard curve of the reaction between

glucose and DNS presented in section 2.10.4.1. One unit of α-amylase activity was defined as

the amount of enzyme required to generate 1 µmol of glucose per minute. Reaction blanks

were performed without starch. Assays were performed in triplicate.

2.11. Statistical analysis

Standard deviations (SD) were calculated using GraphPad Prism version 4.0 for

Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA) and data were expressed as a

mean of replicates ± SD. Significant differences between treatment groups were analyzed by

Student’s t-test (significance at p<0.05) using the Origin 6.0 program. The lethal

concentration required to kill 50% (LC50) of insects in 7 days was calculated by probit

analysis with a reliability interval of 95% using the computer software StatPlus® 2006

(AnalystSoft, Canada).

3. Results and discussion

M. urundeuva leaf extract induced the mortality of S. zeamais adults in a dose-

dependent manner (Table 1) and the LC50 was 72.4 mg/g for 7 days. Leaf extract at 10 mg/g

promoted 14.3% mortality rate, being more active than a cinnamaldehyde from Cinnamomum

aromaticum bark, which promoted 12% mortality of S. zeamais adults at 13.6 mg/g (Huang

and Ho, 1998). Triterpenes and derivatives from Junellia aspera promoted slight mortality

(1.8–9.5%) of S. oryzae adults after 5 days when incorporated into wheat flour disks at 400
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 102

µg/disk (which corresponded to approximately 5.2 mg/g) but after 10 days the mortality rates

ranged from 47.1% to 100% (Pungitore et al., 2005).

Leaf extract also exerted feeding-deterrent activity (Figure 1A), with the effects

varying from weak (10 mg/g) to moderate (25, 50, 100, and 150 mg/g). However, although

the feeding-deterrent activities of the extract from 25 to 150 mg/g were similar, the mortality

rates in 100 and 150 mg/g treatments were significantly (p<0.05) higher (Table 1). These

results indicate that death of insects was not only a consequence of a moderate starvation

condition but was also linked to ingestion of toxic component(s) present in extract.

Aiming to determine if MuLL would be the component of leaf extract which promotes

deleterious effects on S. zeamais, the lectin (specific hemagglutinating activity of 16,384) was

incorporated into artificial diet offered to the insects during 7 days. Unlike the leaf extract,

MuLL did not induce significantly (p>0.05) the mortality of S. zeamais in this period (Table

1). On the other hand, antifeedant effect of MuLL was greater than that of leaf extract. The

data in Figure 1B show that MuLL had moderate feeding-deterrent activity at the lowest

concentrations evaluated (3 and 15 mg/g) and strong at all others (30–150 mg/g). Insects

which had contact with highest content of MuLL (150 mg/g) ingested a small amount of food,

with a FDI of 91%. Since no mortality was detected after 7 days, the high FDI values are

linked to rejection of diet containing the isolated lectin and cannot be also due to decreasing

in the number of live insects. In this way, an acute toxicity of MuLL cannot be observed

because the insects avoided ingesting it. The feeding-deterrent activity of leaf extract may be

related to MuLL presence at a level sufficient to exert a moderate effect.

To our knowledge, this is the first report of lectin effect on S. zeamais but feeding-

deterrent activity of lectins has been documented. The Galanthus nivalis and wheat germ

agglutinins exerted strong feeding-deterrent effects on adults of Nilaparvata lugens and larvae

of Lucilia cuprina, respectively (Powell et al., 1995; Felton and Gatehouse, 1996). The lectin
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 103

from Canavalia ensiformis (Con A) also caused a rejection effect on Acyrthosiphon pisum

(Sauvion et al., 2004). Alteration in feeding behavior of insects by lectins may be a

consequence of a process mediated by gustatory sensilla (preingestional effect) or may be due

to intoxication (postingestional effect), which is probably associated to binding of lectin to

insect digestive tract and involves different aspects of digestion and absorption (Sauvion et

al., 2004; Michiels et al., 2010; Sprawka and Goławska, 2010).

Death of all insects in MuLL treatments was observed after 10-11 days. A 100%

mortality rate of insects mantained in absence of diet was detected after 10 days, which was

close to the period that insects reared on MuLL diet were able to withstand. In controls,

mortality rate after 11 days was only 23 ± 5.7%. Indeed, it is described that S. zeamais adults

are able to survive for a long starvation period of 11 days (Maceljski and Korunić, 1973). The

insects reared on diet containing MuLL did not die after 7 days even if they had eaten little.

According to Park et al. (2009), ingestion of a minimal food amount or no feeding activity

lead insects to a starvation stress impairing their behavior, physiology, development,

reproduction and survival.

The physiological costs of starvation are usually associated with alterations in the rates

of lipid, protein and carbohydrate metabolism, leading to decrease in the efficiency with

which food is converted to biomass. It has been reported that the ingestion of plant extracts

and lectins can disturb digestion and absorption of nutrients by insects (Paiva et al., 2012). In

this sense, nutritional and biochemical parameters of S. zeamais adults reared on artificial

diets were determined aiming to evaluate whether the ingestion of leaf extract and MuLL

resulted in a physiological imbalance.

The deleterious effects of leaf extract on S. zeamais were also reflected on nutritional

parameters. Increase of extract concentration in diet was accompanied by significantly

(p<0.05) decreasing in the relative consumption rate (Figure 2A). In the control treatment, the
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 104

insects consumed an average of 0.63 mg of diet per mg of body weight every day. In

treatment with leaf extract at 150 mg/g, this value was only 0.05 mg/mg/day. The values of

relative comsuption rates of insects reared on diet containing MuLL were on average 4.75

times lower than that determined in control (Figure 3A), which was probably a result of the

strong feeding-deterrent activity of lectin. The decrease in consumption by insects in the leaf

extract and MuLL treatments was probably due to the feeding-deterrent activity of lectin.

Also, the death of insects promoted by leaf extract during the assay certainly led to decrease

of relative consumption rates.

The relative growth rate in treatments with the extract at 25 mg/g was significantly

(p<0.05) lower than in control treatment (Figure 2B). However, negative values were detected

in treatments at highest concentrations (Figure 2B), revealing that the insects presented not

only decrease in weight gain but that they lost biomass. In treatments with MuLL, the mean

relative growth rates were also negative, probably as a consequence of the absence of

adequate feeding activity of insects (Figure 3B). A possible explanation for these results is

that leaf extract and MuLL impaired digestion and absorption process at a high level so that

the insects started to metabolize their body reserves to survive at all cost.

The efficiency in conversion of ingested food in control was 2.15%, similar to that

detected in treatment with leaf extract at 10 mg/g (Figure 2C). This parameter decreased to

0.38% in treatment with 25 mg/g, evidencing an initial difficult of insects to incorporate the

diet nutrients. At treatments with extract from 50 to 150 mg/g, the values were negative

ranging from -2% to -44%, revealing that the insects have failed to incorporate the diet and

that the amount of food ingested was not sufficient to compensate deleterious effects of

extract, resulting in loss of biomass. The efficiency in conversion of ingested food in

treatments with MuLL was also negative, reaching values of -23% and -32% in treatements at

75 and 150 mg/g, respectively (Figure 3C), demonstrating that incorporation of MuLL into
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 105

insect diet led to imbalance of insect physiology and growth. Lectins have been reported to

disturb the incorporation of food when added to the diet of other storage insect pests.

Decreases by 16.8% and 31.2% in the efficiency in conversion of ingested food were detected

when A. kuehniella larvae were reared on diets containing lectins from seeds of Annona

coriacea and Moringa oleifera, respectively (Coelho et al., 2007; Oliveira et al., 2011).

Aiming to evaluate the effects of leaf extract and MuLL in S. zeamais metabolism,

enzyme activities were determined in gut extracts from insects fed or not on diets that

promoted moderate antifeedant effect. Table 2 shows that extracts from control group

presented protease, trypsin-like, α-amylase activities higher than those in gut extracts from

insect reared on diet containing leaf extract. The study also demonstrated that cellulase

(endoglucanase, exoglucanase and β-glucosidase) activities were not affected by leaf extract

while acid and alkaline phosphatases were not detected (Table 2).

MuLL reduced significantly (p<0.05) protease, trypsin-like, alkaline phosphatase,

endoglucanase and α-amylase activities (Table 2). Exoglucanase and β-glucosidase activities

were not significantly (p>0.05) different from those determined in gut extracts from control

group while acid phosphatase activity was not detected in insects that fed on MuLL diet

(Table 2). The results reveal that enzymes involved in protein metabolism were more

sensitive than those related to carbohydrate digestion. Previous study showed that MuLL was

able to inhibit the trypsin-like activity from gut of A. aegypti larvae (Napoleão et al., 2012).

The inhibitory effects of leaf extract and MuLL on digestive enzymes probably

resulted in shortening or suppressing of digestion processes contributing to the nutritional

disturbances detected. Also, the inhibition of digestive enzyme activities may be a mechanism

by which MuLL causes an intoxication resulting in feeding deterrence. Ishaaya et al. (1974)

reported that the antifeedant effect of the compound 4′-(3,3-dimethyl-1-triazeno) acetanilide

on Spodoptera littoralis larvae was correlated with inhibitory effect on amylase and protease
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 106

activities. Zhou et al. (2011) suggested that inhibition of digestive enzyme activities is

involved in feeding-deterrent effect of the Xanthium sibiricum sterols against Pieris rapae

(Lepidoptera) larvae. In seeds, it has been reported the presence of protease and amylase

inhibitors active against enzymes from insect midgut naturally act as feeding deterrents

(Sánchez-Hernández et al., 2004).

In summary, M. urundeuva leaf extract is a source of insecticide compounds that act

by killing S. zeamais adults through ingestion and promotion of nutritional disturbance.

MuLL has potential for use in maize weevil control by preventing that these insects enjoy a

food source and by leading the insects to starve until death. This work opens windows to new

studies focusing on identification of toxic components of leaf extract, toxicity of extract and

lectin on non-target species, and insecticide formulas.

Acknowledgments

The authors express their gratitude to the Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) for research grants and fellowship (LCBBC and PMGP).

We are also grateful to the Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de

Pernambuco (FACEPE) for financial support (PMGP). T.H. Napoleão and E.V. Pontual

would like to thank CAPES and FACEPE for graduate scholarships, respectively. L.P.

Albuquerque would like to CAPES and the Brazilian Ministry of Education (Programa de

Reestruturação e Expansão das Universidades Federais – REUNI) for graduate scholarship.

B.R. Belmonte would like to thank FACEPE and CNPq for Scientific Initiation scholarship.

The authors are also deeply grateful to Maria Barbosa Reis da Silva for the technical

assistance.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 107

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Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 115

Table 1. Survival rates of S. zeamais adults reared for 7 days on diets containing M.

urundeuva leaf extract or MuLL.

Sample concentration Mortality rate (%) after 7


(mg/g of wheat flour) days
Leaf extract
10 14.3 ± 4.0 a
25 28.6 ± 10.0 b
50 36.3 ± 7.0 b
100 65.9 ± 8.2 c
150 86.4 ± 8.1 d
Control 10.3 ± 6.0 e

MuLL
3 6.3 ± 2.1 A
15 5.1 ± 2.0 A
30 7.0 ± 2.4 A
45 4.1 ± 2.7 A
75 6.0 ± 2.8 A
150 6.0 ± 2.1 A
Control 5.0 ± 2.0 A
Control treatments contained only wheat flour. Different letters indicate significant (p<0.05)
differences between treatments.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 116

Table 2. Digestive enzyme activities in gut extracts from S. zeamais adults reared on diets

consisting on wheat flour disks containing M. urundeuva leaf extract or MuLL.

Enzyme Treatment groups


Control Leaf extract MuLL
Protease (U/mg) 19.5 ± 1.4 a 0.1 ± 0.0 b 5.9 ± 0.8 c
Trypsin-like (mU/mg) 0.4 ± 0.01 a 0.12 ± 0.01 b 0.18 ± 0.0 c
Acid phosphatase (mU/mg) 89 ± 7.2 a 0.0 b 0.0 b
Alkaline phosphatase (mU/mg) 105 ± 5.4 a 0.0 b 15.7 ± 0.9 c
Endoglucanase (U/mg) 3.4 ± 0.1 a 3.4 ± 0.08 a 2.7 ± 0.16 b
Exoglucanase (U/mg) 4.6 ± 0.2 a 5.1 ± 0.6 a 5.0 ± 0.2 a
β-glucosidase (U/mg) 0.8 ± 0.04 a 0.9 ± 0.2 a 0.74 ± 0.1 a
α-amylase (U/mg) 3.1 ± 0.05 a 2.4 ± 0.02 b 1.95 ± 0.0 c
Control treatments contained only wheat flour. Different letters indicate significant (p<0.05)
differences between treatments. Each value correponds to the mean ± SD of four replicates.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 117

Fig. 1. Effect of M. urundeuva leaf extract and lectin (MuLL) on feeding of S. zeamais adults
by determination of feeding-deterrence indices. The insects were reared on artificial diet
consisting on wheat flour disks containing leaf extract at 10 to 150 mg of protein per g of
wheat flour (A) and MuLL at 3 to 150 mg per g of wheat flour (B). Each bar correponds to the
mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05) differences
between treatments.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 118

Fig. 2. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in


wheat flour disks (control) or M. urundeuva leaf extract (10 to 150 mg of protein per g of
wheat flour). (A) The relative consumption rate indicates the amount of food consumed in mg
per insect body weight in mg every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of
biomass in mg gained every day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in
conversion of ingested food (%) indicates the amount of ingested food incorporated by insects
as biomass. Each bar correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate
significant (p<0.05) differences between treatments.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 119

Fig. 3. Nutritional parameters of S. zeamais adults reared on artificial diets consisting in


wheat flour disks (control) or MuLL (3 to 150 mg per g of wheat flour). (A) The relative
consumption rate indicates the amount of food consumed in mg per insect body weight in mg
every day. (B) The relative growth rate indicates the amount of biomass in mg gained every
day per mg of initial body weight. (C) The efficiency in conversion of ingested food (%)
indicates the amount of ingested food incorporated by insects as biomass. Each bar
correponds to the mean ± SD of four replicates. Different letters indicate significant (p<0.05)
differences between treatments.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 120

8. CONCLUSÕES

 Uma nova lectina ligadora de quitina, denominada MuLL, foi isolada da folha de M.

urundeuva. MuLL é um polipeptídeo glicosilado catiônico de massa molecular 14,2

kDa.

 MuLL é uma lectina resistente a amplas variações de temperatura e pH, cuja atividade

hemaglutinante é inibida por glicoproteínas. MuLL foi capaz de reconhecer o

monossacarídeo N-acetilglicosamina imobilizado em agarose.

 MuBL e MuLL apresentaram atividade inseticida sobre operários e soldados de N.

corniger.

 MuLL promoveu mortalidade de larvas L4 de A. aegypti, constituindo uma nova

alternativa biodegradável a ser considerada no controle deste mosquito vetor.

 O extrato de folhas de M. urundeuva foi tóxico quando ingerido por adultos de S.

zeamais, constituindo uma potencial fonte de agentes inseticidas para controle deste

inseto. A toxicidade do extrato de folhas pode estar ligados a efeitos inibitórios sobre a

atividade de enzimas digestivas de S. zeamais.

 MuLL não promoveu mortalidade de S. zeamais, mas apresentou forte efeito

deterrente de alimentação, apresentando potencial uso para controle deste inseto ao

impedir que os adultos aproveitem uma determinada fonte de alimento. Este é o

primeiro relato do efeito de lectinas sobre o gorgulho do milho.

 A presente Tese contribui para o “estado da arte” no estudo da atividade inseticida de

lectinas, ao indicar como mecanismos da ação inseticida:

1. Resistência de MuBL, MuHL e MuLL à proteólise por enzimas digestivas de N.

corniger e efeito antibacteriano sobre bactérias simbiontes do trato intestinal

desses insetos.
Napoleão, T.H. Atividade inseticida de lectinas de Myracrodruon urundeuva... 121

2. Resistência de MuLL à proteólise por enzimas de larvas de A. aegypti e modulação

das atividades de proteases, tripsina e α-amilase no intestino das larvas.

3. Supressão dos processos digestivos e distúrbios nutricionais em S. zeamais devido

a inibição de enzimas digestivas do inseto.


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9. ANEXO

Insecticide Activity of Lectins and Secondary Metabolites

CAPÍTULO PUBLICADO NO LIVRO:

Editora: InTech, Rijeka – Croácia

ISBN: 978-953-307-780-2

doi:10.5772/2447
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