Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre.

Método de Sanger.
Bonilla Cruz Miriam, Hernández Juan Salvador – 3IM1 – Sección 3
hidrólisis ácida y fraccionar, mediante la ruptura
Objetivo: del enlace peptídico a cada uno de los
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las aminoácidos constituyentes de la proteína, pero
cadenas de la molécula de hemoglobina mediante el manteniendo estable la interacción entre el
método de Sanger. dinitrofenilo y el grupo amino.

Interpretación de cada paso efectuado en la
preparación del derivado dinitrofenilado.
 Se disolvió la proteína (hemoglobina) en 2.4mL
de bicarbonato de sodio al 4.2% con el fin de
preparar un medio de reacción alcalino, para
desprotonar al grupo alfa-amino libre y así
facilitar la reacción con el DNFB.
 Se repitió otra serie de extracciones con éter y
FeSO4, pero esta vez, la fase extraída y desechada
fue la acuosa, pues contenía derivados
dinitrofenilados polares con carga y en este punto
del procedimiento el aminoácido marcado ya era
no polar y se encontraba en la fase etérea, la cual
se recogió y colectó en un vaso de precipitados
para posteriormente evaporar el éter.

 Después de haber adicionado el DNFB se agitó  Finalmente se preparó un cromatograma y se

vigorosamente durante 1 hora, y de este modo se adiciono un poco de etanol a nuestro vaso de
llevó a cabo la dinitrofenilación, manteniendo un precipitados, para hidratar el DNP-aa.
pH entre 8 y 9 y con ellos formar un derivado
amarillo 2,4-dinitrofenil aminoácido (DNP-aa).
Esquema a escala 1:2 del cromatograma obtenido
 Posteriormente se ajustó el pH debajo de 3 con 12 y su interpretación. Escribir las condiciones del
gotas de HCl 3N, de esta manera protonar cromatograma.
nuevamente el nitrógeno del amino terminal y
proteger al enlace C-N, para que al hidrolizar a la
proteína no se rompa este enlace.

 Se realizaron 4 extracciones de la suspensión

amarilla obtenida, a través de una solución de éter
saturado con sulfato ferroso (FeSO4) para
eliminar la fracción de DNFB que no había
reaccionado con el aminoácido mencionado ni
con el resto de grupos imidazol susceptible a
dicho reactivo que pudiesen estar presentes en la
cadena polipeptídica de la hemoglobina. En la
fase acuosa estaban contenidos el DNP-aa de
interés y demás derivados dinitrofenilados a
causa de su alta polaridad, de tal manera que, en
la fase orgánica color café, se colectó el DNFB
Resultados de los valores de Rf obtenidos, en
sobrante y se extrajo.
forma de tabla.
 Se colocó el tubo que contenía a la proteína en Muestra Rf
baño maría y se agitó para evaporar los residuos DNP-Phe (23.6/40.2) ) = 0.587
de éter que pudiesen haber quedado. DNP-Val (27.6/40.2) = 0.686
DNP-Ala (23/40.2) = 0.572
 Se añadieron 5 mL de HCl 6N al tubo que DNFB (18.2/40.2) = 0.452
contenía la proteína dinitrofenilada y se le Fase etérea (27.5/40.2) = 0.684
sometió a una presión de 15 lbs/in2 en autoclave Fase acuosa /
durante 3 horas con la finalidad de realizar una
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Método de Sanger.
Bonilla Cruz Miriam, Hernández Juan Salvador – 3IM1 – Sección 3
Discusión. La identificación de los PHT-aminoácidos es
Al obtener los valores de Rf, observamos que la usualmente llevada a cabo por RP-HPLC. Debido a
marca de muestra del extracto etéreo y la marca de la que este método requiere del grupo amino libre, los
muestra de DNP-Val nos dan valores muy similares, grupos protectores utilizados en la síntesis para
por lo que podemos concluir que la Valina es el proteger al α-amino deben ser removidos o de otra
aminoácido N-terminal de la proteína hemoglobina, forma no será posible analizar el péptido sintetizado
lo cual concuerda con la bibliografía consultada. mediante la degradación de Edman.
Del extracto acuoso no obtuvimos marca para Debido a que se tienen que realizar muchos pasos de
calcular un Rf, esto puede ser debido a que al colocar reacción y muchas determinaciones, normalmente
la muestra no se colocó la suficiente cantidad de hoy día este método se lleva a cabo mediante
muestra para que hubiera un corrimiento de la analizadores automáticos o secuenciadores que
mancha. mezclan reactivos en las proporciones adecuadas,
En el extracto etéreo también obtuvimos una mancha separa los productos, los identifica y registra los
que nos proporcionó un Rf parecido al del DNFB, resultados.
esto pudo ser causado por un error en la extracción de
la muestra.

Conclusiones.
La valina es el aminoácido con grupo alfa-amino
terminal de la hemoglobina.

Bibliografía.
Nelson, D.L. y Cox, M.M. Lehninger “Principios de
Bioquimica” 4ª Ed.
Berg Jeremy M.; Tymoczko John L.; Stryer Luber.
Biochemistry.

Preguntas extra.
Método de Edman
Este método para determinar la secuencia de
aminoácidos en un péptido o proteína puede se
utilizado para analizar un péptido sintético incluso si
este aún se encuentra adherido a la resina; no produce
datos útiles en la región C-terminal. Consiste en la
degradación repetitiva de los péptidos a partir de una
reacción con el grupo amino terminal libre y con el
fenil isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas
suaves formando feniltiocarbanilo, el producto
entonces es tratado con ácido fluorhídrico para liberar
el aminoácido que ha reaccionado del resto de la
cadena peptídica mediante la formación de un
derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un
derivado más estable por la adición de TFA. Como
consecuencia el péptido tiene ahora un nuevo residuo
amino terminal listo para repetir el ciclo.