9.4. Estudio docking.

Para realizar el estudio docking se dividió el estudio en 7 fases, las cuales son
descritas a continuación.

9.4.1. Fase 1. Selección del cristal.

Es necesario contar con la estructura cristalizada del blanco, en nuestro caso se

requiere un cristal que contenga el complejo ADN-girasa y ligandos, estos últimos
servirán para la validación del docking. Se buscó en el PDB los cristales referentes
a la girasa para S. aureus una bacteria representativa de tipo Gram (+) y que es
utilizada en pruebas biológicas.

En la tabla XI se pueden apreciar los siete cristales encontrados para girasa de

Staphylococcus aureus, de estos cristales solo los cristales 1, 5 y 7 fueron
empleados para el estudio docking, debido a que los demás no cumplían con
características como la presencia de ligando, presencia de ADN o segmentación del
ADN. Las características anteriores son importantes debido a que lo que se
pretende evaluar es la interacción entre el complejo ADN girasa-ADN y el
benzofuroxano XI por lo que es necesario contar con ligandos que validen el
docking, además se requiere que el ADN se encuentre en fase de desenrrollamiento
pues es en esta fase que las fluoroquinolonas actúan, por lo que se requiere que el
ADN este seccionado en 4 unidades. Los cristales 1, 5 y 7 cuentan con las
características mencionadas, además los ligandos de referencia son
fluoroquinolonas estudiadas que son análogas a nuestra molécula de estudio.

Una vez seleccionados los cristales con los que se va a realizar el estudio docking
se deben descargar los archivos con extensión pdb del PDB.
Tabla I. Cristales evaluado de la base de datos de Protein Data Bank (PDB) para la
obtención del complejo ADN-girasa-quinolona para Staphylococcus aureus.

9.4.2. Fase 2. Obtención de archivos pdb a partir de los cristales utilizando

AutoDockTools.

Abrir el archivo pdb descargado desde PDB, debe ser abierto con AutoDockTools
con la serie de comandos:

 File- Read Molecule- cristal.pdb

Cuando se abra la molécula se desplegara en la parte izquierda de la ventana un

mapa que muestra las partes que componen el cristal (figura 61), desde el cual se
puede seleccionar las diferentes partes que componen al cristal, se debe
seleccionar las partes del cristal que se necesiten, una vez elegida las moléculas
(ligandos) o partes del cristal (blanco) que se requieren esta pueden ser guardadas
por separado, el programa guarda las partes seleccionadas en un archivo mediante
la serie de comandos:

 File- Save- Write PDB

 Figura 1. Ventana de AutoDockTools donde se muestra el mapa del cristal.

De cada cristal fueron generados 4 archivos pdb tomando el ADN (blanco), el

complejo de ADN y dos subunidades A de la ADN girasa (blanco) y por ultimo dos
fluoroquinolonas (ligandos), fuero dos debido a que se encontraban dos moléculas
de fluoroquinolonas una en cada sección dividida del ADN. Los archivos pdb
generados son mostrados en la tabla XII, además en la figura 62 se muestran las
fotografías de los archivos pdb tomadas con PyMOL.

Tabla II. Archivos pdb generados a partir de los cristales 1,5 y 7 empleando
AutoDockTools.
NOTA. Se deben guardar los archivos pdb con nombres simples para que al
momento de llevar a cabo el docking, el programa pueda correrlos fácilmente.

Figura 2. Fotografías tomadas de los blancos d (ADN) y dg (complejo ADN girasa-

ADN) y de los ligandos ciprofloxacina (cf y ch), clinafloxacina (nf y nh) y
moxifloxacina (mf y mh).

9.4.3. Fase 3. Generación del ligando de prueba.

El ligando de prueba en nuestro compuesto sintetizado el benzofuroxano 173 el cual

será nombrado solo como b, esta molécula fue modelada y optimizada con los
siguientes programas y serie de comandos:

 ChemSketh
El ligando b es modelado en ChemSketh y es optimizado en este mismo programa
mediante el empleo de la pestaña de Tools y la opción 3D Structure Optimization,
el archivo es guardado con extensión .mol.

 GaussView 5.0.8

Después el archivo es abierto con GaussView 5.0.8, desde este programa se debe
seleccionar la serie de comandos:

Calculate- Gaussian Calculation Setup- Job Tipe- Optimization- Sumit- guardar

como – seleccionar extensión gif.

NOTA. Para esta molécula fue necesario implementar la hibridación de cada átomo
así como aplicar la carga de +1 en el nitrógeno y de -1 en el oxígeno del anillo de
furoxano.

 Gaussian 03W

Empleando el programa Gaussian 03W se debe abrir el archivo generado

anteriormente, es decir el que tiene la extensión gjf y seleccionar la opción “Run”, al
termina guardar el archivo con extensión pdb.

9.4.4. Fase 4. Preparación de ligandos y blancos.

Preparación de ligandos utilizando AutoDockTools.

Los siguientes comandos se llevan a cabo desde la ventana de ligando (figura 63).

1. Input-open-seleccionar el ligando con extensión pdb.

2. Input-Choose-seleccionar ligando-Select Molecule for Autodock4.

3. Torsion tree-Chosse Root.

4. Torsion tree-Detect Root.

5. Torsion tree-Chosse torsion-Done.

 6. Torsion tree-Set number of torsions-Dismiss.

7. Ouput-Save as .pdbqt.

Figura 3. Pestaña de “Ligando” desde donde se lleva a cabo la preparación de los

ligandos.

Preparación de los blancos utilizando AutoDockTools.

Los siguientes comandos se llevan a cabo desde barra de menú principal con
excepción del paso 9 el cual se lleva a cabo en la ventana de Grid (figura 64).

1. File-Read molecule.

2. Open-ejempleo.pdb.

3. Edit-Bonds-Build by distance.

4. Edit-Hydrogens-Add-Yes- seleccionar Polar Hidrogens only.

5. Edit-Hydrogens-Merge non polar

 6. Edit-Charges-Add Kollman Charge

7. Edit-Atoms-Assing AD4 type

8. Grid-Macromolecule-Chosose-select molecule

9. Save blanco.pdbt

Figura 4. Pestañas de “File” y “Grid” desde donde se lleva a cabo la preparación

de los blancos.

9.4.5. Fase 5. Generación de archivos gpf usando AutoDockTools para correr el

docking.

Los siguientes comandos se llevan a cabo en la pestaña de “Grid” (figura 64).

 1. Macromolecule- Open- abrir el blanco con extensión pdbqt- Do you want to
preserve these charges……..- yes.

2. Set Map Type- Open ligand- abrir el ligando con extensión pdbqt.

3. Grind Box- en este momento se tienen dos opciones:

 Doking ciego. Se realiza en la totalidad del blanco, se amplía la caja

hasta 126 en los tres ejes y se centra la caja en el centro de la
molécula blanco.

 Doking dirigido. Las dimensiones de la caja se ajusta para que solo

cubra el posible sitio de unión entre el blanco y la molécula, mientras
que el centro de la caja se encuentra en el posible sitio de unión.

4. Cualquiera de las dos opciones que se elijan ay que utilizar la opción de

“spacing” con 0.375 Å, las coordenadas deben de ser guardas con el
comando File- close salving current.

5. Other Options-Parameter Library Filename- seleccionar el archivo

AD4_parameter.Dat (este archivo debe estar en la misma carpeta que los
archivos pdbqt).

6. Output- Save GPF. El nombre del archivo debe incluir los nombres del
ligando y del blanco, los nombres deben ser simples y sin espacios para
simplificar los cálculos.

En la tabla XIII se muestran las coordenadas y las dimensiones de la caja empleada

para generar los archivos gpf, así como los nombres que serán utilizados para llevar
a cabo el docking, el nombre incluye el blanco, el ligando y el cristal del que fueron
extraídos.

Tabla III. Coordenadas y dimensiones de la caja empleado para generar los

archivos gpf.
9.4.6. Fase 6. Generación de archivos dpf usando AutoDockTools para correr el
docking.

 Los siguientes comandos se llevan a cabo en la pestaña de Docking.

 Macromolecule- Set Rigid Filename- elegir el blanco (este no se observara

en la ventana).

 Search Parameter- Genetic Algorithm- usar los valores de la figura 65.

 Output- Lamarckian GA (4.2)- guardar el archivo con el mismo nombre que

el gpf solo que con extensión dpf.
Figura 5. Ventana para generar los archivos dpf mediante el empleo del algoritmo
genético.

NOTA. Los archivos pdbqt de los ligandos y los blancos así como los archivos gpf,
dpf y el archivo AD4-parameter.dat deben de estar en la misma carpeta, de
preferencia en el escritorio y de fácil acceso esto para disminuir la búsqueda
cuando se corra el docking.

9.4.7. Fase 7. Correr el docking desde AutoDockVina.

Debido a la complejidad de los cálculos efectuados por el docking este debe ser
corrido desde un complemento de AutoDockTools llamado AutoDockVina, este
programa se encuentra disponible para las plataformas Linux, Microsoft y Apple, las
mejores opciones para instalarlo son Linux y Apple.

El docking se corre desde la terminal de cada plataforma por lo que cada plataforma
requiere de comandos específicos, los siguientes comandos fueron realizados
desde la terminar de Apple.

Se debe ingresar a terminal, desde aquí se debe seleccionar la carpeta que

contienen los archivos pdbqt de los ligandos y blancos, así como los archivos gpf,
dpf y el archivo AD4-parameter.dat mediante el empleo de los comandos de la tabla
XIV.

Tabla IV. Códigos para usar la terminal de la plataforma Apple.

Una vez dentro de la carpeta se corrió el comando autogrid4, empleando los

nombres de los archivos gpf de la tabla XIII.

autogrid4 –p nombre.gpf –l nombre.glg &

Ejemplo: autogrid4 –p bd1.gpf –l bd1.glg &

Cuando se da “ENTER” se genera un número que corresponde al proceso que está

llevando a cabo el ordenador, debe esperar a que termine el autogrid4, la terminal
indicara cuándo se termine el autogrid4 con la leyenda “DONE #proceso”, si existe
algún error en los archivos aparecerá la leyenda de “ERROR” y una serie de
renglones que describirán dicho error, si esto aparece no es posible correr el
docking y es necesario revisar en cual de la faces se encuentra el error. Se pueden
correr todos los autogrid4’s juntos y puede ser monitoreados mediante el comando
Top.

Una vez terminado el autogri4 se generaran una serie de archivos con extensión glg
en la carpeta en la que se está trabajando así como otros archivos que sirven de
mapa para el docking.

El docking se corre mediante el comando:

atodock4 –p nombre.dpf –l nombre.dlg &

Ejemplo: atodock4 –p bd1.dpf –l bd1.dlg &

Se deben utilizar los mismos nombres que se emplearon para el autogrid4. Cuando
se corre el autodock4 se genera un número de procesó el cual debe de ser anotado
por si es necesario terminar con el procesó (tabla XIV), también puede ser
monitoreado mediante el comando Top.

Cuando el autodock4 termina aparece en la terminal la leyenda “DONE #proceso” y

en la carpeta en la que se está trabajando se generara un archivo con extensión
dlg, el cual contiene los datos correspondientes al docking y que es analizado
mediante AutoDockTools.

11.4. Resultados computacionales.

Para poder analizar los resultados del docking se requieren los archivos dlg
generados en la carpeta donde se corrió el docking, desde AutoDockTools se siguen
los siguientes comandos:

Analize –Dockings –Open…. – seleccionar el archivo dlg de la corrida docking –

Aceptar.

Analize –Macromolecule – Open…. – seleccionar el archichivo pdbqt de la molécula

correspondiente –Aceptar.

Analize – Conformations – Load…. – ampliar la ventana y seleccionar el primer valor

con un doble “click”, el cual corresponde al de menor energía (anotar los valores de
energía y el kI) - Dismiss

Seleccionar el ligando desde el mapa de la ventana izquierda y guardar como

archivo pdb.

El programa PyMol puede abrir los archivos pdb, así como modificar colore y
posición del observador, este programa crea fotografías con el comando
Los valores de ΔG y kI obtenidos de las corridas docking son presentadas en la
tabla XVI, se puede apreciar que en todas las corrida los valores de ΔG
correspondientes al ligando b (compuesto 124) son mayores que en el caso de los
ligandos de referencia. 26, 27, 28

Tabla V. Valores ΔG y kI en contrados para cada una de las corridas docking.