Química analítica

Se divide en QA cualitativa, la cual determina lo que se encuentra en una muestra y QA

cuantitativa, la cual determina cuánto de lo que busco hay en una muestra.
Una muestra es una porción de la totalidad, por lo tanto, debe ser representativa del
total. Es vital para el análisis y se debe conservar en condiciones adecuadas de pH, T y
osmolaridad. Existe una metodología específica de recolección: (1) Toma de la muestra,
en donde se considera que debe ser representativa; (2) Mantenimiento de sus
condiciones; (3) Medición; (4) Resultado que debe ser fidedigno (lo más verdadero
posible). Ej. sangre, suelo, etc.
Un analito es todo aquello que quiero medir en una muestra. El mismo puede poseer
interferencias que pueden modificarse, eliminarse o no eliminarse. Cuando ocurre esta
última situación se utilizan técnicas de fraccionamiento y purificación con el objetivo
de deshacerse de esas interferencias. Mediante la fracción se descartan la mayoría de
cantidad de interferencias y con la purificación se descarta la totalidad de las mismas.
La evaluación se realiza calculando el rendimiento (medición actividad total) y la
purificación (medición actividad específica). En la purificación, generalmente se pierde
analito, por lo tanto, se elige un método dependiendo de lo que se necesite, ya que a un
mayor rendimiento hay menor purificación y a una mayor purificación hay menor
rendimiento. En el rendimiento importa la cantidad de actividad inicial total y la
cantidad de actividad final total, sin estar referido al resto de la muestra, sólo al analito.
En la purificación importa la totalidad de la muestra, no sólo el analito.
Existen 2 tipos de reactivos:
a) Generales: identifica muchos grupos de sustancias.
b) Selectivos: identifica algunos tipos de sustancias.
c) Específicos: identifica una sustancia específica. Ej. anticuerpo monoclonal.

𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 % = × 100
𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
861
𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 % = × 100 = 35%
2460

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝑣𝑜𝑙ú𝑚𝑒𝑛 × 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 210 × 18 = 3780

𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 =
𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
2460
𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 = = 0,66
3780
𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑃𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
105
𝑃𝑢𝑟𝑖𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = = 161,5
0,65

1
 Técnicas de centrifugación

La centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza de centrifugación para separar y

purificar mezclas de partículas biológicas en solución. Es una técnica utilizada para el
aislamiento y análisis celular, de fracciones subcelulares, de complejos
supramoleculares y el aislamiento de macromoléculas (ej. proteínas y ácidos nucleícos).
Este método es empelado en casi todas los estudios subcelulares invasivos.
La centrifugación analítica se refiere principalmente al estudio de macromoléculas
purificadas y al aislamiento de supramoléculas. Es utilizada para la separación de
tejidos, de células, de estructuras subcelulares, membranas de vesículas y otras
partículas de interés biológico.

Principios de sedimentación: La estructuras biológicas cuando se encuentran bajo la

aceleración de un campo de centrifugación incrementan su sedimentación. Se establece
las siguientes pautas cuando se piensa en un protocolo de sedimentación:
 La estructura biológica con mayor densidad, es aquella que sedimenta más rápido
en el campo de sedimentación.
 Mientras más masa tenga una estructura biológica más rápido se mueve en el
campo.
 Mientras más denso sea el sistema de buffer biológico más lento se mueve la
partícula en el campo.
 Mientras más grande es el coeficiente de fricción (el cual depende del tamaño y
forma de la partícula) más lento se mueve la partícula.
 Mientras más grande es el campo de centrifugación más rápido sedimenta la
partícula.
 La tasa de sedimentación va a ser 0 cuando la densidad de la partícula y la del
medio que la rodea sea igual.
La tasa de sedimentación depende del campo de centrifugación
aplicado (G), que está determinado por el radio del rotor y por la 𝐺 = 𝜔2 𝑟
velocidad angular del rotor (ω). Su fórmula es:
La unidad del coeficiente de sedimentación es en segundos pero se utiliza el Svedberg
que es igual a 10 ¯¹³.
La velocidad de sedimentación es aquella velocidad en la
que una partícula tarda en llegar al fondo dependiendo de 2 𝑟𝑝2 (𝛿𝑝− 𝛿𝑠𝑣)𝜔 2 𝑟
𝑉= 𝑥𝑔
su densidad (de la partícula y viscosidad (η) del medio), 9 𝜂
masa y forma (radio). El rp es lo que caracteriza a la
velocidad de sedimentación Se establece la siguiente relación:
La tasa de sedimentación puede ser expresada como el coeficiente de sedimentación, el
cual depende directamente de la masa de la partícula.
𝑉
𝑆= 2
𝜔 𝑟

2
Tipos de centrífugas: Existen características comunes a todas las centrífugas, el
principal es el motor central que gira un rotor que contiene las muestras que van a ser
separadas. Las partículas de interés bioquímico son suspendidas en una solución buffer,
que es colocado en tubos específicos en compartimientos localizados en rotores
específicos. El medio del buffer es elegido para cada centrifugación y generalmente es
diferente, en cuanto a pH, la salinidad, etc. Se establece este medio con el objetivo de
preservar las funciones biológicas. Las diferencias que se pueden establecer entre
centrífugas son:
 La velocidad máxima a la que se someten las muestras para la sedimentación.
 La presencia o ausencia de vacío.
 El potencial de refrigeración o la manipulación general de la T durante la
centrifugación.
 El volumen máximo de muestras y la capacidad de tubos individuales para la
centrifugación.
De esta forma se pueden dividir las centrífugas en:
a) Microcentrífugas: las cuales centrifugan pequeños volúmenes de muestra en tubos
Eppendorf (Ej. células de la sangre). Proveen campos de centrifugación de
aproximadamente 10000 g y la sedimentación de muestras biológicas en minutos.
También son utilizadas para la concentración de muestras de proteínas.
b) Centrífugas de larga capacidad: poseen un máximo de campo de centrifugación
entre 3000 a 7000 g. Pueden ser utilizadas con varios tipos de contenedores (5 a
250 cm³). Se utiliza para la precipitación de las células enteras
c) Centrífugas de alta velocidad de refrigeración: son esenciales para la precipitación
de proteínas, organelas (núcleos, mitocondrias o cloroplastos), desechos celulares
derivados de la homogenización de tejidos y microorganismos. Crean campos de
centrifugación de 100000 g.
d) Ultracentrífugas: crean campos de 900000 g. Es utilizado para la determinación de
la masa molecular de macromoléculas aisladas o las propiedades termodinámicas
de una proteína u otras biomoléculas.

Tipos de rotores: los rotores de baja velocidad están hechos de acero o latón, mientras
los rotores de alta velocidad están hechos con aluminio, titanio o compuestos reforzados
con fibra. El exterior de rotores específicos puede estar pintado con pinturas protectoras.
Se dividen en:
a) Rotores de ángulo fijo: son una herramienta para la granulación durante la
separación diferencial de partículas en las cuales sus grados de sedimentación
difieren significativamente. Ej. núcleo, mitocondria y microsomas. Los tubos de
centrifugación son colocados en un ángulo entre 14º y 20º. Las partículas se
mueven radialmente hacia afuera en el ángulo del campo, sólo deben viajar una
corta distancia hasta que llegan a su posición isopícnica (utilizando una técnica
isopícnica) o hasta que se chocan con la pared del tubo (si se utiliza un método de
centrifugación diferencial).

3
b) Rotores verticales: se pueden dividir entre verdaderos rotores verticales o rotores
casi verticales. Los tubos son colocados paralelamente al eje de rotación y son
restringidos a las cavidades de los rotores por tornillos. Los rotores casi verticales
poseen un ángulo de 7º o 10º y también utilizan tubos de rápido sellado. Esta última
es utilizada para la centrifugación de elementos biológicos que no participan
adecuadamente en los gradientes convencionales.
c) Rotores swinging-bucket: son utilizados pasadores de bisagras o travesaños para
colocar los cubos de los rotores. Los tubos son posicionados de forma vertical y
durante la fase de aceleración inicial, los cubos oscilan hasta una posición
horizontal y ellos solos se posicionan en el soporte del rotor.

Centrifugaciones preparativas

a) Centrifugación diferencial: este método se fundamenta en los diferentes grados de

sedimentación de las partículas biológicas de diferentes formas y densidades. Las
organelas, las membranas de vesículas u otras estructuras son divididas en
diferentes fracciones mediante el incremento de campos de centrifugación. La
sedimentación va a depender de la velocidad y tiempo de los pasos de
centrifugación y la densidad y el tamaño relativo de las partículas. Los desechos
celulares granulosos deben ser rehomogeneizados y recentrifugados.
Se utiliza un tejido inicial (muestra) que se coloca en un buffer (medio isotónico)
para no afectar la integridad de la muestra. El primer producto que se obtiene es el
homogenato, el cual posee inhibidores. Luego, se homogeniza y se filtra. Por último
se realiza la centrifugación diferencial. Inicialmente, todas las partículas del
homogenato están distribuidas en el tubo de centrifugación y se desplazan al fondo
del mismo según su coeficiente de sedimentación (las más grandes forman gránulos
en la parte inferior y las más pequeñas en el supernadante). Para evitar la
contaminación cruzada (causada por pequeñas partículas atrapadas en los gránulos
de mayor tamaño) el homogenato es lavado varias veces (mediante la resuspensión
en el buffer) y luego centrifugándolo. Sin embargo, la repetición de lavados puede
disminuir el rendimiento de la fracción de pellet. El supernadante se debe
centrifugar a más altas velocidades durante períodos más largos para separar las
partículas medianas y pequeñas. Mediante este método se pueden separar
mitocondrias y microsomas.
b) Centrifugación en gradiente de densidad: se utiliza para separar partículas
biológicas con un tamaño similar pero con una diferente densidad. Se utiliza un
método con ultracentrífugas con un rotor de swinging-bucket y un gradiente de
densidad. Se coloca una preparación con diferentes tipos de partículas sobre un
líquido con un gradiente de densidad. En este caso la densidad del gradiente debe
superar a la densidad de la partícula más densa y se utiliza sacarosa ultra pura libre
de DNasas, RNasas y proteasas. Se utiliza el cloruro de Cesio para separar ADN,
plásmidos, nucleoproteínas y viruses y se utiliza Bromuro/Ioduro de Sodio para
separar lipoproteínas y moléculas de ADN.

4
c) Fracción subcelular: El proceso consiste en repetidas centrifugaciones a
velocidades cada vez más altas y más duraderas para poder separar los diferentes
componentes del homogenato. Los valores típicos para los diferentes pasos de la
centrifugación son:

Minutos Velocidad Producto

10 600 Núcleo - Citoesqueleto
Mitocondria - Cloroplastos - Lisosomas -
15 1500
Peroxisomas
60 10000 MP - Fragmentos de RE - Vesículas - Microsomas
120 300000 Ribosomas - Virus - Macromoléculas
Citosol

La contaminación cruzada de las membranas vesiculares es un problema inevitable

durante la fracción subcelular. Para recolectar las bandas de la fracciones
subcelulares se puede hacer mediante la utilización de una micropipeta. En el caso
de no haber gradientes inestables se debe utilizar un colector de fracciones
automático o se puede reemplazar el líquido con uno de mayor densidad.

Centrifugación analítica: La sedimentación de proteínas aisladas o ácidos nucleícos

puede ser útil para la determinación del peso molecular (el cual depende del radio de la
molécula), el coeficiente de sedimentación (es utilizado para caracterizar las diferentes
conformaciones de macromoléculas en condiciones experimentales, diferente pH, T,
etc.), forma (distintas conformaciones resultado de la interacción entre moléculas) de las
biomoléculas. No se fracciona ni purifica. La centrifugación analítica es utilizada para:
 Determinación de la pureza de macromoléculas.
 Determinación del peso molecular de los solutos en sus estados originales.
 Examinación del peso molecular en los complejos supramoleculares.
 Detección de cambios conformacionales.
 Estudios de la unión del ligando.
La ultracentrifugación analítica puede realizarse por el:
a) Enfoque de la velocidad de sedimentación: es utilizado para estimar la pureza de
la muestra. El mismo se realiza midiendo el gradiente del índice refractario en
cada punto de la ultracentrifugación de la célula en diferentes intervalos de
tiempo. De esta forma se forma un sedimento simétrico formado por las
partículas con pesos moleculares y formas similares. Mediante este método se
puede identificar los diferentes contaminantes de una muestra basándose en la
asimetría de los mismos.
b) Equilibrio de sedimentación: es utilizado para determinar el tamaño de las
subunidades de un complejo y la estequiometria de un complejo bajo diferentes
condiciones. Las partículas con diferentes peso molecular, forma o tamaño
migran en diferentes velocidades a través del campo de centrifugación.

5
 Precipitación fraccionada

Es un método crudo, no es muy específico. El mismo aprovecha la solubilidad

(capacidad de un st de disolverse en un sv, dependiendo de las interacciones del st con
el sv) de la molécula en el medio. Cuando se generan interacciones mayores entre el sv
y el st que el st con el st se genera una dilución.
Este método apela a la disolución diferencial, en donde el punto de solubilidad es aquel
en donde hay máximo de st, lo que se denomina solución saturada. Se dice que una
solución es insaturada cuando puede recibir más st. Una solución sobresaturada es
aquella que posee más cantidad de st en sc de lo que le correspondería al punto de
solubilidad (es inestable porque toda solución tiende a la solubilidad).
Las proteínas difieren en el balance de grupos aminos (los cuales poseen las
características de estar cargados, ser polares e hidrofóbicos) que se encuentran
distribuidos en su superficie. Los grupos cargados y polares son solvatados por
moléculas de agua. Existen métodos de precipitación en los cuales hay que tener en
cuenta que siempre se desnaturalizan proteínas:
 Precipitación fraccionada con sal: está basada en el principio de que a medida
que se aumenta la concentración salina disminuye la solubilidad, salting out, en
donde la sal comienza a competir con las proteínas por el agua y al poseer una
mayor afinidad que éstas provoca la disolución de la sal y que las proteínas
interactúen entre ellas y precipiten. Existe otro principio denominado salting in,
en el cual se coloca una cantidad mucho menor de sal que provoca una mejor
dilución de la proteína. Esto ocurre ya que las proteínas en disolución se
encuentran unidas por su afinidad y al colocar la sal que posee una mayor
afinidad por las proteínas, produce que estas se separen. La sal utilizada es el
sulfato de amonio (NH₄)₂SO₄. Para graficar este tipo de precipitación se utiliza
el log de la solubilidad en base a la FI (fuerza iónica), que representa a la
sumatoria del producto entre la carga y la concentración de
partículas iónicas. Posee unidad de (mM). 𝐵 = 𝑙𝑜𝑔𝑆 + 𝐾𝐼 .
Para la utilización del amonio se usa la serie de Hofmeister
la cual implica la generación de una solución con alta M de
sulfato de amonio. Para medir el volumen de solución
saturada a utilizar se utiliza el % de sulfato de NH₄, que es
el % de solución saturada de sulfato de amonio que se
% 𝑆𝑓−𝑉𝑠𝑓
coloca en un volumen. 𝑉𝑠𝑠 = .
100−% 𝑆𝑓
 Precipitación fraccionada con solvente orgánico: se basa en diferencias de
solubilidad de las proteínas en soluciones acuosas que contienen solventes
orgánicos miscibles como el etanol. La precipitación ocurre porque el solvente
establece uniones de puente de H con el agua provocando que las proteínas
expongan sus grupos cargados produciendo la interacción entre estas y su
precipitación. A su vez, se desestabilizan las uniones intramoleculares lo que
produce el desenrollamiento y precipitación.

6
Ej. de gráfico de precipitación fraccionada con sal

Se puede observar que cuando

hay un 40% de sulfato de NH₄
presente en la solución ocurre
la precipitación del 90% de las
proteínas presentes sin perder
la actividad enzimática de la
proteína de mi interés.

 Precipitación fraccionada isoeléctrica: está basada en la observación de que las

proteínas poseen su mínimo de solubilidad en su pI (pH en el cual el número de
cargas positivas y negativas son iguales), por lo tanto las repulsiones
intermoleculares son mínimas y las proteínas pueden interaccionar entre sí. Este
principio permite a cargas opuestas de diferentes moléculas interactúen
resultando en la formación de precipitados insolubles. Se puede utilizar tanto
como para remover una proteína no deseada (ajustando el pH de la misma hasta
su pI para causar su precipitación pero no, el de mi proteína de interés) o
ajustando el pH hasta su pI de la proteína de mi interés para causar la
precipitación de esta.

La metodología de las técnicas de precipitación fraccionada consiste en

(1) Precipitación de las proteínas utilizando los reactivos necesarios.
(2) Centrifugación mediante el método necesario.
(3) Lavamos la solución mediante la utilización de soluciones con % de sulfato de NH₄
decrecientes.
(4) Diálisis y lavado de sobrenadante. Este proceso se realiza con una bolsa de diálisis
(bolsa de plástico con un poro determinado), la cual debe poseer un poro de un tamaño
suficiente para dejar pasar la sal pero no las proteínas. Se realiza un cambio del medio
del sobrenadante, de esta forma liberando de sales a la precipitación, por el medio en el
que se colocó la bolsa de diálisis.
(5) Se realiza una búsqueda de la proteína de interés, tanto en el precipitado como en el
sobrenadante, mediante alguna técnica de identificación.

7
 Electroforesis

La electroforesis describe la migración de partículas cargadas bajo la influencia de un

campo eléctrico. Muchas moléculas biológicas (aminoácidos, péptidos, proteínas,
nucleótidos y ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables, por eso, bajo ciertos valores
de pH pueden estar presentes como cationes o aniones. Bajo la influencia de un campo
eléctrico las partículas van a migrar al cátodo o ánodo dependiendo de la naturaleza de
su carga. El equipamiento requerido es una fuente de poder y una cuba de electroforesis,
las cuales pueden ser para geles verticales u horizontales. El otro elemento importante
es el soporte que puede ser papel para electroforesis, acetato de celulosa o gel de
agarosa o poliacrilamida. En las cubas horizontales se utiliza papel o gel de agarosa y en
la vertical el gel de poliacrilamida.
La electroforesis se realiza en un buffer apropiado, el cual es esencial para mantener las
constante el estado de ionización de las moléculas que se quieren separar. Sin embargo,
el calor que se disipa por el mismo proceso y el flujo electroosmótico (presencia de
grupos cargados en la superficie del medio del soporte) son fenómenos que pueden
afectar a la electroforesis.
La movilidad electroforética (µ) de un ión representa al radio de la velocidad de un ion
𝑉
en un campo de fuerza eléctrico. µ = 𝐸 . Cuando una diferencia de potencial es
aplicada, las moléculas con diferencias de carga comienzan a separarse según sus
movilidades de electroforesis. Incluso las moléculas con cargas similares comienzan a
separarse ya que los diferentes tamaños moleculares experimentan diferentes fuerzas de
rozamiento.

Medios de soporte

a) Gel de agarosa: la agarosa es un polisacárido lineal formado por la repetición de

la unidad de agarobiose. El mismo se realiza suspendiendo agarosa deshidratada
en un buffer acuoso. Posee la característica de poder controlar el tamaño del
poro en el gel mediante el control de la concentración inicial de agarosa; los
poros con un tamaño mayor poseen poca concentración de agarosa y los poros
más pequeños poseen concentraciones más altas de agarosa. Una ventaja de este
gel es que posee la habilidad de fusionarse a bajas T.
b) Geles de poliacrilamida: están formados por la polimerización de la acrilamida
en la presencia de pequeñas concentraciones de N, N’-metilen-bisacrilamida, o
mejor llamada bisacrilamida. Este tipo de gel está definido por el porcentaje
total de acrilamida presente, en donde el poro del gel puede cambiar variando la
concentración de la acrilamida y bisacrilamida. Se pueden preparar con un rango
de entre 3% y 30% de acrilamida, los poros más grandes se forman con un 4%
de acrilamida (se utilizan para la electroforesis de proteínas); los geles entre 10%
y 20% de acrilamida forman poros más pequeños y son utilizados para la
separación de proteínas por su tamaño (SDS-gel electroforesis).

8
 Tipos de electroforesis

a) Electroforesis de gel de poliacrilamida - dodecilsulfato sódico (SDS): Se la denomina

SDS-PAGE es el método más utilizado para el análisis de mezclas de proteínas
cualitativamente. Está basado en la separación de proteínas por su tamaño, por eso, se
utiliza para determinar la masa molecular de una proteína. SDS es un detergente
aniónico. Las muestras son hervidas en un buffer que contiene β-mercaptoetanol y
SDS. El mercaptoetanol reduce los puentes disulfuro presentes en la estructura terciara,
los cuales la mantiene unida, por lo tanto, se desnaturaliza. El buffer de la muestra
también contiene un marcador de frente de corrida, que es un colorante de seguimiento
ionizable (azul de bromofenol) que corre a una mayor velocidad que las proteínas,
sacarosa/ glicerol (lo que aumenta su densidad). La muestra que se va a separar no se
coloca directamente en el gel separador (posee una función de separación y tiene una
longitud de 5 cm), éste se vierte entre las placas de vidrio y se espera hasta que se
asiente. Por encima de este se coloca el stacking gel (longitud de 0.8 cm y tamaño del
poro de 4% de acrilamida), el cual posee una función de producir una interfase de las
proteínas antes de que ingresen al gel separador. Un “peine” es colocado en la solución
de este gel previo a su polimerización para proveer el espacio para 10 muestras, las
cuales se encuentran en un buffer que hace que las proteínas se encuentren cargadas (+
o -) y se dirijan al polo opuesto. La conexión entre el gel y el electrodo del buffer es a
través de un paño grueso de papel de filtro. Cuando la corriente es encendida todas las
especies de iones deben de migrar a la misma velocidad o si no, se puede romper el
circuito eléctrico. Por lo tanto, se deben ajustar las concentraciones de los aniones,
cationes y de los complejos SDS-proteicos, de forma tal, que haya una baja
concentración de los últimos para que puedan formar una interfase entre los cationes y
aniones.
A medida que las proteínas pasan a través del gel de separación se separan según las
propiedades de tamizado molecular del gel Mientras más pequeña es la proteína más
fácil puede atravesar los poros del gel, mientras que las proteínas más grandes son
retardadas por la resistencia friccional. El bromofenol al ser una molécula muy pequeña,
por lo tanto, no es retrasado por los poros. Cuando éste llega al fondo de gel, se apaga la
corriente y el gel es removido de las placas y es agitado en una solución de tinción
(Coomassie Brilliant Blue). Luego se coloca en una solución decolorante, la cual
remueve el tinte del fondo del gel dejando las proteínas visibles de un color azul con un
fondo claro.
Mediante este método se puede determinar la masa de una proteína desconocida en
comparación con la movilidad de un número de proteínas estándar en las cuales se
conocen su masa. Ambas se corren en un mismo gel. Se construye una curva de
calibración en base a la relación entre la distancia recorrida y el log de la masa de cada
proteína (se establece una relación lineal).

9
b) Gradiente de gel: se utiliza un sistema de gel de poliacrilamida que no posee un tamaño
de poro uniforme, se establece un gradiente en la concentración de la acrilamida que
varía entre el 5% hasta el 25% desde la parte superior hasta la parte inferior del gel. En
la parte superior del gel van a haber poros grandes pero a medida que la muestra se
mueve a través del gel la concentración de la acrilamida va aumentando paulatinamente
y en consecuencia el tamaño del poro va decreciendo. El gradiente de gel es corrido con
un stacking gel como con el SDS gel. La primera ventaja de este método es que se
pueden separar un rango mucho mayor de proteínas según su masa. La segunda ventaja
es que las proteínas con masas similares pueden ser separadas, ya que a medida que la
proteína va recorriendo el gel el poro va disminuyendo hasta encontrarse con su poro
límite. Esta proteína se queda en ese punto y forma una banda. Una proteína con masa
similar pero más pequeña va a poder ser capaz de viajar más hasta alcanzar su poro
límite y ahí va a formar su respectiva banda.
c) Gel de foco isoeléctrico (IEF): el método es utilizado para la separación de sustancias
anfipáticas (proteínas) ya que se basa en la separación de moléculas según su punto pI.
Es muy utilizado para el estudio de la heterogeneidad de una proteína. Posee una gran
resolución, proteínas que difieren en un 0,01 unidad de pH pueden ser separadas. Se
utilizan geles horizontales. La separación se realiza mediante la aplicación de una
diferencia de potencial a través de un gel que contiene un gradiente de pH. El gradiente
de pH es formado por la introducción de anfolitos (mezclas de ácidos
poliaminopolicarboxilicos sintéticos) en el gel. Se utilizan generalemnte geles de
poliacrilamida (4%) o gel de agarosa.
Para preparar un gel (IEF) se mezclan carrier anfolitos (de un rango de pH) y
riboflavina con una solución de acrilamida y se coloca en una placa de vidrio. La
segunda placa es colocada por encima de la primera y el gel es polimerizado mediante
la fotopolimerización (colocar el gel enfrente de una luz brillante). Los electrodos están
recubiertos de pedazos de papel del filtro mojado y son colocados en cada extremo del
gel y la diferencia de potencial es aplicada. Luego, la corriente se apaga y se coloca
sobre el gel pequeños cuadrados de filtro de gel con la muestra. Dependiendo del punto
de pH en donde se colocaron las muestras, las proteínas que tengan un pH por debajo de
su pI van a estar cargadas positivamente y van a migrar hacía el cátodo. La carga
positiva va a ir decreciendo de acuerdo con su llegada al punto en donde su pH es igual
a su pI. En ese momento se va a convertir en un zwitterion (no posee carga neta) y su
movimiento va a cesar. Por otro lado, las proteínas que tengan su pH por arriba de su pI
van a estar cargadas negativamente y van a migrar al ánodo hasta que su pI se convierta
en estacionario.
El gel debe estar teñido para detectar las proteínas, se lo tiñe con Coomassie Brilliant
Blue y luego se lo decolora.
El pI de una proteína puede ser determinado corriendo una mezcla de proteínas que se
sabe su pI en el mismo gel. Se establece una curva de calibración producto de la
relación entre la banda producida por las proteínas en las cuales sabíamos su pI en
función de su pI.

10
d) Electroforesis de dos dimensiones de gel de poliacrilamida: esta técnica combina las
técnicas de IEF (primera dimensión) que separa a las proteínas según su carga (pI) y la
otra técnica de SDS-PAGE (segunda dimensión) que separa a las proteínas según su
tamaño. El gel de la primera dimensión contiene anfolitos (que conforman el gradiente
de pH), urea 8M y un detergente no iónico, estos últimos poseen la característica de
desnaturalizar proteínas y mantener la solubilidad de estas. Las proteínas
desnaturalizadas se separan en el gel según su punto isoeléctrico. Las tiras de IFE son
incubadas en un buffer que contiene SDS y luego son colocadas entre dos placas de
vidrio y en la parte superior un 10% gel de SDS-PAGE. Comienza la electroforesis y las
proteínas corren a través del gel y se separan según su tamaño.
e) Electroforesis con acetato de celulosa: es utilizado para el análisis de muestras de suero.
Esta técnica posee las características de que tiene un medio homogéneo, un tamaño de
poro uniforme y una resolución buena. El acetato de celulosa es mojado en un buffer de
electroforesis y la muestra es colocada en forma de una banda ancha de 1 cm
aproximadamente a un tercio del camino de la tira de acetato de celulosa. El final de la
tira hace contacto con el buffer de electroforesis por medio de una mecha de papel de
filtro que se superpone en el final de la tira de acetato de celulosa y se realiza la
electroforesis. Luego de la misma la tira es teñida y después decolorada para visualizar
las bandas.

11
 Técnicas inmunológicas

Vocabulario

 Antígeno: sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmune y es lo que un

anticuerpo reconoce y se une.
 Epitope: sitio del antígeno al cual se unirá un anticuerpo y el mismo reconocerá.
 Anticuerpo: proteína con función inmunológica.
 Divalente: anticuerpo que se une a dos moléculas de antígeno.
 Monovalente: anticuerpo que se une sólo a una molécula de antígeno.
 Clon: una población de células que derivan de la misma célula madre por medio
de reproducción asexual, por ende, son todas iguales a menos que haya una
mutación.
 Linfocitos: células que se asocian al mantenimiento inmunológico. Son una
subdivisión leucocítica.
 Multivalente: anticuerpo que se une a varias moléculas de anticuerpo.
 Mieloma: células cancerosas del linaje de células plasmáticas.
 Suero: fluido que deriva de sangre coagulada y tiene diversos componentes (ej.
anticuerpos).

Introducción

El sistema inmune animal es responsable de elaborar respuestas contra moléculas ajenas

al organismo. Una respuesta inmune puede ser:
 Innata: el sistema inmune no tuvo contacto previo con el patógeno y la respuesta
se media por macrófagos y leucocitos sobretodo; una respuesta innata es no-
específica pero potente, rápida y constituye una primera línea de defensa
 Adquirida: el sistema inmune fue expuesto a lo extraño: el patógeno; este tipo de
respuestas es mediada por linfocitos y se divide en:
o Mediada por células: este tipo de respuesta se debe a los linfocitos T que
interactúan con los antígenos de lo extraño de manera específica y
desatan una serie de procesos inmunológicos en contra de ellos; este tipo
de respuesta no es muy usada en bioquímica.
o Humoral: este tipo de respuesta es mediada por proteínas solubles
llamadas anticuerpos que circulan en sangre. Los anticuerpos son
producidos y secretados por los linfocitos B, pero la producción de estos
se ve ayudada por otras células linfocíticas, los T-helpers. Los
productores más importantes y potentes de anticuerpos son las células
plasmáticas, un tipo específico de linfocito B diferenciados. Los
anticuerpos demuestran una gran afinidad, especificidad y sensibilidad
por los antígenos de lo extraño. Este tipo de respuesta se utiliza mucho.

12
Anticuerpos

Los anticuerpos son un tipo de proteínas globulares conocidos como inmunoglobulinas.

Estas comprenden monómeros o multímeros de una cadena básica de 4 aminoácidos,
una estructura lateral simétrica y contienen dos cadenas livianas y dos pesadas. Las
pesadas pueden variar de 5 maneras dando origen a los distintos tipos de
inmunoglobulinas (IgD, IgM, IgG, IgA, IgE); todos los tipos de Ig pueden unirse a
antígenos pero la función varía; la IgG y la IgA tienen a su vez sub clases por tener
cadenas pesadas con distinta secuencia de aminoácidos (pero menos diferentes que para
considerarlas otra categoría). La cadena liviana no es de gran importancia inmunológica
pero si ayuda en la unión con antígenos y con la estabilidad de la Ig. La IgG y la IgA
tienen a parte una pequeña proteína llamada j.
Las Ig se pueden clivar con enzimas proteolíticas para obtener fragmentos útiles para
procedimientos inmunoquímicos y para observar la estructura y función de una Ig.
Cuando una Ig se cliva da origen a dos fragmentos idénticos que pueden unirse a
antígenos de forma monovalente pero no precipitan ni en solución ni en gel; se conocen
a estos dos fragmentos como “antigen binding” o unión de antígeno. El tercer fragmento
no se une a antígeno pero si participa en precipitaciones.
Hay varias enzimas útiles para clivar una Ig pero las más usadas son la papaína y la
pepsina. La Ig más usada en inmunoquímica es la IgG.

Estructura de Igs y generación de Igs

Las cadenas de las Igs tienen regiones distintas que pueden

ser o muy constantes o muy variables. Estas cadenas exhiben
dominios de forma 3D similar. Las cadenas pesadas están
compuestas por 3 o 4 dominios constantes y uno variable,
mientras que las livianas tienen uno constante y uno variable.
La región constante de una Ig es responsable de la mayoría
de las funciones inmunológicas y de la unión con receptores
de Igs presentes en muchas células. La región variable es la
responsable de unirse al antígeno; dentro de la región
variable hay una parte que demuestra una gran particular variabilidad que muestra una
interacción directa con el antígeno; esta parte se llama hipervariable o paratope y hay
tres de estas por cadena liviana o pesada.
Las Igs son una excepción a la regla de que un gen codifica a una sola proteína ya que
varios genes están involucrados en la codificación de las cadenas pesadas y livianas.
Gracias a esto un animal puede producir una gran cantidad de Igs que difieren sobre
todo en su región hipervariable, cambiando la zona la cual interactúa con un antígeno.
Esta variabilidad es la responsable de que un animal pueda producir una gran cantidad
de Igs diversas con diferentes especificidades y afinidades a un cierto antígeno por parte
de una Ig. Esto también ayuda a que se produzcan anticuerpos de todo tipo que
reconozcan casi todo tipo de molécula extraña.

13
Producción de anticuerpos

Casi todas las técnicas inmunoquímicas necesitan de un anticuerpo y la efectividad de

estos depende de su calidad.
La naturaleza de un anticuerpo afecta tanto la especificidad de un método como la
sensibilidad de un procedimiento.
Algunos anticuerpos se pueden obtener de forma “natural” pero es normalmente
necesario que se estimule su producción por la inmunización de animales y para esto
existen diversos procedimientos.

La respuesta inmune

Los anticuerpos más utilizados en inmunoquímica provienen de mamíferos; la Ig más

usada es la G para este tipo de técnicas, aunque la M y la A se usan para algunos otros
tipos de técnicas y la E se reserva para procedimientos alérgicos; la D no se usa y no es
efectiva para tratamientos.
Retomando lo dicho antes, se sabe que un linfocitos B secreta un anticuerpo que tiene
una secuencia de Ig sola. La respuesta humoral a un antígeno resulta en la activación de
una población heterogénea de linfocitos B que secretan varias Igs. En consecuencia a
salir de una población heterogénea de linfocitos B, las Igs secretadas que se puedan unir
a un antígeno serán de varios tipos, con una fracción de unión, con una especificidad y
avaricia hacia el inmunógeno variables. Esta respuesta se entiende como policlonal ya
que cada Ig deriva de más de un tipo de linfocitos B y muestra heterogeneidad en la
secuencia de aminoácidos en la zona de unión. Los anticuerpos policlonales se pueden
usar sin purificar como suero inmune o purificado para técnicas inmunes. Reconocen
más de un epitope.
Por otro lado están los anticuerpos monoclonales que derivan de un linfocito B solo, o
sea de una población homogénea, y por ende muestran misma secuencia de
aminoácidos, misma zona de unión y misma especificidad y avaricia por el inmunógeno
en cuestión. Los anticuerpos monoclonales son hijos de un linfocito B y una célula
cancerosa llamada mieloma. Reconocen un solo epitope.

Producción de anticuerpos policlonales

Es posible producir anticuerpos que se unan a todo tipo de moléculas: hidratos, ácidos
nucleícos, proteínas, etc. pero en consecuencia estos tienen poca y nada especificidad y
por ende son poco usados en técnicas inmunes. La mayoría de estas técnicas requieren
de anticuerpos que puedan reconocer proteínas y péptidos.
Los animales producen una respuesta humoral ante una proteína extraña; igualmente, la
magnitud del anticuerpo producido depende de varias cosas:
 Tamaño de la proteína/péptido extraño.
 Distancia filogenética con el antígeno; cuanta mayor sea esta distancia con el
animal productor, más efectivo será el anticuerpo producido.

14
Para seleccionar qué animal usar en un procedimiento inmunoquímico se debe tener en
cuenta la cantidad de antígeno que tengo, la cantidad de suero que quiero y la calidad
del suero que quiero producir. Sin embargo lo más importante sigue siendo la diferencia
entre la secuencia aminoacídica entre el anticuerpo animal (inmunógeno) y el antígeno
equivalente a dicho anticuerpo. Cuanta mayor diferencia, más fuerte será el anticuerpo.
Cuando se inmuniza un animal por primera vez el suero que se extrae del mismo, aún si
contiene anticuerpos, es subóptimo ya que los anticuerpos son poco ávidos por el
antígeno (poca avaricia); por lo que luego de una primera inmunización se tiende a
hacer otras posteriores, dando origen a un animal hiperinmune que tiene una alta
concentración de anticuerpos ávidos y específicos por el antígeno inyectado en su
sangre. Este “suero hiperinmune” es lo que se usa de fuente para anticuerpos
policlonales (animales más grandes necesitan más inmunizaciones pero producen más
suero). Para obtener los anticuerpos se utiliza la sangre del animal hiperinmune que dará
origen al suero.

Producción de anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales son muy efectivos para

las técnicas inmunes. Estos anticuerpos son clones los
unos de los otros y son secretados por linfocitos
maduros de animales inmunizados que se clonan, pero
que sobreviven muy poco tiempo, por lo que no
significan una gran cantidad de anticuerpos;
igualmente se logro hacer que células inmortales y
siempre crecientes puedan secretar anticuerpos.

15
En 1975 Kohler y Milstein inventaron el procedimiento para generar células híbridas
que secreten anticuerpos y perduren en el tiempo. Esto se logró por la fusión de
linfocitos del sistema inmune de un ratón con células cancerosas (mielomas). A estas se
las llamaron hibridomas (o híbridas) y tienen la capacidad heredada del padre linfocito
de secretar anticuerpos pero a su vez la capacidad de sobrevivir constantemente gracias
al padre mieloma. Este procedimiento requiere que se mezclen los linfocitos y los
mielomas, en una solución de alta densidad y luego tratados con un agente fusionador
(glicol); en dichas condiciones las células híbridas son obtenidas pero los linfocitos y
mielomas no fusionados predominan; los mielomas además pueden sobrecrecer y
sobrepasar a los hibridomas si no se remueven; para esto se utiliza un medio en el que
los mielomas no pueden vivir, pero los híbridos sobreviven. Las células normales
(linfocitos) sobreviven en este medio pero mueren poco despues. Entonces: cuando se
fusionan en un medio denso mielomas y linfocitos, luego se agrega un medio HAT en el
cual los mielomas mueren y los linfocitos morirán luego de un corto período de tiempo
dejando a los hibridomas solos; los hibridomas se pueden clonar de 3 formas para
hacerlos más puros:
 Dilución clonadora limitada: una suspensión de hibridomas se diluye y dispensa
en wells en los que quedarán un solo hibridoma por well. Este procedimiento se
repite y se obtiene una familia del mismo monoclonal.
 Clonación en agar suave: una suspensión de hibridomas se diluye en agar
diluido, en este medio crecen los clones.
 Clonación con fluorescencia: se marca con fluorescencia el hibridoma de mi
interés y luego estos se aíslan con citometría de flujo.
Todos los métodos de clonación están designados para producir culturas de hibridomas
monoclonales pero no lo aseguran. La repetición de técnicas de clonación mejora la
probabilidad de que los hibridomas sean monoclonales, por lo que se obtienen
subclones de los clones originales que serán más específicos por el epitope que yo
quiero. Si el hibridoma original es verdaderamente monoclonal, todo subclon tendría
que serlo, si un “monoclonal” reconoce más de un epitope, o yo hice algo mal y el padre
no era monoclonal, o el anticuerpo que uso no es estable. En la vida real los
monoclonales pueden obtenerse in vitro, donde yo coloco mi medio, mis mielomas y
mis linfocitos y obtendré un sobrenadante rico en hibridomas monoclonales; también se
puede utilizar la cavidad peritoneal de un ratón u otro animal para producir líquido
ascítico con altas concentraciones de hibridomas. Los hibridomas se pueden conservar
en frío.
En conclusión decimos que los anticuerpos policlonales se obtienen de suero inmune
derivado de la sangre de un animal y los monoclonales del sobrenadante de mi cultivo
in vitro o del líquido ascítico de un animal.

16
Purificación y fragmentación de inmunoglobulinas

 Hay variedad de procedimientos disponibles para la purificación de

inmunoglobulinas, el mejor método y detalles de los experimentos depende de la
clase/subclase, las especies en que se produjo el anticuerpo, la intención del uso
y el tipo de material inicial.
 Las técnicas de precipitación que utiliza características de diferencia de
solubilidad de anticuerpos u otras proteínas son: ion-exchange chromatography,
gel filtration y affinity chromatography.

Técnicas de precipitación

 Determinadas sales, solventes orgánicos y polímeros orgánicos producen que las

inmunoglobulinas precipiten de una solución para formar visible.
 Inmunoglobulinas en solución están rodeadas por una capa de hidratación que es
lo que permite que estas precipiten.
 Inmunoglobulinas son solubles con determinadas concentraciones de sal, pero se
hacen insolubles a muy altas concentraciones y muy bajas concentraciones.
 Altas concentraciones de sal atraen a la capa de hidratación promoviendo a las
áreas hidrofóbicas de la inmunoglobulina a interactuar con similares áreas de la
molécula causando un “agrupamiento” de las moléculas. Esto es el salting out.
Resulta en una precipitación reversible del anticuerpo.
 La solubilidad de algunas inmunoglobulinas decrecen a bajas concentraciones de
sal porque no hay suficientes iones para mantener la hidratación de la
inmunoglobulina. Esto se llama euglobuling precipitation y es útil para la
purificación preliminar de las IgM.
 La precipitación de inmunoglobulinas tiende a ser más efectiva en su punto
isoeléctrico.

Gel filtration

 Separa moléculas según su tamaño.

 No es buena para la purificación de IgG pero puede ser útil combinándolo con
otros métodos como el ion-exchange chromatography.

Fragmentación y disociación de inmunoglobulinas.

 Algunas aplicaciones de anticuerpos requieren el uso de fragmentos de

anticuerpo. Removiendo la porción Fc del anticuerpo previene la unión de
anticuerpos a receptores de Fc presentes en leucocitos y otras células.
 La preparación de fragmentos de anticuerpo normalmente involucra el uso de
enzimas proteolíticas para clivar uniones peptídicas.
 Se pueden usar distintas enzimas para el clivaje de la cadena en lugares
específicos. Los fragmentos más comunes son aquellos producidos por papain,
pepsin y plasmin. Estas enzimas se compran.

17
Inmunoprecipitación

Una propiedad importante de los anticuerpos es su habilidad para precipitar antígenos

de una solución, por eso lo que se busca es lograr un precipitado. Dada la utilización de
un anticuerpo polivalente, se establecen interacciones del complejo antígeno-anticuerpo
que dan lugar a la formación de un “enrejado” molecular que es muy grande para
mantenerse en solución, por lo tanto precipita.
La formación de un complejo antígeno-anticuerpo insoluble depende de la
concentración tanto del antígeno como del anticuerpo y ocurre cuando el rango de
concentraciones es muy estrecho, esto se llama zona de equivalencia (representa las
condiciones bajo las cuales el complejo antígeno-anticuerpo se forma y precipita).

Inmunoprecipitación en agar y agarosa (en fase solida)

Se utilizan geles de agar y la agarosa con poros grandes que permite que los anticuerpos
difundan a través de él. Si el anticuerpo que está viajando a través del gel se encuentra
con un antígeno, se forma un precipitado insoluble. El precipitado generalmente se
observa como una línea opaca en el gel (banda de precipitación). Si la precipitación es
débil se una Coomasie Brilliant Blue para teñir.
 Doble inmunodifusión (Ouchterlony): el antígeno-anticuerpo migra a través del
gel por difusión. En esta técnica se realizan pequeñas perforaciones en forma de
círculo concéntricas a una en el centro que se llenan con antígenos menos la del
centro que se coloca el anticuerpo. Ambos difunden dentro y a través del agar
formando un gradiente de concentración, en donde se forma una línea de
precipitación en el punto de equivalencia. Es cualitativa.
 Inmunodifusión radial (SRID), se cargan antígenos en los Wells cortados en el
gel de agar que contienen concentraciones de anticuerpos conocidas. Un anillo
de precipitado se forma alrededor del well, denominado halo. El diámetro del
anillo está relacionado con la concentración de antígeno. Se determinaron dos
relaciones:
a. El cuadrado del diámetro del anillo es proporcional a la concentración del
antígeno.
b. El diámetro del anillo es proporcional al log de la concentración del
antígeno. Midiendo el diámetro del anillo producido por el calibrador de
las muestras con inmunoglobulinas conocidas, una curva estándar puede
ser construida. Esta sería el diámetro del anillo en función de la
concentración.
 Inmunoelectroforesis: combinación de técnicas de inmunoprecipitación y de
electroforesis. Se utiliza una placa de agar de inmunodifusión en la cual se
realizan dos perforaciones al costado (se coloca la muestra) de un surco (en
donde se coloca el anticuerpo) y se realiza una electroforesis. El anticuerpo
luego difunde a través del gel en donde se forman las bandas de precipitina
donde el anticuerpo se encuentra con el antígeno.
Una desventaja de esta técnica es la mala resolución de las mezclas de antígeno
usando agar en la electroforesis, aunque es útil para la detección de anticuerpos
precipitando.

18
Marcando anticuerpos

En muchos ensayos inmunoquímicos, la unión anticuerpo-antígeno solo puede ser

visualizado mediante una marcación del anticuerpo (a veces del antígeno) o
generalmente también de un anticuerpo contra la inmunoglobulina.

Procedimientos inmunoquímicos directos e indirectos

Directo: Anticuerpo contra antígeno de interés conjugado con la marca.

Indirecto: En los métodos más comunes se detecta la unión de anticuerpo primario con
antígeno usando un anticuerpo marcado en contra de la inmunoglobulina (o anti IgA o
IgG). Este anticuerpo secundario ira en contra de la inmunoglobulina del animal en cual
el primer anticuerpo fue producido.

Marcación
a) Radiolabelling (radioisótopos): Se utiliza un isotopo que emite radiación
gamma, que es fácilmente detectable con el gamma-counter.
b) Fluorocromos: Los fluorocromos emiten luz fluorescente bajo iluminación UV
(no necesariamente). Es muy utilizado en la inmunohisto/citoquímica donde la
unión de los anticuerpos marcados a los tejidos o células son visualizados a
microscopio con ópticos fluorescentes.
c) Enzimas: son usadas para los inmunoensayos (ej. ELISA), inmunoblotting e
inmunohisto/citoquímica. La unión de la enzima-anticuerpo con el antígeno es
visualizada con la reacción de la enzima con un sustrato incoloro que se
convierta a uno con color. El producto debe ser soluble para su cuantificación
salvo en inmunoblotting e inmunohisto.
d) Biotina: los anticuerpos son fácilmente conjugados con biotina. Esta reacciona
con los grupos amina primarios, y otros con los grupos diol o los residuos de la
inmunoglobulina.

Inmunoblotting

Las técnicas más comunes involucran la transferencia de proteínas separadas desde un

gel poliacrilamida hacia una membrana porosa (generalmente nitrocelulosa), mediante
la utilización de una técnica de electroforesis, el término “blot” hace referencia a la
presencia de una marca (bandas) o no, en la membrana de nitrocelulosa. La reacción
anticuerpo-antígenos es detectada por el uso de un reactivo de anti-inmunoglobulina
marcada o mediante un anticuerpo marcado directamente con radioisótopos.
Se compara con un gel control con proteínas marcadas para la identificación y
reconocimiento del anticuerpo.

19
Variante Dot Blot

En esta técnica se utiliza la membrana de nitrocelulosa y la placa de la doble

inmunodifusión. La solución que contiene el antígeno es aplicada, secada sobre un filtro
de nitrocelulosa y luego es incubada con muestras (que pueden contener el anticuerpo).
Cualquier antígeno-anticuerpo puede ser detectado usando una enzima marcada o
radiomarca anti-Ig o proteína anticuerpo marcada.
Las ventajas son que el antígeno puede ser concentrado mediante el “spotting” en un
solo lugar del filtro y que muchas muestras con antígeno pueden ser incubadas con una
sola muestra de anticuerpo. La desventaja es que no se puede hacer una cuantificación
valida, ya que indica si hay o no presencia de antígeno.

Inmunopreciítacion en fase sólida (Inmunoensayos)

Los inmunoensayos hacen énfasis en el aspecto cuantitativo. Los inmunoensayos son

utilizados para diagnósticos de rutina o pronósticos entre otras cosas (ej. medir los
niveles de contaminantes ambientales como pesticidas y productos tóxicos de productos
industriales).

Inmunoensayo (ELISA sándwich) y ELISA doble sándwich

Se incuba una cantidad de anticuerpos (monovalentes) fijados que son insolubles e

inamovibles. Se lava el anticuerpo que no está ligado. Luego se incuba el antígeno y se
deja que se una al anticuerpo y se espera su precipitación. Una vez que ocurrió la
reacción, añado en exceso antiIg (enzima) para que se una al anticuerpo y se coloca el
sustrato de la enzima para que se produzca una reacción colorimétrica o fluorescente
(generalmente se utiliza como marcado avidina-biotina).
En el ELISA doble sándwich se adosa a la placa un anticuerpo primario de captura
(monoclonal) que se encuentra dirigido a mi epitope de interés y se lava. A continuación
se coloca la muestra con el antígeno que va a ser reconocido por el anticuerpo primario,
se deja incubar y se lava. A continuación se coloca el anticuerpo secundario de captura
que se encuentra conjugado con la enzima y por último el sustrato de la enzima para que
se genere la reacción colorimétrica o fluorescente.
Debe tener un control positivo (para saber si la técnica funcionó), un control negativo
(para saber si no hay reacción con interferencias) y un blanco.
Las ventajas son que son rápidos, sensibles, cubran un gran rango de concentración de
analito. Las desventajas son que requieren muchos anticuerpos.

20
Inmunohisto/citoquímica

Para entender la estructura de la célula, su organización y función, crecimiento de

tejidos, etc. es necesario determinar su distribución con el antígeno in situ. De esto se
encarga estas dos técnicas que explotan las interacciones específicas de un anticuerpo
con su antígeno para localizar o determinar su distribución en tejidos o células. El
principio de una inmunohisto/citoquímica es análoga a la inmunobinding e
inmunoblotting con excepción que el anticuerpo es incubado en secciones finas de
tejido en placas de vidrio o en preparados celulares con antígeno. El anticuerpo debe
estar conjugado con una marca fluorescente o enzimática, ya que dan señales fuertes
para poder visualizar con las herramientas apropiadas. Estas técnicas necesitan controles
positivos y negativos para saber que la inmunotinción es específica.

Inmunofluorecencia

La fluorescencia en ciertas técnicas permite que con una fuente de luz láser se analice
imágenes en distintas profundidades de la sección del tejido o célula para formar una
imagen tridimensional. Con una única aplicación de anticuerpos marcados con
fluorocromos alcanza por que los diferentes fluorocromos emiten distintas ondas de luz
UV, y con el uso de filtros apropiados en microscopios de fluorescencia permite que en
el mismo sector del tejido o célula sea inmunomarcada con 2,3 o 4 anticuerpos distintos
en el que cada uno es usado con conjunto con un distinto fluorocromo. Para un marcaje
doble o triple se necesitará conjugarlos con anticuerpos primarios.
Las ventajas son que los anticuerpos marcados con fluorocromo son rápidos y fáciles de
usar, y ofrecen buena sensibilidad. Las desventajas son que el requerimiento de un
microscopio equipado con ópticos fluorecentes.

Affinity and avidity

Para determinar la afinidad de un anticuerpo puede ser importante para predecir o

explicar sus características inmunoquímicas. La afinidad es definida como la constante
de equilibrio cuando un “anticuerpo monovalente reacciona con un antígeno
monovalente (calculo q monovalente es lo mismo que monoclonal). Como los
anticuerpos son generalmente monoclonales, los antígenos suelen tener más de una
determinante antigénica este concepto es difícilmente encontrado. La avidez es usada
para describir el equilibrio de la constante aplicable a toda interacción anticuerpo-
antígeno e incluye la afinidad más factores de adición por su múltiple valencia para
unirse entre otras consideraciones.

21
 Técnicas cromatográficas

El creador de la técnica, fue un ruso llamado Mikhail Tswett, en 1903, presentó una
exitosa separación de distintos tipos de pigmentos de una planta, usando una columna
de carbonato de calcio. Donde descubrió por primera vez que la clorofila no
representaba un solo componente químico.
El fundamento de la cromatografía es el coeficiente de partición (Kd), que describe la
distribución de un componente entre dos fases inmiscibles (que no se mezcla), la fase
fija y la fase móvil. El coeficiente entre estas dos fases es constante.
Kd: Se define como la cantidad total, no de concentración, sino de sustancias presentes
en una fase dividida por la cantidad presente en la otra fase. De hecho el coeficiente de
distribución es multiplicado por la proporción de los volúmenes de las dos fases. Si
[A]/[B]=Kd=1, pero la distribución de compuestos es A= 10 cm3 y B=1 cm3; la
concentración en las dos fases va a ser la misma, pero la cantidad total de compuestos
en fase A va a ser 10 veces del total en fase B.
Todas las cromatografías consisten en una fase fija, que puede ser: solida, gel, liquida
(inmiscibles); y una fase móvil que puede ser: liquida o gaseosa. El mecanismo consiste
en que la fase móvil fluya sobre la fase fija, y separe los compuestos por afinidad, hasta
que encuentre un equilibrio entre las dos fases.

Equilibrios fundamentales de la cromatografía

 Adsorción: un equilibrio de adsorción entre una fase fija solida y una fase móvil
liquida.
 Partición: equilibrio entre fase fije liquida y fase móvil liquida o gaseosa.
 Intercambio iónico: equilibrio entre fase fija solida “ion exchanger” y una fase
móvil electrolítica
 Tamizaje molecular: equilibrio entre fase móvil liquida atrapada en los poros de
una fase fija porosa.
 Afinidad: equilibrio en fase fija con ligando inmovilizado y fase móvil liquida.

Dos técnicas básicas de separación cromatográfica

 En columna: se opera armando una columna en donde se coloca la fase fija y

luego en la parte superior se siembra la muestra, que luego, por gravedad o
presión hidrostática interacciona con la misma. Luego se le agrega la fase móvil,
eluyente, que es un buffer de dilución con sustancias que impiden algunas
interacciones de la muestra con la columna. El mismo se elige de acuerdo con
las características de las moléculas a separar, el cual atrae a algunos
componentes y a otros no, que son atraídos por la fase fija. Es importante la
velocidad en la que corro la fase móvil. Por último, se debe detectar el analito en
el eluido mediante el uso de un reactivo general que me permite encontrar el
grupo de moléculas que busco.

22
  En capa delgada (TLC): en donde la fase fija, puesta en un papel, plástico o
vidrio fino, levemente inmersa en una matriz adecuada. La misma consiste en un
solvente orgánico volátil y un solvente de desarrollo. donde la fase móvil
asciende por capilaridad y arrastra los compuestos. Luego se revela con un
reactivo químico específico de color para ver lo que ascendió. A su vez se corre
un patrón y se hace un corrido de frente (cociente entre la distancia recorrida
por la partícula con respecto de la distancia recorrida del solvente). Este tipo de
cromatografía tiene la ventaja de poder hacer varios estudios al simultáneo.

Técnicas cromatograficas basadas en como operar

 Por elución: es la más utilizada. Consiste en el pasaje de la fase móvil

indefinidamente hasta que los componentes separados de la mezcla emergen al
final del lecho cromatográfico. Los compuestos con alta solubilidad son los que
se van a mover con más facilidad en la fase móvil. Para facilitar la separación, la
composición de la fase móvil puede ir gradualmente cambiando, por su pH o
polaridad.
 Por desplazamiento o afinidad: en este caso la sustancia desplazante va
incorporada dentro de la fase móvil, es muy utilizado en cromatografía de
intercambio iónico. La afinidad del analito está en la fase fija y la fase móvil
fluye moviendo el analito, la que más se mueve es aquella que menor afinidad
tiene.

Como se opera en una cromatografía de columna

1. Preparación del soporte y fase estacionaria.

 Equilibrado de la columna.
2. Aplicación de la muestra.
3. Elución:
a) Lavado de componentes no retenidos.
b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha de los componentes
retenidos.
4. Recolección de fracciones o análisis del efluente en continuo.
5. Análisis, cuantificación o revelado.

Análisis del perfil de elución

Un cromatograma mide la detección de los respectivos analitos en función del volumen

de elución, es decir cantidad de analito que pasa al eluyente o del tiempo de retención
(tiene dos componentes: Vo, el tiempo que tarde el analito en atravesar la fase fija y el
tiempo en el que la fase fija retiene al analito). Se puede observar algo similar a esto:

23
Para hacer un análisis cualitativo con solo observar los “picos” podemos distinguir qué
muestras hay. El Vo, volumen de exclusión representa el “tiempo muerto” es decir lo
que tarda la muestra en acomodarse en la fase móvil, en este momento nada va a pasar a
ser parte de la elución. Es el tiempo en que tardan en aparecen las primeras moléculas.

Para hacer un análisis cuantitativo de debe calcular el área bajo la curva. Estos “picos”
para ser considerados eficaces para el estudio de la muestra tienen que tener un
resolución entre 1,5 y 1, que le da la característica de estar separados y ser simétricos,
dándole así un valor de 97% de exactitud. Por último se realiza una curva de
calibración.

Distancia entre columnas

2 (𝑑𝑥 − 𝑑𝑦)
𝑅𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =
(𝑊𝑥 + 𝑊𝑦)

Ancho de columnas

24
Igualmente puede haber desviaciones como el:
a) Fronting: dada por una sobresaturación de la columna (fase fija) y salen
moléculas antes de lo que deberían salir, se observa así:

a) Tailing, dada por una sobre interacción del analito con la fase fija y sale después
de lo que debería salir.

Cuando los picos tienen grandes desviaciones, lo mejor es intentar de cambiar la

condición de corrida.

Cromatografía de adsorción

La separación depende de los equilibrios de adsorción-desorción de los componentes de

la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la fase móvil líquida o gaseosa. La fuerza
con que es adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del
adsorbente y de la polaridad de la fase móvil. En general cuanto más polar es un
compuesto más fácilmente será adsorbido. La cromatografía de adsorción, es una
técnica que está particularmente bien adaptada para la separación de compuestos de
polaridad baja y media. La separación de compuestos muy polares mediante
cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la
utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos para
la preparación de la muestra (preparación de trimetilsilil derivados, etc.) a fin de reducir
su polaridad. Adsorbentes que se suelen usar son: silica, alúmina, carbón y HO-apatita.

25
Cromatografía de partición

Tiene una fase fija liquida generalmente hechas de celulosa, almidón o sílice, cuando se
usa sílice se lo hace reaccionar con organoclorosilanos, para producir una fase fija más
estable. Dependiendo de la polaridad de lo que se quiera usar se pueden usar dos tipos
de particiones:

FE fase fija
FM fase móvil

Cromatografía de intercambio iónico

Principio

Este tipo de cromatografía depende de la atracción entre la fase fija (conocida como
intercambiador iónico) y el analito, con cargas opuestas. Es elegida frecuentemente para
la separación y purificación de proteínas, péptidos, ácidos nucleícos, polinucleótidos y
otras moléculas cargadas, principalmente por su poder de alta resolución y gran
capacidad.
Hay dos tipos de intercambiadores iónicos: aniónicos y catiónicos. Los
intercambiadores catiónicos (también llamados intercambiadores ácidos) poseen grupos
cargados negativamente y estos atraerán cationes. Los intercambiadores aniónicos (o
intercambiadores básicos) tienen grupos cargados positivamente que atraerán aniones.

Materiales y aplicaciones

Las matrices utilizadas incluyen poliestireno, celulosa y agarosa. Los grupos

funcionales iónicos incluyen sulfonato (-SO-) y amonio cuaternario (-N+R3), ambos
fuertes intercambiadores dado que se encuentran totalmente ionizados a todos los
valores de pH normales de trabajo; y carboxilatos (-COO) y dietilamonio (-
HN+(CH2CH3)2), ambos intercambiadores débiles porque se encuentran ionizados en un
rango angosto de valores de pH. Estas separaciones son a menudo llevadas a cabo a
60°C por el hecho de que el aumento de temperatura significa el descenso de la
viscosidad de la fase móvil y por esto, aumenta la eficiencia de la separación.

26
Elección del intercambiador

La elección del intercambiador iónico depende de la estabilidad del analito, su masa

molecular relativa y los requerimientos específicos de la separación. Muchos analitos
biológicos, especialmente las proteínas, son estables solo en un rango pequeño de pH,
por lo que el intercambiador elegido debe operar dentro de ese rango. Generalmente, si
un analito es estable por debajo de su punto isotónico (dándole una carga neta positiva)
debería usarse un intercambiador catiónico. Mientras que si es más estable por sobre su
punto isotónico (dándole una carga neta negativa) debería seleccionarse un
intercambiador aniónico.
La elección entre un intercambiador fuerte o uno débil también depende de la
estabilidad del analito y el efecto del pH en la carga del analito. Electrolitos débiles que
requieran valores de pH muy altos o muy bajos para ionizarse pueden separarse solo con
intercambiadores fuertes, ya que operan en rangos amplios de pH. En contraste, para
electrolitos fuertes, los intercambiadores débiles son más ventajosos por varios motivos,
entre ellos una tendencia reducida a causar la desnaturalización de las proteínas, la
habilidad de unir impurezas débilmente cargadas y las características destacadas de
elución.

PH del eluyente

El pH del buffer elegido como eluyente tiene que ser al menos una unidad de pH por
arriba o por abajo del punto isotónico de los analitos. En general, los buffers catiónicos
como el Tris, la piridina y las alquilaminas son usadas en conjunto con intercambiadores
aniónicos, mientras que buffers aniónicos como el acetato, barbitúrico y fosfato son
usados con intercambiadores catiónicos.
El valor preciso de pH del buffer y la fuerza iónica iniciales deben ser tales que solo
permitan la unión de los analitos al intercambiador. Igualmente, un buffer con la fuerza
iónica más baja que afecta la elución, debe ser usado inicialmente para la elución
subsecuente de los analitos. Esto asegura que inicialmente la mínima cantidad de
impurezas se unan al intercambiador y subsecuentemente la máxima cantidad de estas
impurezas permanezcan en la columna. Sin embargo, si se usara una elución en
gradiente, las condiciones iniciales elegidas serian tales que el intercambiador se una al
analito en la parte superior de la columna.

Elución

La elución en gradiente es más frecuentemente utilizada que la elución isocrática. El pH

continuo o escalonado y los gradientes de fuerza iónica pueden ser empleados, pero los
gradientes continuos tienden a dar una mejor resolución con menor pico de “tailing”.
Generalmente con un intercambiador aniónico, el gradiente de pH disminuye y la fuerza
iónica aumenta, mientras que para intercambiadores catiónicos, ambos, el pH y la fuerza
iónica, aumentan durante la elución.

27
Cromatografía de exclusión molecular (tamizaje molecular)

Principio

Esta técnica cromatográfica para la separación de moléculas basada en su tamaño y

forma explota las propiedades de tamiz molecular de una variedad de materiales
porosos. El principio general de la cromatografía de exclusión es bastante simple. Una
columna de co-polímeros reticulados de micropartículas, generalmente de estireno o
divinilbenceno, y con un pequeño rango de tamaños de poros, está en equilibrio con una
fase móvil adecuada para separar los analitos.
Los analitos grandes que son completamente excluidos de los poros pasaran a traces del
espacio intersticial entre las partículas y aparecerán en el primer eluido. Los analitos
más pequeños serán distribuidos por la fase móvil dentro y fuera de las partículas y por
ende pasaran por la columna más lentamente, apareciendo en el ultimo eluido. La fase
móvil atrapada por una partícula está disponible para un analito en una extensión que
depende de la porosidad de la partícula y el tamaño de la molécula el analito. Por lo
tanto, la distribución del analito en una columna de partículas reticuladas está
determinada exclusivamente por el volumen total de la fase móvil que se encuentra
disponible, tanto dentro como fuera de las partículas.
Para un determinado tipo de partícula, el coeficiente de distribución, Kd, de un analito
particular entre la fase móvil interna y externa es una función del tamaño molecular.

Aplicaciones

Purificación: La principal aplicación de la cromatografía de exclusión es la purificación

de macromoléculas biológicas facilitando su separación de moléculas más grandes y
más chicas. Virus, encimas, hormonas, anticuerpos, ácidos nucleícos y polisacáridos
han sido separados y purificados mediante el uso apropiado de geles o gránulos de
vidrio.
Determinación de masa molecular relativa: Los volúmenes de elución de proteínas
globulares están determinados mayormente por su masa molecular relativa (Mr). Ha
sido demostrado que, a lo largo de un amplio rango de masas moleculares relativas, el
volumen de elución o Kd es una función aproximadamente lineal del logaritmo de Mr.
Por ende, la construcción de una curva de calibración, con proteínas de forma similar y
Mr conocida, permite estimar los valores de Mr de otras proteínas, incluso en
preparaciones crudas.

28
Cromatografía de afinidad

Principio

La separación y purificación de analitos por cromatografía de afinidad se diferencia a la

mayoría de las técnicas cromatograficas y otras técnicas como la electroforesis y la
centrifugación en que no depende de las diferencias en las propiedades físicas de los
analitos. En cambio, explota la propiedad única de las interacciones biológicas
altamente especificas separar y purificar. Como consecuencia, esta técnica
cromatográfica es teóricamente capaz de dar una purificación absoluta, incluso de
mezclas complejas, en un único proceso.
Esta técnica fue desarrollada inicialmente para la purificación de encimas, pero desde
entonces ha sido extendida a nucleótidos, ácidos nucleícos, inmunoglobulinas,
receptores de membrana e incluso células enteras y fragmentos celulares.
La técnica requiere que el material a ser aislado sea capaz de unirse reversiblemente a
un ligando especifico que está asociado a una matriz insoluble. Bajo las condiciones
experimentales adecuadas, cuando una mezcla compleja que contiene un compuesto
especifico a ser purificado es agregado al ligando inmovilizado, generalmente contenido
en una columna de cromatografía convencional, solo ese compuesto se unirá al ligando.
El resto de los compuestos pueden ser entonces lavados y el compuesto deseado
recuperado por desplazamiento del ligando.
El método requiere conocimiento previo de la estructura y especificidad biológica del
compuesto a purificar para que las condiciones de separación elegidas sean las más
exitosas posibles.
En el caso de una enzima, el ligando puede ser el sustrato, un inhibidor competitivo
reversible o un modificador alosterico. Las condiciones elegidas son normalmente las
optimas para la unión enzima-ligando. Como el éxito del método radica en la
reversibilidad de la formación del complejo (enzima-ligando) y en los valores
numéricos de las constantes de primer orden K+1 y K-1, a medida que la enzima se
agrega progresivamente al ligando insolubilizado de una columna, las moléculas de
enzima serán estimuladas para unirse y se desarrolla una situación dinámica en la que la
concentración del complejo y la fuerza de la unión aumentan.

Materiales y aplicaciones

Matriz: una matriz ideal para la cromatografía de afinidad debe tener las siguientes
características: poseer suficientes y adecuados grupos químicos a los cuales el ligando
pueda unirse covalentemente y ser estable bajo las condiciones de la unión; ser estable
durante la unión de las macromoléculas y la subsecuente elución; interactuar solo
débilmente con otras macromoléculas para minimizar la adsorción no especifica; exhibir
buenas propiedades de flujo. En la práctica se utilizan partículas que son uniformes,
esféricas y rígidas. Las más comunes son los dextranos y agarosas reticulados,
polisacárido, polimetacrilato, poliestireno, celulosa y vidrio y silica porosos.

29
Ligando

La naturaleza química del ligando está determinada por la especificidad biológica del
compuesto a purificar. En la práctica a veces es posible seleccionar un ligando que
presente una especificidad absoluta y se una exclusivamente a un compuesto particular.
Más comúnmente, es posible seleccionar un ligando que presente selectividad por un
grupo y se una a un grupo de compuestos estrechamente relacionados que posea una
especificidad química similar.

Procedimiento práctico

El procedimiento para la cromatografía de afinidad es similar al usado en otras formas

de cromatografías liquidas. El buffer usado debe contener algún co-factor, como iones
metálicos, necesarios para la interacción ligando-macromolécula. Una vez que la
muestra fue aplicada y la macromolécula ligada, la columna se eluye con mas buffer
para remover contaminantes unidos no específicamente (débilmente). El compuesto
purificado es recuperado del ligando por una elución especifica o no especifica. La
elución no específica puede ser alcanzada por un cambio tanto en el pH como en la
fuerza iónica.

Aplicaciones

Muchas enzimas y otras proteínas, incluyendo proteínas receptoras e inmunoglobulinas,

han sido purificadas por cromatografía de afinidad. La aplicación de esta técnica es
limitada solo por la disponibilidad de ligandos inmovilizados. Los principios han sido
extendidos a ácidos nucleícos y han significado una contribución considerable para el
desarrollo de la biología molecular.

30
 Técnicas espectroscópicas

El fundamento es la interacción de la radiación electromagnética con la materia

(transmisión de energía en forma de onda resultado de la interacción de un campo
eléctrico y uno magnético). Una onda está caracterizada por la longitud de onda (λ) y la
frecuencia de la onda, la cual determina la energía de la misma (a una mayor frecuencia,
una onda más chica). Una onda de radiación interactúa con la materia que posee similar
longitud de onda, va a estar modificada según la radiación (nivel de transición), son las
modificaciones que corresponden según la energía que le brindo. La energía esta
cuantizada determinada por la transición en ese momento.
La materia se encuentra en su estado fundamental, al entregar energía pasa a estar en un
estado excitado. Al no ser su estado de menor energía, vuelve a su estado fundamental t
pierde energía (siempre lo que se emite tiene menor frecuencia y mayor longitud de
onda de lo que se generó en el estado activado).

Tipos de Espectroscopía

a) Espectroscopía de absorción: se mide la energía que se absorbe.

b) Espectroscopía de emisión: cuando se mide lo que se emite.
Para ambas se genera un gráfico llamado espectro que es determinado de cada elemento
según su nivel de transición. El gráfico consiste en la intensidad de onda (I) en función
de la longitud de onda (es más precisa con sustancias puras en el estado gaseoso). El
espectro implica hacer un barrido de diferentes longitudes de onda a una sustancia en
una cantidad fija.
 Espectros de línea: espectros de elementos solos, se dice que es lineal porque no
hay muchos niveles de transición.

 Espectro de banda: se realizan cuando las moléculas son más complejas.

31
La espectroscopia de infrarrojo permite saber la funcionalidad de la molécula, mientras
más proteína se encuentra en una muestra más longitud de onda hay. Los únicos
aminoácidos que son capaces de absorber el infrarrojo son los aromáticos, como la
tirosina, triptófano y fenilalanina.

Región Aplicación
Fenómeno Aplicación analítica
espectro clínica
Cámara gamma
Rayos Relacionados con las (T99),
Radioinmunoensayo
gamma transiciones nucleares destrucción de
tumores
Relacionado con la energía Radiografías,
Cristalografía (difracción de
Rayos X que salta entre los niveles tomografía
moléculas cristalinas)
atómicos internos computada
Relacionado con las
Rayos UV - -
transiciones de ionización
Transiciones de energía de
Rayos UV
valencia (visible 700 a 400 Espectrofotometría -
visibles
nm)
Relacionados con las
Rayos Espectroscopía (análisis
transiciones de vibración -
infrarrojos estructural orgánico)
molecular
Relacionado con las
Rayos de
transiciones de rotación y Resonancia magnética de
microondas Diagnóstico por
spin de electrones proteínas (análisis estructural
imagen
Ondas de Relacionados con el spin orgánico, se observa el protón)
radio nuclear

Espectrofotometría

El espectrofotómetro mide la cantidad de energía absorbida, en donde se establece una

relación lineal, entre la absorbancia y la concentración de la proteína. Se utilizan los
rayos UV visibles. Es un tipo de espectroscopía de absorción.
La aparatología consiste en una lámpara UV y otra que ilumina luz visible
(mercurio/halógena). Entre la muestra y la luz se encuentra un monocromador (prisma
de difracción, red de difracción) que permite que sólo un conjunto de onda se emita.
Después de eso hay una ranura que permite o no pasar la luz, la que incide en la
sustancia contenida en una cubeta. A continuación, se mide la longitud de onda
(mediante una fotocélula) que no absorbió la muestra. Se establece una relación con la
absorbancia 𝐴 = 𝐸𝑏[ ] . En donde E representa al coeficiente de absortividad y b al
𝐼
diámetro de la cubeta. La 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = − log(𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑚𝑖𝑡𝑎𝑛𝑖𝑐𝑎 ). Los cromóforos
𝐼𝑜
son sustancias que el espectrofotómetro puede medir. La curva de calibración se realiza
con cantidades distintas de sustancias a una misma longitud de onda.

32
Fluorescencia

Es una técnica asociada a moléculas orgánicas con doble enlaces conjugados, ya que
son más reactivas. Cuando se utilizan no se debe medir el espectro de absorción, sino, el
de emisión, ya que al absorber y volver a emitir la energía, lo hace a una longitud de
onda diferente. Es un tipo de espectroscopia de emisión.
Las sustancias que poseen estas características son fluoroforos (fluorocromos), se
utilizan como etiquetas en técnicas citoquímica/histoquímicas. En la aparatología se
utiliza un fluorímetro.

Espectrometría de masa

Su fundamento es la desviación de partículas cargadas cuando se le aplica un campo

electromagnético, que de acuerdo a su masa adquiere una velocidad diferente. No
involucra radiación.
Se generan técnicas que pasan proteínas al estado gaseoso sin su desnaturalización. Se
utilizan para el análisis estructural orgánico.
En el gráfico se observan los diferentes fragmentos de muestra original con su
respectivo peso molecular. A partir del mismo se puede identificar en que parte de la
molécula hubo una fractura en base a los picos más altos del gráfico. De esta forma, se
puede determinar la estructura original, sabiendo que tipos de enlaces son más débiles.

33
 Titulaciones

Técnica de cuantificación de ácido/base. La misma consiste en colocar una cantidad

conocida de ácido/base, en relación a un volumen determinado, y luego se coloca su
contrario. A continuación se coloca un indicador de pH (ácido/base débil en la que se
tiene en cuenta pKa/b ± 1 para la viración de color). Para que la técnica sea cuantitativa
se debe tener en cuenta que uno de los dos compuestos debe ser fuerte.
La curva de titulación no es un diagrama de especies. En la misma se grafica el pH en
función de un volumen agregado, ya sea de ácido o base. Posee una forma sigmoidea.
Los puntos a tener en cuenta son:
 Zona de regulación del pH (zona horizontal), también denominados puntos de
semiequivalencia. En estos puntos el 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎₁/𝑝𝐾𝑎₂. En estas situaciones se
obtienen las soluciones buffer.
 Punto de equivalencia (zona vertical): se igualan las concentraciones de ácido y
base.
o En el caso de ser ambos fuertes, el mismo es igual a 7 (no hay puntos de
semiequivalencia ya que no hay pKa/b.
o En el caso de ser uno débil y el otro fuerte, sea monopróctico o no, se
calcula como: [𝐻]/[𝑂𝐻] = √𝑀 𝑥 𝑘𝑎/𝑘𝑏 y a partir de esto se obtiene el
pH o pOH correspondiente.
o En el caso de ácidos o bases diprócticas el primer punto se calcula como:
𝑝𝐾𝑎₁+𝑝𝐾𝑎₂
𝑝𝐻 = .
2

pH pH pH

Ácido/base fuerte V Ácido/base V Ácido/base V

monopróctico dipróctico

34
 Solubilidad

Es la máxima cantidad de soluto que se puede disolver en un solvente a una

determinada temperatura. La solubilidad molar representa a los moles de soluto que se
disuelven en un litro de solución.
El producto de solubilidad (Kps) representa a los iones elevados a los correspondientes
coeficientes estequiométricos. El efecto del ion común indica que si se aumenta o
disminuye la concentración de uno de los iones, el otro va disminuir o aumentar en
relación al mismo. Sólo se expresa en M.
Q = al producto de las concentraciones. 𝑄 > 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎, en cambio cuando 𝑄 <
𝑛𝑜 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎.

La solubilidad aumenta exponencialmente cuando el

pH es más ácido, cuando el pH se torna básico la
solubilidad disminuye exponencialmente.

pH

Los siguientes compuestos ven afectados su solubilidad cuando hay cambios en el pH:
 Hidróxidos: la solubilidad aumenta a medida que aumentan los OH (pH básicos)
por la formación de complejos, y aumenta en pH ácidos. Sin embargo,
disminuye en pH neutros.

pH

 Sales cuyo anión es la base conjugada de un ácido débil, lo que produce es un

aumento de los H por hidrólisis. F, Cl, Br, I, son bases conjugadas de ácidos
débiles (F⁻, CO₃⁻, HCO³⁻, PO₄⁻). Lo que provoca es a pH más ácidos y una
mayor solubilidad, por una mayor concentración de ácido.
 Sales de elementos de transición y del grupo 2, al ser insolubles no se ve
afectado.
 De los halogenuros sólo se ve afectado el F.
 Los ácidos inorgánicos no se ven afectados por el pH.

35
 Complejos

Son compuestos formados metales de transición oxidados y metales del grupo 2, unidos
a ciertos ligandos orgánicos o inorgánicos (los cuales deben poseer pares de electrones
no compartidos).
Los ligandos pueden ser:
 Monovalentes: poseen 1 par de electrones no compartidos. Se dividen en:
o Sin carga: H₂O, CO⁻, NH₃, entre otros.
Valencia = 1
o Con carga: OH⁻, F⁻, Cl⁻, Br⁻, I⁻, entre otros.
 Divalentes: poseen 2 pares de electrones no compartidos. Se dividen en:
o Sin carga: dietilamina.
o Con carga: etilamina. Valencia = 2
 Polivalentes: poseen más de 2 pares de electrones no compartidos. Ej. EDTA,
EGTA, etc. Valencia = 6

En presencia de diferentes ligandos se pueden presentar isómeros cuando todos los

ligados son iguales, no.
Los complejos poseen características de ser muy solubles, con una constante de
formación (Kf) alta y coloreados cuando se encuentran en fase acuosa, por presencia de
estructuras de resonancia. Se pueden utilizar como conservantes (EDTA + Mg o Ca),
para evitar precipitados o forman la clorofila o hemoglobina.
El número de coordinación de un metal, es la capacidad de unión a ligandos
monovalentes (1 a 6), los más comunes son 4 o 6. Depende de la configuración
electrónica del metal y del ligando. 𝑁𝐶 = 𝑣𝑎𝑙 𝑙𝑖𝑔𝑎𝑛𝑑𝑜 𝑥 𝑛° 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑔𝑎𝑛𝑑𝑜.

[𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜𝑠]
𝐾𝑓 =
[𝑙𝑖𝑔𝑎𝑛𝑑𝑜]𝑛 [𝑚𝑒𝑡𝑎𝑙]

36
 Redox

Es una reacción espontánea que implica una oxidación (aumento de NO, pérdida de
electrones, disminución de H) y una reducción (disminución del NO, aumento de
electrones y aumento de H). Siempre van de a pares, si hay una oxidación hay una
reducción y viceversa. Los alcalinos son los compuestos que menos se reducen y el F,
es el que más se reduce.
El potencial estándar de reducción (E°) indica el potencial que tiene un compuesto, en
una hemirreacción, a reducirse (más E° más reducción). Las condiciones normales en
química inorgánica para E° son: 25° C, 1 atm y 1 M). En el caso de ser un compuesto
orgánico son: 25° C, 1 atm, pH 7, 1 M (salvo H que es M= 10⁻⁷). En el caso de ser
compuestos inorgánicos suelen ser valores altos, mientras que en compuestos orgánicos,
son bajos.
Se establece una relación entre el ΔE° y el ΔG°:
 ΔE° > 0 y ΔG° < 0  la reacción es espontánea. Cuando se cambia el ° por ‘
 ΔE° = 0 y ΔG° = 0  la reacción está en equilibrio. indica que el pH es = a 7.
 ΔE° < 0 y ΔG° > 0  la reacción es no espontánea.

𝑅𝑇 [𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠]𝑐𝑜𝑒𝑓 𝑧𝐹ΔE
ΔE = ΔE° − ln Q Q=
𝑍𝐹
[𝑅𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠]𝑐𝑜𝑒𝑓 Keq = 𝑒 𝑅𝑇

ΔE°′ = E°′ reducido − E°′ 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑑𝑜 ΔG° = −ZFΔE°

Las condiciones iniciales son las que van a determinar el resultado.

37
 Extracción con solvente

Técnica utilizada para purificar (deshacerse de las interferencias) o concentrar una

muestra. Se utiliza una fase acuosa que posee los componentes a extraer y una fase
orgánica. Esta última no debe ser miscible en H₂O (en donde se forman 2 fases), tener
un PE bajo, menos tóxica posible, más volátil y con un menor costo, en donde los
compuestos sean lo más solubles posible. La posición de estas va a depender sus
densidades respectivamente.
[𝐴]𝑜𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑜 Solubilidad orgánica
La constante de partición (Kd) se representa como: 𝐾𝑑 = [𝐴]𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑜
Solubilidad acuosa
La misma indica cuánto es más soluble un compuesto en solvente orgánico
que en agua.
La extracción con solvente tiene las siguientes características:
 Mientras más grande es la Kd hay una mayor extracción de “A”.
 Cuando Kd es menor a 1 no hay extracción.
 Cuando Kd es iguala 1 se extrae lo mismo en ambas fases.
 En solvente orgánico, siempre se extrae mejor la forma neutra de un compuesto.
 Es mejor extraer más veces con un menor volumen que 1 sola vez con un mayor
volumen.
 La fase orgánica posee moléculas extractantes, que poseen alta afinidad por lo
que quiero separar. Se transfiere de fase acuosa a orgánica.
La recuperación (R) o porcentaje de recuperación puede calcularse como:
𝑛
1
%𝑅 = {1 − ( ) }
𝑉𝑜
1 + 𝐾𝑑 𝑉𝑎

Modificaciones de la Kd en presencia de un soluto capaz de ionizarse: 𝐾𝑑

𝐾𝑑′ =
 Si hay un ácido/base débil, la Kd no es la misma. En este caso 𝐾𝑎/𝐾𝑏
1+
depende del pH en el que se encuentre ya que hay una Ka/Kb. [𝐻]/[𝑂𝐻]
 El %R o R también se va a ver modificado, se reemplaza la Kd
por Kd’.
 Para un ácido débil a medida que se aumenta su pH, disminuye su capacidad de
extraccionarse, ya que disminuye la cantidad de compuesto que se disuelve en
fase orgánica.
 Para una base débil a medida que se aumenta su pH, aumenta la capacidad de
extraccionarse, ya que en pH más altos la base se encuentra en estado neutro.

[] []
H H

pH 38 pH
pKa pKa
+ soluble - soluble - soluble + soluble
 Radioinmunoensayo (RIA)

Técnica cuantitativa desarrollada en los años 60’, superada en la actualidad por técnicas
de fluorescencia. La misma puede compararse o puede ser elaborada.
Se basa en el uso de un isótopo radioactivo y el uso de un anticuerpo.
 Ventajas:
o Alta sensibilidad, detección de concentraciones pequeñas desde pocos
moles hasta femto-moles (dado por el uso de isótopos).
o Alta especificidad, por el uso de anticuerpo.
 Desventajas:
o Contaminación por el uso de compuestos radioactivos y radiaciones.
o Uso de equipamiento específico caro (centelleo δ y β).
Se fundamenta en la unión antígeno anticuerpo. Se necesita lo siguiente para poder
realizarse:
 Molécula no marcada (M).
 Molécula marcada radioactivamente o trazador (M*).
 Anticuerpo (anti-molécula) que posee igual afinidad por la M* y M.
La reacción necesita un tiempo de incubación determinado, en donde, luego, se va a
comparar la radiación de un tubo con anticuerpo marcado (curva de calibración) con la
molécula marcada. Se debe tener en cuenta que haya una cantidad suficiente de
anticuerpo y de M*.
Marcación

Se utilizan tritón (H³), que posee una VM ≈ 10,5 años, y ¹⁴C, que posee una VM ≈ 4500
años. [VM = tiempo que tarda en caer a la mitad]. Lo ideal es marcarlo con estos dos
para que la afinidad de los compuestos sea igual entre anticuerpo y la molécula sin
marcar.
Para péptidos y proteínas se marca con iodo radioactivo (I ¹²⁵/ I¹³¹), que posee una VM ≈
60 días.
 Ventajas: es económico y rápido.
 Desventajas:
I. No hay certeza de un cambio conformacional en la proteína en donde
puede haber una pérdida de afinidad entre esta y el anticuerpo.
II. VM del isótopo corta.
III. Radiólisis: descomposición de la molécula a una velocidad rápida.
IV. En cuanto a centello se utiliza el δ, que penetra en todo menos en el
plomo, lo que puede producir contaminación.

39
 Construcción de experimento

M M M

B Ac Ac

M* M* M* M*

Cálculo de error de Inesperado o blanco Curva de calibración:

Bo / pegada máxima
método Se realizan varios tubos
iguales con diferentes
concentraciones de M.

Siempre se coloca la misma cantidad de anticuerpo, sin embargo, en la curva de

calibración, al colocar una mayor cantidad de M, hay una mayor interacción entre este y
el anticuerpo, lo que produce una menor interacción entre M* y el Ac, por lo tanto, la
curva es inversamente proporcional.

logit 𝐵
𝐵 <1
𝐵𝑜
𝑙𝑜𝑔𝑖𝑡 = ln ( 𝐵𝑜 )
𝐵
1 − 𝐵𝑜

La pegada disminuye

log M

La variabilidad entre días es alta, por eso todas las muestras a comparar deben realizarse
el mismos día, para que tenga igual pendiente y ordenada al origen.

40
Método de separación 𝑀 + 𝐴𝑐 ↔ 𝑀 − 𝐴𝑐
= afinidad
𝑀 ∗ + 𝐴𝑐 ↔ 𝑀 ∗ −𝐴𝑐
Se establece el siguiente equilibrio:
en donde, luego de la incubación, se separa lo que se unió de lo que no se unió (se
separa lo unido de lo libre). Para eso se utilizan las siguientes técnicas:
 Generales: son las más utilizadas y se dividen en:
o Técnicas inespecíficas de precipitación de proteínas: se debe tener en
cuenta que la muestra que queremos analizar no debe ser una proteína,
pues precipitaría junto con lo que queremos separar. Se utiliza alcohol +
albúmina como carrier, junto con una solución saturada de sulfato de
amonio (NH₄)₂SO₄, el cual posee una solubilidad alto por lo que se
pueden alcanzar concentraciones altas y por acción del salting out las
proteínas precipitan. Se precipita el Ac + el producto de las reacciones,
pero sólo interese M*.
o Carbono dextrano: es utilizado con moléculas pequeñas y no proteicas
(hormonas, esteroides, neurotransmisores), ya que posee una gran
adsorción por estas. La diferencia con los otros métodos es que mide la
M libre, no la que se encuentra con el anticuerpo.
 Específicas: en donde se agrega un segundo anticuerpo anti-anticuerpo primario
formándose una red. Se precipita el Ac + el producto de las reacciones, pero sólo
interese M*.

Control de calidad

 Una pendiente ideal es de -2,3 y de 45°, porque si tengo una pendiente muy
chica, una variación en el ln me da como resultado un cambio muy grande.
 La variación de la curva de M puede ser desde 1 hasta 1000 pg (3 órdenes de
diferencia).
 Es un método que se basa en las cpm.
 La variabilidad interensayo debe ser más chica que el 5%, y la variabilidad
intraensayo debe ser menor al 1%.
 En el blanco o pegada inespecífica hay un % de radioactividad producido por
varios motivos y por lo tanto, se debe restar ese % a la totalidad de los tubos.
 La pegada máxima debe oscilar entre un 20% y 30%.

Resultados

Las muestras deben encontrarse entre los valores de Bo (máximo de la curva) e I

(mínimo de la curva). Cuando una muestra excede las cpm del Bo se realiza un
inespecífico para toda la curva. En el caso de estar por debajo de las cpm del punto más
bajo de la curva se debe colocar más muestra o repetirlo con más muestra.

41
 Cuantificación de drogas en muestras por HPLC

La HPLC es la cromatografía líquida de alta eficacia, la cual se basa en los fundamentos

de la cromatografía, que establecen la separación de un soluto entre dos fases
inmiscibles dependiendo de las fuerzas de atracción y repulsión (fuerzas polares o de
dispersión) que caracterizan una determinada afinidad entre estos compuestos. La
misma es aplicable en: (1) monitoreo de fármacos; (2) Medio ambiente; (3) Casos
forenses y penales; (4) Dopping deportivo; (5) Toxicología; (6) Bromatología, entre
otras. Según el PM de la muestra se utilizan diferentes tipos de cromatografías.
Posee las siguientes ventajas:
 Alta eficacia.
 Sensibilidad.
 Tiempo de análisis corto.
 Consumo de solventes reducido (aproximadamente 500 ml).
Un aspecto muy importante es la P que se le da a una muestra, la cual va a depender de:
 Longitud de la columna.
 Tamaño de la partícula.
 Viscosidad y flujo de fase móvil (+ viscoso + presión).
 Temperatura.

Las partes de un sistema de HPLC son:

1. Fase móvil, la cual se desgasifica y se filtra.
2. Bomba de alta presión (≈ 200 atm). Se utiliza una bomba con presiones tan altas,
ya que las moléculas son pequeñas y empaquetadas y poseen resistencia a la G.
3. Inyector de alta presión, el cual realiza una toma de la muestra a un volumen
determinado (control de volumen). Puede ser manual o automático.
4. Columna horizontal de un diámetro pequeño (fase fija).
5. Detector: detecta analito.
6. Registrador, programa de adquisición de datos que realiza el cromatograma.

42
Un cromatograma mide el analito de la HPLC graficados como “picos”. Cabe destacar
las siguientes características:
o Mientras más altos o con una mayor área, indican mayor cantidad de analito.
o Mientras más agudo el pico hay una mayor resolución con un menor error. +
especificidad, + selectividad y + efectividad.
o La sensibilidad es la menor concentración de un compuesto que puede ser
detectado en una muestra. A ese valor se lo denomina “limite de cuantificación”
(LOQ).
o El frente de solvente es la cantidad de eluyente en el que se encuentra el analito
de la muestra que no se une a la FF.
Existen métodos para mejorar el cromatograma:
 Programación de solvente: se programa la cantidad de volumen de solvente
dispensado para acortar los tiempos muertos en la HPLC.
 Gradiente de elución: se cambia la composición de la FM (a baja y alta P), para
separar los picos.

Columnas

Es un segmento de un tubo de algún material inerte con diámetros uniformes capaz de

resistir altas P, con longitudes de 10 a 20 cm. El relleno de columnas se puede hacer por
 Tamaño.
 Tipo de partícula.
 Relleno:
o Fase normal: FM menos polar que la FF (se utiliza el hexano como FM).
o Fase reversa: FM más polar que la FF
Fase normal Fase reversa
Polaridad FF Alta (sílica) Baja (C-18)
Polaridad FM Baja a media Alta
FM Hexano (no polar) Agua - metanol (polar)
Orden de elución Primero eluye el menos polar Primero eluye el más polar

43
Fase móvil

La misma debe ser pura con baja viscosidad, sin ninguna reacción con el
empaquetamiento de la columna (pH compatible con esta) y compatible con el detector
(concentración del solvente compatible). Además debe disolver la muestra y permitir su
recuperación siendo libre de burbujas. Se debe tener en cuenta estos aspectos:
 Eficiencia: capacidad de elución con el mínimo de dispersión del analito.
 Selectividad: habilidad del sistema para separar los picos.

Detectores

Dispositivos que examinan continuamente el material eluido, generando una señal

continua proporcional a la concentración, al pasar el analito.

Matriz biológica

Material biológico de composición característica que puede muestrearse y procesarse en

forma reproducible. La matriz blanco se obtiene de voluntarios sanos que no han
ingerido la droga en estudio ni otra sustancia que pueda interferir en el análisis
cuantitativo (no posee interferencias). Un buen análisis debe tener los siguientes pasos:
I. Elección del material biológico para análisis cuali-cuantitativo.
II. Elección del envase adecuado para el almacenamiento.
III. Tratamiento previo y almacenamiento.
IV. Purificación.
V. Análisis.
A su vez, posee las siguientes etapas:
1. Acondicionamiento y almacenamiento de las muestras.
2. Extracción del compuesto de interés por un método adecuado.

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 3. Concentración del extracto para incrementar la señal.
4. Cuantificación del analito con metodología válida.
Existen los siguientes métodos de purificación:
 Precipitación proteica: desnaturalización y precipitación de las proteínas
(plasmáticas) con la consecuente liberación de la droga unida a proteínas. Tiene
las desventajas de ser: poco selectiva y se diluye la muestra (alto LOQ).
 Extracción líquido-líquido: se requiere que los dos líquidos que se ponen en
contacto sean inmiscibles (FA y FO). La preparación de la muestra se realiza:
(1) Elección del solvente adecuado.
(2) Fuerza iónica/pH.
(3) Re-extracción.
Tiene la ventaja de que hay una concentración de la muestra.
Tiene como desventajas que:
o Formación de emulsiones.
o La recuperación puede ser baja.
o Se necesita de un laboratorio apropiado.
o Laborioso.
o Reproductibilidad.
 Extracción liquido-sólido (SPE): es el equilibrio del analito entre dos fases, FM
líquida (muestra), FF (sólida). Tiene los siguientes pasos:
(1) Acondicionamiento de la FF.
(2) Retención del analito en la FF.
(3) Lavado de componentes no deseados.
(4) Elución del analito.
(5) Evaporación/concentración.
Su principal desventaja es que es caro y laborioso.

Validación de métodos analíticos aplicados a la cuantificación de analitos en muestras

biológicas

Exacto y Preciso y no
preciso exacto

No exacto y Exacto y
no preciso no preciso

La validación para un método es el procedimiento que demuestra que un método

utilizado para la cuantificación de analitos en una matriz biológica resulta apropiado,
reproducible y confiable para su uso. Es un proceso sistemático.

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 Los parámetros de validación son:
1. Selectividad/Especificidad: Es la capacidad del método para diferenciar y
cuantificar el analito de interés respecto de otras sustancias que puedan estar
presentes en la muestra (metabolitos, sustancias endógenas).
2. Sensibilidad o límite de cuantificación (LQ): es la capacidad del método para
detectar y cuantificar el analito de interés. Se determina el límite de
cuantificación que es la menor concentración del analito en estudio que puede
cuantificarse con precisión y exactitud.
3. Exactitud: describe la proximidad de los resultados obtenidos a partir del
método analítico respecto del valor verdadero. Se determina para cada nivel de
concentración y se mide con:

𝑐𝑐 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙 − 𝑐𝑐 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑟𝑎 𝑐𝑐 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙

𝐵𝑖𝑎𝑠% = ( ) 𝑥 100 𝐸% = ( ) 𝑥 100
𝑐𝑐 𝑣𝑒𝑟𝑑𝑎𝑑𝑒𝑟𝑎 𝑐𝑐 𝑡𝑒ó𝑟𝑖𝑐𝑎

Como criterio de aceptación en E% es desde 85 a 115% en cualquier rango

menos en LQ que es entre 80 y 120%. Para BIAS es de menos del 15% en
cualquier rango menos en LQ que debe ser menor a 20% (indica signo de SD%).
4. Precisión: describe la proximidad entre las diferentes medidas individuales de
un analito. Se describe por el coeficiente de variación (CV% o RSD%). Se
𝑆𝐷
determina para cada nivel de concentración. 𝑃𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠𝑖ó𝑛 % = (𝑚𝑒𝑖𝑑𝑎) 𝑥 100.
Posee el siguiente criterio de aceptación: los valores de RSD% para
reproductibilidad y repetitividad para cada nivel de concentración no debe ser
mayor a 15% excepto para el LQ que puede ser menor a 20%.
5. Curva de calibración – Linealidad: es la relación entre la respuesta del
instrumento y las concentraciones conocidas del analito en estudio. Se busca que
el modelo sea de regresión lineal para que la concentración de analito en las
muestras se calculada por interpolación.
6. Recuperación: es la relación entre la respuesta del detector para una cantidad
conocida de avalito en la matriz biológica respecto de aquella obtenida para la
cantidad verdadera de analito.
7. Estabilidad: el objetivo es determinar las condiciones de recolección,
almacenamiento y procesamiento de muestras, tipo de matriz y
propiedades fisicoquímicas de la muestra que pueden alterar la
estabilidad del analito. Se divide en:
o Estabilidad a corto plazo.
o Estabilidad luego de ciclos de congelado-descongelado.
o Estabilidad a largo plazo.
o Estabilidad de la solución patrón.
8. Robustez: habilidad del método en ser preciso y exacto ante pequeños cambios.

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