Práctica 1: Extracción de RNA con Trizol.

Incubar de 2 a 3
Pulverizar tejido con 3 Incubar por 5 minutos Adicionar 0,6 mL de minutos a
mL de Trizol a 25°C y mezclar cloroformo temperatura
ambiente

Centrifugar 12000 Incubar 2-3 min. a T

rpm por 15 min a 4- Trasvasar fase acuosa Adicionar 1,5 mL de ambiente, centrifugar
8°C y observar las tres a tubo falcon isopropanol frío 12000rpm y remover
fases sobrenadante

Centrifugar 12000
Adicionar 3 mL de Secar a temperatura Adicionar 90 µL de
rpm y remover
etanol al 95% frío ambiente agua libre de RNAasas
sobrenadante

Disolver

Práctica 2: Preparación de células competentes.

Incubar a 37°C el tiempo

Incubar una colonia de E.
Transferir 0.5 mL de las necesario para que la
coli DH5α en 50 mL de Transferir el cultivo a un
colonias a 50 mL de caldo densidad óptica (600nm)
caldo LB durante una tubo estéril y frío
LB sea igua a 0.4, con
noche a 37°C y 250 rpm
vigorosa agitación

Resuspender en 7 mL de
Centrifugar a 2700 rpm Centrifugar a 2700 rpm
Decantar CaCl2 0.1 M frío por 30
por 10 min a 4 °C por 10 min a 4°C
minutos

Resuspender con 0.850

mL de CaCl2 0.1 M frío y
Decantar Almacenar a -70°C
agregar 0.15 mL de
glicerol
Práctica 3: Transformación de bacterias

Cultivar en agar LB
Identificar dos tubos
colonias de E. coli e Pipetear 250 µL
Eppendorf con +pGLO Enfriar
incubarlas a 37°C por CaCl22 (mM)
y -pGLO
24 h

Añadir 5 µL de Colocar en ambos

Examinar con UV el
plásmido al tubo tubos una colonia de Enfriar por 10 min
plásmido
+pGLO E. coli

Mantener por 50 s a
42 °C ambos tubos
Colocar los tubos en
hielo durante 2 min
Agregar 250 µL de
Colocar 50 µL de cada
medio LB a ambos
tubo a placas de agar
tubos e incubar por
LB
10 min a T ambiente

Práctica 4: Extracción de DNA

En un tubo para
microcentrífuga se debe Resuspender el
Centrifugar durante 15 a
colocar 1 a 2 mL de Retirar el sobrenadante Añadir 200 µL de Tris-HCl sedimento celular por
30 segundos
células que contienen agitación
plásmido

Mezclar 10 veces y Añadir 250 µL de

Añadir 250 µL de NaOH- Se formara un Centrifugar durante 5
observar una solución solución neutra y mezclar
SDS precipitado visible min
viscosa y clara. por 10 min

Se forma un pellet de
Añadir 200 µL de matriz a
escombro blanco En el sobrenadante se Centrifugar durante 30
Preparar columna la columna y decantar el
compacto en el interior obtiene el ADN segundos
sobrenadante
del tubo

Lavar con 500 µL de Centrifugar durante 2 Añadir 200 µL de agua Centrifugar durante 1 Desechar el filtro y
buffer de lavado minutos destilada minuto almacenar el DNA a -20°C
Práctica 5: Enzimas de restricción.

En tubo eppendorf colocar:

5 µL de DNA (0.2 µg/µL), 1
µL de enzima EcoR1, 1 µL
de enzima Hind III, 10 µL de
buffer TAE 2x y 3 µL de H2O
Preparar el gel de agarosa
al 1% en buffer TAE 2x y
Incubar a 37°C por 1 h
adicionar bromuro de
etidio

Colocar en la cámara de Tomar la muestra del tubo

Colocar en el molde la
electroforesis y cubrir con eppendorf y transferirla al
peineta y dejar secar
buffer TAE 2x colorante

Con una micropipeta hacer

la carga de la muestra Correr la electroforesis a Observar en una fuente de
coloreada en el pozo del 100 V por 30 min luz UV
agar

Práctica 6: Preparación de geles.

Gel de DNA

Preparar un gel de
Colocar la cámara de
agarosa al 1% en buffer Colocar el molde con la
electroforesis y cubir
TAE 2X y adicionar peineta y dejar secar
con buffer TAE 2x
bromuro de etidio

Tomar la muestra y Cargar la muestra en el Correr la electroforesis a

transferir al colorante pozo 1000 V por 30 min

Observar en fuente de
luz UV
 Gel de RNA

Preparar un gel al 1% de Calentando hasta que la

agarosa (0.5 g) en buffer
MOPS 1x (50mL) libre
de RNAsa
Enfriar un poco y
solución se torne
agregar 9 mL de
transparente (sin que
formaldehido al 37%
esta llegue a ebullición)

Mezclar suavemente y
agregar de 1 a 5 µL de
bromuro de etidio y
vaciar en una placa libre
de RNAasas
Colocar el buffer en la Cargar de 5 a 10 µg de
cámara de RNA previamente
electroforesis calentado a 60°C

Conectar la fuente de Visualizar las bandas

poder a 74 mV con una cámara de UV

Práctica 7: PCR

Cargar la mezcla de
Combinar muestra Transferir las gotas a
reacción en los
con primer y super- 96 pozos del plato
pozos del generador
mix ddPCR de PCR y sellar
de gotas

Después del PCR

Correr protocolo de leer los 96 pozos y
PCR (x96) analizar
concentraciones

Bibliografía

1) Thermofisher.com. (2018). TRIzol Plus RNA Purification Kit - Thermo Fisher Scientific. [online]
Available at: http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12183555 [Accessed 25 Jan.
2018].
2) Serrano-Rivero, Y.; Hernández-García, A.; Fando-Calzada, R. Comparación de dos métodos para
la preparación de células competentes en Escherichia coli Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol.
44, núm. 2, mayo-agosto, 2013 Centro Nacional de Investigaciones Científicas Ciudad de La
Habana, Cuba

3) Bio-rad.com. (2018). pGLO Bacterial Transformation Kit | | Bio-Rad. [online] Available at:
http://www.bio-rad.com/es-mx/product/pglo-bacterial-transformation-kit [Accessed 25 Jan.
2018].

4) Qiagen.com. (2018). QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit - QIAGEN Online Shop. [online] Available
at: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/qiaamp-dsp-dna-
blood-mini-kit/#orderinginformation [Accessed 25 Jan. 2018].

5) Uprm.edu. (2018). Enzimas de Restricci�n. [online] Available at:

http://www.uprm.edu/biology/cursos/biologiageneral/EnzimasDNA.htm [Accessed 25 Jan. 2018].

6) Padilla, C. Díaz, J. Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y

caracterización electroforética de DNA plamídico. Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, Campus Universitario de Rabanales. México:1-8

7) Bio-rad.com. (2010). Droplet Digital PCR. [online] Available at: http://www.bio-

rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf [Accessed 25 Jan. 2018].