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Toxicidade de herbicidas utilizados na cultura da cana-de-açúcar ...

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TOXICIDADE DE HERBICIDAS UTILIZADOS NA CULTURA DA CANA-DE-


AÇÚCAR À BACTÉRIA DIAZOTRÓFICA Azospirillum brasilense1
Toxicity of Herbicides Applied on Sugarcane to the Diazotrophic Bacterium
Azospirillum brasilense

PROCÓPIO, S.O.2, FERNANDES, M.F.2, TELES, D.A.3, SENA FILHO, J.G.2,


CARGNELUTTI FILHO, A.4, VARGAS, L.5 e SANT’ANNA, S.A.C.6

RESUMO - Objetivou-se neste trabalho identificar herbicidas utilizados na cultura da cana-


de-açúcar que não alteram o crescimento ou a capacidade de fixação biológica de nitrogênio
(FBN) da bactéria diazotrófica Azospirillum brasilense. Dezoito herbicidas – paraquat, ametryn,
amicarbazone, diuron, metribuzin, [hexazinone + diuron], [hexazinone + clomazone],
clomazone, isoxaflutole, sulfentrazone, oxyfluorfen, imazapic, imazapyr, [trifloxysulfuron-
sodium + ametryn], S-metolachlor, glyphosate, MSMA e 2,4-D – foram testados em suas
doses comerciais quanto ao impacto sobre o crescimento da bactéria em meio líquido DIGs.
As variáveis capacidade de suporte de crescimento (carrying capacity) do meio de cultura,
duração da fase lag e tempo de geração de A. brasilense foram calculadas a partir de dados de
densidade ótica obtidos, em intervalos regulares, durante a incubação de culturas por 55 h.
O impacto dos herbicidas na atividade da nitrogenase de A. brasilense foi avaliado em meio
semissólido NFb, sem N, pela técnica da atividade de redução do acetileno (ARA). Os efeitos
dos herbicidas sobre as variáveis de crescimento e ARA foram comparados ao controle pelo
teste de Dunnett. Paraquat, oxyfluorfen, [trifloxysulfuron-sodium + ametryn] e glyphosate
reduziram a capacidade do meio DIGs em suportar o crescimento de A. brasilense. Esse
efeito foi associado ao aumento da duração da fase lag e do tempo de geração para
[trifloxysulfuron-sodium + ametryn] e ao aumento no tempo de geração para glyphosate.
MSMA, paraquat e amicarbazone reduzem a FBN in vitro de A. brasilense, porém essa redução
é mais severa na presença do paraquat. Os demais herbicidas não alteram o crescimento e
a FBN de A. brasilense.

Palavras-chave: Saccharum spp., fixação biológica de nitrogênio, pesticidas.

ABSTRACT - The objective of this work was to identify the herbicides applied on sugarcane that do
not affect the growth nor the process of biological nitrogen fixation (BNF) of the diazotrophic bacterium
Azospirillum brasilense. Commercial doses of eighteen herbicides (paraquat, ametryn,
amicarbazone, diuron, metribuzin [hexazinone + diuron] [hexazinone + clomazone] clomazone, isoxaflutole,
sulfentrazone, oxyfluorfen, imazapic, imazapyr, [trifloxysulfuron-sodium + ametryn], S-metolachlor,
glyphosate, MSMA and 2,4-D) were tested regarding their impact on the bacterial growth in liquid
DIG medium. Thus, the carrying capacity of the culture medium, duration of lag phase and generation
time of A. brasilense were determined by calculating the optical density data obtained at regular
intervals during the incubation of the cultures for 55 h. The impact of herbicides on nitrogenase
activity of A. brasilense was evaluated in semi-solid N-free NFB medium by acetylene reduction
assay (ARA). The effects of herbicides on the growth variables and ARA were compared with the
control by the Dunnett test. Paraquat, oxyfluorfen, [trifloxysulfuron-sodium + ametryn] and glyphosate
reduced the carrying capacity of DIG medium with respect to A. brasilense growth. This effect
was associated with increases in both the length of the lag phase and generation time for
[trifloxysulfuron-sodium + ametryn], and with the increase in generation time for glyphosate. MSMA,

1
Recebido para publicação em 27.12.2010 e aprovado em 2.8.2011.
2
Pesquisador da Embrapa Tabuleiros Costeiros, 49025-040 Aracaju-SE, <procopio@cpatc.embrapa.br>; 3 Discente do Programa
de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal de Sergipe – UFS, 49100-000 São Cristovão-SE; 4 Professor do
Dep. de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Maria – UFSM, 97105-900 Santa Maria-RS; 5 Pesquisador da Embrapa Trigo,
99001-970 Passo Fundo-RS; 6 Discente do Programa de Pós-Graduação em Agronomia – Ciência do Solo, Universidade Federal
Rural do Rio de Janeiro – UFRRJ, 23890-000 Seropédica-RJ.

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paraquat and amicarbazone reduce the BNF of A. brasilense; however, this reduction is more
severe in the presence of paraquat. The other herbicides do not affect the growth or the BNF of
A. brasilense.

Key words: Saccharum spp., biological nitrogen fixation, pesticides.

INTRODUÇÃO Brasil não ultrapassam a dose de 80 kg ha-1


de N em média, o restante desse nutriente
A cultura da cana-de-açúcar exerce papel pode ser proveniente do solo, o qual é natural-
de grande importância na economia de mente pouco disponível para as plantas na
diversos países dos cinco continentes, sendo maioria dos solos tropicais e/ou da fixação
de maior destaque nas economias da América biológica do N atmosférico (FBN) realizada
Latina e do Caribe (Coelho et al., 2003). No por bactérias diazotróficas endofíticas ou
Brasil, é cultivada em quase todas as suas rizosféricas (Urquiaga et al., 1992). Trabalhos
regiões agrícolas (Baldani et al., 2002). indicam que esta última fonte de N pode
Atualmente, estima-se que a cultura da cana- contribuir com até 60% de todo o N acumulado
de-açúcar esteja presente em mais de nove pelas plantas de cana-de-açúcar (Boddey et al.,
milhões de hectares das áreas agrícolas bra- 2001), variando entre os diferentes genótipos
sileiras (IBGE, 2011). (Reis et al., 2000). Oliveira et al. (2002) veri-
ficaram que a inoculação de plantas micropro-
Além da crescente demanda externa, o
pagadas de cana-de-açúcar com uma mistura
requerimento de etanol para abastecimento
de cinco estirpes de diferentes espécies de bac-
do mercado interno tem sido crescente du-
térias diazotróficas resultou em contribuições
rante toda a década, sobretudo após 2003, com
ao redor de 30% do N total absorvido.
o início da comercialização de carros com
motor flex no Brasil (Rudorff et al., 2010). Entre as diferentes espécies de bactérias
Para suprir essas demandas, novas unidades diazotróficas associadas a gramíneas, desta-
industriais estão sendo construídas em várias cam-se as do gênero Azospirillum, que, além
regiões do País, aumentando muito a área da fixação de N atmosférico, também podem
cultivada com cana-de-açúcar (Nassar et al., produzir e fornecer às plantas auxinas, gibere-
2008; Rudorff et al., 2010). Nesse aspecto, uma linas, citocininas e vitaminas (Rodelas et al.,
das principais preocupações do governo brasi- 1993; Moutia et al., 2010).
leiro é que essa expansão ocorra em regiões
A presença de plantas daninhas em lavou-
apropriadas, referendadas por um zoneamento
ras de cana-de-açúcar pode causar perdas na
agrícola, impedindo o avanço da cultura nos
produtividade de colmos e de açúcar, decrés-
biomas amazônico e pantanal. Essa expansão
cimo da longevidade do canavial, dificuldade e
significativa e inevitável da cultura, aliada à
aumento no custo da colheita, queda na qua-
preocupação cada vez maior de determinados
lidade industrial da matéria-prima, servir de
setores da sociedade com a sustentabilidade
abrigo para pragas e doenças da cana-de-
dos agroecossistemas, gera uma demanda
açúcar e causar depreciação no valor da terra.
tecnológica pelo desenvolvimento de sistemas
Entre os métodos de controle das plantas
de produção mais eficientes e preservacio-
daninhas, sobressai no Brasil o químico, devi-
nistas.
do, principalmente, ao rendimento operacional
A cana-de-açúcar é uma cultura que extrai e ao custo por área, comparado aos demais
expressiva quantidade de nitrogênio (N); para métodos. No entanto, a aplicação de herbicidas
alcançar produtividade média de 100 Mg ha-1 sobre culturas que realizam simbiose com
de colmos, acumula em sua parte aérea bactérias fixadoras de N atmosférico pode
180-250 e 120-180 kg ha-1 de N, nos ciclos cul- prejudicar a eficiência na assimilação desse
turais de cana-planta (primeiro ciclo) e nutriente (Marenco et al., 1993; Novo et al.,
soqueiras (ciclos seguintes), respectivamente 1996, 1998; Santos et al., 2005a). Esses prejuí-
(Sampaio et al., 1984). Considerando-se que zos devem-se à interferência do herbicida no
as quantidades de N-fertilizante aplicadas no metabolismo do microssimbionte, na planta

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hospedeira ou em ambos, quando em preparadas com água destilada e filtrada


associação (Arruda et al., 2001). Madhaiyan através de membranas Millipore® com poros
et al. (2006) verificaram que o herbicida de 0,22 µm. As concentrações dos herbicidas
2,4-D, adicionado na sua dose comercial ao nas soluções-estoque foram determinadas de
meio de crescimento de Gluconacetobacter modo que a adição de 200 µL destas ao volume
diazotrophicus, promoveu redução na produ- final de meio de cultura utilizado nos diferentes
ção de ácido 3-indol-acético (AIA) e ácido ensaios resultasse nas concentrações previa-
giberélico (GA3) de 39,5 e 78,8%, respectiva- mente estabelecidas para cada tratamento.
mente, além de ocasionar a perda de 48,2
O efeito de doses comerciais de herbicidas
e 58,6% da habilidade da bactéria em solubi-
sobre os parâmetros de crescimento de
lizar fósforo e zinco, respectivamente. Santos
A. brasilense foi avaliado pelo monitoramento
& Flores (1995) observaram que o herbicida
do crescimento celular por turbidimetria das
glyphosate ocasionou redução no tamanho das
culturas inoculadas em meio líquido DIGs,
células de Azotobacter vinelandii e Azotobacter
misturados com os herbicidas e incubados por
chroococcum.
55 h. Para isso, um volume de 200 µL das
Em razão desse cenário, o objetivo deste soluções herbicidas filtradas foi adicionado a
trabalho foi identificar herbicidas utilizados na erlenmeyers de 50 mL contendo 25 mL de
cultura da cana-de-açúcar que não afetam o meio líquido DIGs, de modo a atingir as
crescimento, ou que não causem prejuízos à concentrações comerciais recomendadas para
capacidade de FBN da bactéria diazotrófica cada produto (Tabela 1). Frascos controle
Azospirillum brasilense. receberam 200 µL de água destilada filtrada
através de membrana Millipore®. Os frascos
MATERIAL E MÉTODOS foram inoculados com 40 µL de uma cultura
de A. brasilense ativa (DO450nm = 0,6). Após
Preparo do inóculo inoculação, os frascos foram rapidamente
agitados e o conteúdo deles vertido em placas
A estirpe de Azospirillum brasilense de Petri estéreis. Alíquotas de 200 µL dessas
(Cd) utilizada neste estudo foi obtida da Coleção misturas foram transferidas para microplacas
de Bactérias Diazotróficas da Embrapa de 96 poços, utilizando-se uma micropipeta
Agrobiologia. de oito canais, de modo que cada coluna da
placa (oito poços) recebesse um tratamento
As células foram ativadas em 10 mL de
herbicida diferente. Uma das colunas de poços
meio líquido DIGs, cuja formulação, em g L-1
foi preenchida com meio DIGs estéril, para
de água destilada, é a seguinte: glicose, 2,0;
verificar a possível ocorrência de conta-
ácido málico, 2,0; peptona, 1,5; extrato de
minação da microplaca durante as leituras
levedura, 2,0; K2HPO4, 0,5; MgSO4.7H2O, 0,5; e
de DO ao longo do período dos ensaios. As
ácido glutâmico, 1,5, pH 6,8. A cultura foi
placas foram incubadas a 32 oC, no escuro, e
incubada a 25 oC por 72 h, quando a densidade
as leituras de DO, realizadas em intervalos
ótica (DO450nm) atingiu aproximadamente 0,6.
regulares (a cada 2 h, aproximadamente)
Esse mesmo procedimento de ativação das
em um leitor de microplacas, ajustado no
bactérias foi usado para a preparação do
comprimento de ondas de 450 nm. Com os
inóculo em todos os ensaios descritos a seguir.
resultados das leituras, foram geradas
curvas de crescimento bacteriano durante o
Efeito de doses comerciais de herbicidas
período de avaliação, para os diferentes
sobre o crescimento de A. brasilense
tratamentos.
Dezoito herbicidas registrados para a A diferença entre os valores máximos e mí-
cultura de cana-de-açúcar no Brasil (Brasil, nimos de absorvância durante o período de in-
2011) foram avaliados (Tabela 1) quanto cubação de cada uma das culturas (tratamentos
ao impacto sobre o crescimento e a fixação herbicidas) foi interpretada como a capacidade
biológica de nitrogênio de Azospirillum de suporte de crescimento bacteriano (carrying
brasilense em condições de laboratório. capacity) do meio de cultura contendo os dife-
Soluções-estoque dos herbicidas foram rentes produtos. A capacidade de suporte do

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Tabela 1 - Lista de herbicidas avaliados no presente estudo

Dose Concentração
Nome comum Marca comercial Grupo químico Mecanismo de ação
(g ha-1) (µg L-1)
Paraquat Gramoxone 200® 600 8,49 Bipiridílios Inibidor do fotossistema I
Ametryn Gesapax® 4.000 56,60 Triazinas Inibidor do fotossistema II
Amicarbazone Dinamic® 1.400 19,81 Triazolinonas Inibidor do fotossistema II
Diuron Herburon 500 BR® 3.200 45,28 Derivados da ureia Inibidor do fotossistema II
Metribuzin Sencor 480® 1.920 27,17 Triazinonas Inibidor do fotossistema II
® Triazinonas + Inibidor do fotossistema II +
Hexazinone + diuron Velpar K WG 396 + 1.404 5,60 + 19,87
Derivados da ureia Inibidor do fotossistema II
Inibidor do fotossistema II +
Hexazinone + ® Triazinonas + Inibidor da biossíntese de
Discover 500 WP 250 + 1.000 3,54 + 14,15
clomazone Isoxazolidinonas carotenoides (local de ação
desconhecido)
15,57 Inibidor da biossíntese de
Clomazone Gamit® 1.100 Isoxazolidinonas carotenoides (local de ação
desconhecido)
Inibidor da biossíntese de
Isoxaflutole Provence 750 WG® 262,5 3,71 Isoxazoles
carotenoides
Inibidor da protoporfirinogênio
Sulfentrazone Boral 500 SC® 800 11,32 Triazolinonas
oxidase (PPO)
Inibidor da protoporfirinogênio
Oxyfluorfen Goal BR® 1.200 16,98 Difeniléteres
oxidase (PPO)
Inibidor da acetolactato sintase
Imazapic Plateau® 245 3,47 Imidazolinonas
(ALS)
Inibidor da acetolactato sintase
Imazapyr Contain® 500 7,08 Imidazolinonas
(ALS)
Trifloxysulfuron-sodium Sulfonilureias + Inibidor da acetolactato sintase
Krismat® 37 + 1.463 0,52 + 20,70
+ ametryn Triazinas (ALS) + Inibidor do fotossistema II
S-metolachlor Dual Gold® 1.920 27,17 Cloroacetamidas Inibidor da divisão celular
Glyphosate Roundup® 1.800 25,47 Derivados da glicina Inibidor da EPSP sintase
MSMA MSMA Sanachem 720 SL® 2.880 40,75 Organoarsenicais Desconhecido
® Derivados do ácido
2,4-D Aminol 806 1.005 14,22 Mimetizador de auxinas
ariloxialcanoico

crescimento pelo meio DIGs em cada trata- e tlag foram estimados para cada uma das oito
mento foi calculada para cada uma das oito repetições, separadamente.
repetição individualmente.
O tempo de geração de A. brasilense exposta
O comprimento da fase lag foi estimado aos diferentes herbicidas foi calculado após
como o tempo no qual o ln (DO) da fase lag transformação dos dados de DO em ln (DO). Para
equivaleu à média do ln (DO) das três pri- esses cálculos, um mínimo de cinco leituras
meiras leituras de DO, quando as células se de DO, tomadas do meio da fase log, foram
encontravam indubitavelmente em fase lag. consideradas.
Matematicamente, o comprimento da fase lag As médias de cada tratamento herbicida
(tlag) foi calculado de acordo com a seguinte foram comparadas à do tratamento controle
equação: (sem herbicida) pelo teste de Dunnett (p<0,05).
tlag = [(ln ODlag) – a]/b
Efeito de doses comerciais de herbicidas
em que ln ODlag corresponde ao ln da média das sobre a atividade de nitrogenase de
três primeiras leituras de DO; e a e b, ao A. brasilense
intercepto e à inclinação da equação ajustada
para o ln de DO na fase log em função do tempo Os herbicidas foram testados quanto ao
de incubação. Os valores de tempo de geração impacto na atividade da nitrogenase de

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A. brasilense quando esta foi cultivada em Intensidade de inibição da atividade de


meio semissólido NFb livre de N (Döbereiner nitrogenase por diferentes doses de
et al., 1995). Alíquotas de 20 µL de uma cultura herbicidas
de A. brasilense crescida sob agitação por 36 h
em meio DIGs líquido (DO = 0,7) foram uti- Os herbicidas MSMA e paraquat, cujas
lizadas para inocular frascos de 50 mL doses comerciais apresentaram efeitos
contendo 25 mL do meio semissólido com as significativos mais pronunciados sobre a ativi-
diferentes concentrações de herbicidas a dade de nitrogenase de A. brasilense, foram
serem testadas. Os herbicidas foram adicio- posteriormente avaliados para determinação
nados ao meio semissólido, utilizando-se da concentração requerida para inibir 50% da
200 µL de soluções-estoque de herbicidas atividade nitrogenase (CI50at).
esterilizadas por filtração. Essas soluções Os procedimentos utilizados para este
foram preparadas de modo que a adição de ensaio foram os mesmos descritos para o
200 µL destas a 25 mL de meio semissólido ensaio anterior, exceto que cinco doses desses
resultasse nas concentrações finais dos pro-
herbicidas foram testadas (MSMA – 0; 144,4;
dutos determinadas para cada tratamento
433,2; 866,4; e 1.732,8 g ha-1; paraquat – 0, 30,
(Tabela 1). Nos frascos utilizados como controle,
90, 180 e 360 g ha-1).
adicionaram-se 200 µL de água destilada este-
rilizada por filtração em membrana Millipore® Utilizou-se análise de regressão para
com poros de 0,22 µm de diâmetro. Quatro avaliar a resposta da atividade da nitrogenase
frascos foram preparados para cada tratamento. ao incremento das doses dos herbicidas.
Os frascos foram fechados com tampão de
algodão e incubados por 48 h a 32 oC no escuro. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após esse período, uma película bem desen-
volvida foi observada na subsuperfície de todos A capacidade de suporte de crescimento
os frascos controle. Cada frasco foi então de A. brasilense em meio DIGs foi atingida
fechado com um septo de borracha, sendo 10% para o tratamento controle dentro do período
da atmosfera deles (2,5 mL) substituída por de incubação de 55 h. Durante esse mesmo
acetileno de alta pureza, por meio de uma período de incubação, uma menor biomassa
seringa hipodérmica (Haahtela et al., 1981). de A. brasilense foi acumulada no meio
com os herbicidas paraquat, oxyfluorfen,
A produção de etileno foi determinada após
[trifloxysulfuron-sodium + ametryn] e
12 h de incubação a 32 oC, no escuro. Tubos
glyphosate (Figura 1), sendo o oposto válido
sem acetileno foram também incluídos
para os herbicidas metribuzin, clomazone e
para a quantificação do etileno endógeno. Em
S-metolachlor. Efeitos positivos da aplicação de
seguida, para determinação de etileno, 100 µL
herbicidas sobre o crescimento de populações
de amostra gasosa da atmosfera dos frascos
de organismos diazotróficos têm sido relatados
foram injetados em um cromatógrafo a gás
em algumas situações (Jena et al., 1990;
(Perkin-Elmer, Clarus 500) com um detector
Patnaik & Rao, 1994; Das & Debnath, 2006);
de ionização de chamas (FID) e uma coluna
no entanto, as causas desse benefício ainda
capilar com fase estacionária GS-CarbonPLOT
necessitam ser mais bem elucidadas.
(Agilent J&W Scientific, Santa Clara, CA,
USA). As temperaturas de operação da coluna, Quando observada, a redução na capaci-
do injetor e do detector foram de 100 oC, 150 oC dade de suporte do crescimento na presença
e 180 oC, respectivamente. Nitrogênio de alta de herbicidas pode estar associada à menor
pureza foi utilizado como gás de arraste, com eficiência de utilização dos recursos presentes
fluxo de 1,8 mL min-1. A atividade da nitroge- no meio pela bactéria. Em condições de estres-
nase foi calculada em nmoles de etileno se, parte da energia disponível ao organismo é
produzido por frasco por hora. Os efeitos dos despendida para manter mecanismos celu-
herbicidas sobre a atividade de redução do lares e bioquímicos de tolerância ao estressor,
acetileno (ARA) foram comparados ao do trata- em detrimento do crescimento, reduzindo o
mento controle pelo teste de Dunnett (p<0,05). coeficiente de rendimento microbiano
As eventuais porcentagens de inibição causa- (Schimel et al., 2007). Esse comportamento foi
das pelos herbicidas foram calculadas. evidenciado no estudo de Santos et al. (2005b),

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que observaram incrementos na taxa respi- bactérias ao novo ambiente. É importante


ratória por unidade de biomassa microbiana ressaltar que esse maior tempo de adaptação
em resposta à adição de herbicidas ao solo, pode estar associado a um período durante o
sendo essa taxa diretamente proporcional às qual ocorre a indução e a expressão de meca-
doses aplicadas. No presente estudo, alterações nismos bioquímicos específicos relacionados
em dois parâmetros de crescimento micro- à tolerância ao herbicida, os quais não são
bianos foram consideradas indicativas do constitutivamente expressos na ausência
efeito dos herbicidas sobre o coeficiente de desse composto. Interessantemente, embora
rendimento microbiano: (i) aumento da o paraquat tenha diminuído a capacidade de
duração da fase lag, em função da necessidade suporte do crescimento de A. brasilense em
da bactéria induzir mecanismos moleculares meio DIGs, esse produto reduziu a fase lag,
de tolerância ao estressor e (ii) aumento do comparativamente ao controle sem herbicida.
tempo de geração (crescimento exponencial), Esse decréscimo na duração da fase lag
em função do aumento da proporção dos também foi observado para diversos outros
recursos destinados aos custos de manutenção, herbicidas que não afetaram a capacidade de
em detrimento da produção de biomassa suporte do meio DIGs quanto ao crescimento
celular. Esses dois mecanismos foram testados de A. brasilense, como ametryn, amicarbazone,
pela estimativa do tempo da fase lag e do tempo [hexazinone + diuron], isoxaflutole e imazapic.
de geração, respectivamente.
Os tratamentos [trifloxysulfuron-sodium +
Dos quatro herbicidas que reduziram a ametryn] e glyphosate reduziram a velocidade
capacidade de suporte do crescimento de A. de crescimento de A. brasilense, o que foi
brasilense em meio DIGs, apenas a mistura evidenciado pelo aumento dos tempos de
[trifloxysulfuron-sodium + ametryn] aumentou geração dessa bactéria para valores médios de
a fase lag (Figura 2). De acordo com Gadagi 3,52 e 3,58 h, respectivamente (Figura 3). O
et al. (2004), o aumento da fase lag observado tempo de geração médio para A. brasilense em
durante a incubação de Azospirillum sp. na meio DIGs sem herbicidas foi de 2,56 h.
presença dos inseticidas endosulfan ou Paraquat e oxyfluorfen não afetaram a
monocrotophos pode ser devido à adaptação das velocidade de crescimento de A. brasilense.

0,90 25,0 **
Capacidade de suporte (D.O.)

0,80 *** ***


*** * ** * **
0,70 20,0 ***
***
0,60
Fase lag (h)

*** *** 15,0


0,50 ***
0,40 ***
10,0
0,30
0,20 5,0
0,10
0,00 0,0
metribuzin

MSMA
testemunha

ametryn

diuron

sulfentrazone
oxyfluorfen

2,4-D
trifloxysulfuron+ametryn
amicarbazone

hexazinone+diuron

clomazone

S-metolachlor
glyphosate
hexazinone+clomazone

isoxaflutole

imazapic
imazapyr
paraquat

2,4-D
ametryn

diuron
metribuzin

sulfentrazone

MSMA
testemunha

oxyfluorfen
hexazinone+diuron

clomazone
isoxaflutole

S-metolachlor
glyphosate
trifloxysulfuron+ametryn
amicarbazone

hexazinone+clomazone

imazapyr
imazapic
paraquat

*** Significativo a 0,1% pelo teste de Dunnett. *, **, *** Significativo a 5%, a 1% e a 0,1% pelo teste de Dunnett,
respectivamente.
Figura 1 - Capacidade de suporte de crescimento de Azospirillum
brasilense, mensurado pela densidade ótica (DO = 450 nm), Figura 2 - Duração da fase lag de Azospirillum brasilense em
em meio contendo herbicidas utilizados na cultura da cana- meio contendo herbicidas utilizados na cultura da cana-de-
de-açúcar, nas respectivas doses comerciais. açúcar.

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4,5 de N. Segundo Jena et al. (1990), populações


4,0 *** *** de Azotobacter foram estimuladas em áreas
de arroz após a aplicação do herbicida
Tempo de geração (h)

3,5
3,0 thiobencarb.
2,5 **
Os demais herbicidas avaliados no estudo
2,0
não apresentaram efeito negativo sobre os
1,5 parâmetros de crescimento, o que está de
1,0 acordo com o trabalho de Salmeron et al. (1991),
0,5 que constataram que a adição do herbicida
0,0 metolachlor ao meio de cultura não alterou o
metribuzin

MSMA
ametryn

diuron

sulfentrazone crescimento de Azospirillum brasilense, embora

2,4-D
testemunha

oxyfluorfen

trifloxysulfuron+ametryn
amicarbazone

hexazinone+diuron

S-metolachlor
glyphosate
hexazinone+clomazone
clomazone
isoxaflutole

imazapyr
imazapic
paraquat

esse herbicida tenha causado efeitos deletérios


à atividade da nitrogenase, que desapareceram
após 48 h. Também, Nemes-Kósa & Cserháti
(1995) não detectaram nenhum efeito tóxico
do herbicida diuron sobre a espécie Azotobacter
chroococcum. No entanto, Madhaiyan et al.
**, *** Significativo a 1% e a 0,1% pelo teste de Dunnett,
(2006) observaram que o herbicida 2,4-D redu-
respectivamente.
ziu em 50% o crescimento de G. diazotrophicus
quando foi adicionado ao meio na concentração
Figura 3 - Tempo de geração de Azospirillum brasilense em
meio contendo herbicidas utilizados na cultura da cana-de- de 22 mg L-1.
açúcar. Os resultados observados com os herbi-
cidas oxyfluorfen e [trifloxysulfuron-sodium +
É importante observar que os valores de ametryn] sobre os parâmetros de crescimento
capacidade de suporte de crescimento de não foram regra para todos os herbicidas que
A. brasilense dos tratamentos paraquat, possuem mecanismos de ação similares, ou
oxyfluorfen, [trifloxysulfuron-sodium + seja, a avaliação de toxicidade deve ser por
ametryn] e glyphosate não se igualaram aos produto e não pode ser extrapolada ao meca-
observados no controle, mesmo após um nismo de ação, ou mesmo ao grupo químico.
período prolongado de incubação. Isso reforça Os herbicidas MSMA, paraquat e
a hipótese de que os recursos disponíveis no amicarbazone prejudicaram a fixação bioló-
meio de cultura foram menos eficientemente gica de nitrogênio (FBN) quando em contato
utilizados para o crescimento bacteriano (me- com a bactéria A. brasilense (Figura 4). A
nor coeficiente de rendimento) na presença magnitude dessas reduções foi severa, princi-
desses herbicidas do que nos demais trata- palmente no caso do paraquat, pois foi neces-
mentos. Sugere-se que o menor coeficiente sário apenas 1,0 g ha-1 desse herbicida para
de rendimento de A. brasilense na presença que 50% da FBN fosse inibida, ao passo que,
de paraquat, oxyfluorfen, [trifloxysulfuron- para se obter o mesmo efeito, foram neces-
sodium + ametryn] e glyphosate derive do sários 133,1 g ha-1 de MSMA (Figura 5). Essas
custo energético requerido para manutenção doses estimadas pelas equações de regressão
de mecanismos celulares que conferem são muito baixas, quando comparadas com a
essa tolerância relativa da bactéria a esses dose normalmente aplicada desses herbicidas
herbicidas. Isoxaflutole reduziu levemente o nas diversas lavouras brasileiras (paraquat –
tempo de geração de A. brasilense, o que 300 a 600 g ha-1; MSMA – 1.422 a 2.880 g ha-1).
acarretou pequeno incremento na taxa de Esses resultados foram obtidos em meio de
crescimento de A. brasilense. Das & Debnath cultura (in vitro), onde o contato entre os
(2006) observaram que a aplicação do herbi- herbicidas e a bactéria diazotrófica é muito
cida oxyfluorfen em solo rizosférico em área estreito. Madhaiyan et al. (2006) reportaram
cultivada com arroz ocasionou aumento de que o herbicida 2,4-D, na sua dose recomen-
42,8% na população de microrganismos dada, ocasionou 59,8% de redução na ativi-
fixadores de N aeróbios não simbióticos, com dade de nitrogenase de Gluconacetobacter
consequente aumento de 37,5% na fixação diazotrophicus, enquanto os herbicidas

Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 29, p. 1079-1089, 2011. Número Especial


1086 PROCÓPIO, S.O. et al.

90
(nmol C2H2 h-1 por frasco) 70
(A)
80

ARA (nmol C2H2 h-1 por frasco)


Redução do acetileno

70 60

60 50
50 -0,00520846X
40 Ŷ = 62,0111 e
40 * R2 = 0,98
30 *** 30
20
*** 20
10
0 10
testemunha

sulfentrazone
ametryn

diuron
metribuzin

oxyfluorfen

2,4-D
MSMA
isoxaflutole
hexazinone+diuron

trifloxysulfuron+ametryn
imazapic
amicarbazone

clomazone

imazapyr

S-metolachlor
glyphosate
hexazinone+clomazone
paraquat

0
0 36 72 108 144 180 216 252 288
Dose (g ha-1)
70
(B)
60

ARA (nmol C2H2 h-1 por frasco)


50
*, *** Significativo a 5% e a 0,1% pelo teste de Dunnett,
respectivamente. -0,743154X
40 Ŷ=3,35605 + 58,2669 e
R2 = 0,99
Figura 4 - Atividade de nitrogenase (redução do acetileno a 30
etileno) por Azospirillum brasilense na presença de
herbicidas utilizados na cultura da cana-de-açúcar. 20

10

0
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
butachlor, alachlor e atrazine inibiram a
atividade de nitrogenase dessas bactérias em Dose (g ha-1)
22,8, 73,6 e 65,3%, respectivamente. Patnaik
& Rao (1994) relataram que a exposição de Figura 5 - Atividade da nitrogenase (redução do acetileno a
etileno) por Azospirillum brasilense na presença de doses
Azospirillum sp. ao herbicida 2,4-D estimulou
crescentes dos herbicidas MSMA (A) e paraquat (B). Dose
a fixação de N e o acúmulo de biomassa dessas de MSMA que inibe a atividade de nitrogenase da bactéria
bactérias diazotróficas. Esse resultado não em 50% = 133,1 g ha-1. Dose de paraquat que inibe a atividade
corrobora o de Rivarola et al. (1992), que apon- de nitrogenase da bactéria em 50% = 1,0 g ha-1.
taram inibição do crescimento celular de
Azospirillum brasilense na presença de con-
centração acima de 1 mM de 2,4-D. Segundo
ainda esse autores, essa inibição foi revertida com as formulações comerciais (Hassan et al.,
quando as bactérias foram transferidas para 2000), pois sabe-se que alguns adjuvantes re-
um meio livre do herbicida. duzem a tensão superficial e facilitam a
penetração do pesticida. Essa hipótese pode ser
É importante salientar que os dados obti-
confirmada pelos trabalhos que avaliaram o
dos no presente trabalho foram decorrentes da
crescimento de outras bactérias fixadoras de
utilização dos herbicidas na formulação
N sob efeito de diversas formulações comer-
comercial, ou seja, princípio ativo mais todos
ciais do herbicida glyphosate, uma vez que os
os demais ingredientes da formulação, tal
resultados variaram desde a insensibilidade
qual eles são comercializados e, consequente-
da bactéria à completa falta de crescimento,
mente, utilizados na agricultura. Conforme o
em função do produto testado (Santos et al.,
“Working Group Pesticides and Beneficial
2004, 2005a).
Arthropods” of the “International Organization
for Biological Control of Noxious Animals and Ainda sobre formulações comerciais,
Plants (IOBC), West Palaearctic Regional segundo Malkones (2000), os aditivos podem
Section (WPRS)”, os estudos de seletividade a afetar os microrganismos e, em certos casos,
organismos não alvo devem ser conduzidos até modificar o efeito do agroquímico. Para

Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 29, p. 1079-1089, 2011. Número Especial


Toxicidade de herbicidas utilizados na cultura da cana-de-açúcar ... 1087

Kishinevsky et al. (1988), é possível que radiação solar, deriva e ventos, amenizando a
solventes, surfatantes e agentes molhantes ação do princípio ativo (Cavalcanti et al., 2002).
presentes nas formulações comerciais de pes- Dessa forma, espera-se que produtos consi-
ticidas contribuam para os efeitos inibitórios derados compatíveis nesse tipo de teste tam-
desses produtos no crescimento de rizóbios – bém o sejam quando aplicados em campo.
um outro grupo de bactérias fixadoras de N.
O glyphosate e a mistura [trifloxysulfuron
Haahtela et al. (1988) também testaram o
+ ametryn] reduzem a velocidade de cres-
glyphosate puro e na formulação comercial
cimento (maiores tempos de geração) de
Roundup ® sobre vários microrganismos e
A. brasilense, enquanto MSMA, paraquat e
observaram que as concentrações entre 25 e
amicarbazone afetam negativamente a FBN
100 µg L-1 alteraram significativamente o cres-
dessa bactéria. Todavia, o impacto negativo
cimento de bactérias do gênero Enterobacter;
sobre a FBN é especialmente drástico na
entretanto, houve maior intoxicação quan-
presença do paraquat. Os demais herbicidas
do elas foram tratadas com a formulação
utilizados na cultura da cana-de-açúcar e
comercial na maior concentração. Berner
testados neste estudo apresentam alta sele-
et al. (1991) mencionaram que aplicações
tividade a A. brasilense, não alterando o
de glyphosate, em formulações com ou sem
crescimento e a atividade de FBN dessa
surfatante, inibiram o crescimento micelial
bactéria.
de Calonectria crotalariae.

Em campo, provavelmente, o contato entre LITERATURA CITADA


A. brasilense e os herbicidas MSMA e paraquat
deverá ser muito pequeno, pois esses herbi- ARRUDA, J. S.; LOPES, N. F.; MOURA, A. B. Behavior of
cidas, normalmente, não são aplicados direta- Bradyrhizobium japonicum strains under different herbicide
concentrations. Planta Daninha, v. 19, n. 1, p. 111-117,
mente sobre as plantas de cana-de-açúcar,
2001.
por não apresentarem seletividade satisfató-
ria a essa cultura, com exceção de algumas BALDANI, J. I. et al. A brief story of nitrogen fixation in
aplicações emergenciais de MSMA, quando as sugarcane – reasons for success in Brazil. Func. Plant Biol.,
plantas daninhas ultrapassam o estádio inicial v. 29, n. 4, p. 417-423, 2002.
de desenvolvimento. Ressalta-se também que
esses dois xenobióticos (MSMA e paraquat) não BERNER, D. K.; BERGGREN, G. T.; SNOW, J. P. Effects of
apresentam atividade no solo, não havendo glyphosate on Calonectria crotalariae and red crown rot of
portanto a possibilidade de serem absorvidos soybean. Plant Dis., v. 75, n. 8, p. 809-813, 1991.
pelas raízes das plantas de cana-de-açúcar e,
assim, entrarem em contato com as bactérias BODDEY, R. M. et al. Use of 15N natural abundance
que estão colonizando o interior da planta. technique for the quantification of the contribution of N2
fixation to sugar cane and others grasses. Aust. J. Plant
Esse comportamento é diferente daquele do
Physiol., v. 28, n. 9, p. 889-895, 2001.
amicarbazone, que apresenta boa seletividade
às plantas de cana-de-açúcar, podendo ser
CAVALCANTI, R. S. et al. Efeito dos produtos
aplicado sob suas folhagens, e também ativi- fitossanitários fenpropatrina, imidacloprid, iprodione e
dade prolongada no solo – fatores que favorecem tiametoxam sobre o desenvolvimento do fungo Beauveria
a absorção do produto pelas plantas de cana- bassiana (Bals.) Vuill. Arq. Inst. Biol., v. 69, n. 1, p. 17-22,
de-açúcar e, consequentemente, seu contato 2002.
com as bactérias diazotróficas. É importante
ressaltar que ensaios de campo são neces- COELHO, C. H. M. et al. Identificação de genótipos de cana-
sários para avaliar se esses herbicidas podem de-açúcar quanto ao potencial de contribuição da fixação
prejudicar a ação das bactérias diazotróficas biológica de nitrogênio. Agronomia, v. 37, n. 1, p. 37-40,
2003.
presentes no inoculante que será lançado para
uso na cultura da cana-de-açúcar. Testes
DAS, A. C.; DEBNATH, A. Effect of systemic herbicides on
in vitro mantêm o microrganismo exposto ao
N2-fixing and phosphate solubilizing microorganisms in
máximo ao produto fitossanitário, o que não relation to availability of nitrogen and phosphorus in paddy
ocorre em campo, já que há fatores externos soils of West Bengal. Chemosphere, v. 65, n. 6,
que agem sobre o produto, principalmente p. 1082-1086, 2006.

Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 29, p. 1079-1089, 2011. Número Especial


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