Universidad Regional Amazónica IKIAM

Bioquímica I

Pablo Guerra
Experimento purificación de Proteínas in silico
Se utilizó una plataforma desarrollada por el departamento de Biología Molecular del
University College de Londres. Esta plataforma permite analizar los escenarios de una
muestra aleatoria de características desconocidas y purificarla mediante las siguientes
técnicas:
1. Fraccionamiento por precitación con sulfato de amonio
2. Cromatografía de intercambio iónico
3. Cromatografía por afinidad
4. Cromatografía por filtración de gel
5. Electroforesis SDS-PAGE
Cabe recalcar que la plataforma establece el orden señalado previamente sin opción a
realizar cambios. A pesar de esta limitación la plataforma permite realizar una serie de
análisis con las diferentes técnicas de aislamiento.
Resultados
Fraccionamiento por precipitación de sulfato de amonio
Durante esta etapa se agregó una concentración de sal de 40 a 50% y se realizó una
separación de la sal por diálisis con los siguientes resultados:

Como se puede observar en el texto observado en azul, la muestra de la plataforma se

extraerá del hígado, por lo que la enzima a purificar podría ser la fosfatasa alcalina,
transaminasas o enzimas digestivas como la catalasa (Canadian Cancer Society, 2009)
Cromatografía de intercambio iónico
Para esta etapa se pasa la muestra a través de una columna cromatográfica con resina que
interactúa con la proteína deseada graduando el valor de pH. Para este caso específico el
pH es de 9 y para separar el analito se agrega una cantidad de sal.
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Cromatografía por afinidad

Durante este proceso se toma la muestra obtenida del paso anterior y se le añaden a las
moléculas diferentes tipos de modificadores que vuelvan a las proteínas afines a la resina
de la columna cromatográfica y permitan una interacción entre ambas. Para el caso
específico de las enzimas las moléculas que anclen a la enzima a la resina sería el sustrato
específico de la enzima.
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Cromatografía por filtración de gel

En esta etapa se pasa el analito por una serie de moléculas que hacen el papel de un
tamiz, separando a las moléculas por su tamaño. Luego usando marcadores y etapas de
elución se determinó en que regiones se colocó la muestra

Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

En este paso se toma la muestra y se la analiza en una cámara de electroforesis para
comprobar que tan efectiva resulto la purificación de las proteínas en la columna de
muestra y se agregan marcadores de proteína con tamaños conocidos para hacer una
serie de marcadores estándar.
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Resumen de purificación y tratamiento de datos

Tabla 1. Tabla resumen de los datos de volumen actividad y cantidad de proteína obtenidas
durante las diferentes etapas de purificación

Volumen Actividad Proteína

(mL) (umol/min/ml) (mg/mL)
Original 100 90 187
Fraccionamiento 100 74 26
Cromatografía de intercambio ionico 30 205 0.63
Cromatografía por afinidad 10 544 0.15
C. Filtración en gel Peso aproximado = 68kDa
Banda 1 = 34KDa
SDS PAGE
Contiene 2 subunidades
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Tabla 2. Valores de Actividad, Rendimiento, Actividad Específica e Índice de Purificación

para los valores de la tabla 1.

Rendimiento Actividad Indice de

Actividad
(%) Específica Purificación

Original 9000 100 48.13 1

Fraccionamiento 7400 82.22 284.62 5.913675214
C. de intercambio ionico 6150 68.33 9'761.90 34.2985843
C. por afinidad 5440 60.44 36'266.67 3.715121951
C. Filtración en gel Peso aproximado = 68kDa
Banda 1 = 34KDa
SDS PAGE
Contiene 2 subunidades

Conclusiones
La plataforma desarrollada por el UCL resulta una herramienta sumamente útil y
económicamente económica para ayudar a los estudiantes a familiarizarse con los
procesos de extracción de proteínas desde el inicio de la muestra.
Se puede hacer una relación entre el origen de la muestra y los datos obtenidos durante
el análisis o al menos hipotética el tipo de enzima que se puede extraer del experimento.
Recomendaciones
Es recomendable realizar al menos parcialmente los procedimientos realizados in silico
para poder relacionarlo de mejor manera, así como para obtener resultados reales de este
tipo de análisis

Referencias

Canadian Cancer Society. (2009). The liver. Retrieved from

http://www.cancer.ca/en/cancer-information/cancer-type/liver/liver-cancer/the-

liver/?region=on

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2013). Lehninger principles of biochemistry. New York,

NY: Freeman.