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2012, Vol. 17 N° 1: 72-81

SICI: 2027-1352(201201/04)17:1<072:EDMDNAAUDSLNTC5D2>2.0.TS;2-A Métodos analíticos

Evaluación del método dilución neutralización aplicado a un

desinfectante según la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007
Janeth Arias-Palacios1*, Libardo Hernandez-Esquivel2, Juan Carlos Marín-Díaz3,
Natalia Navarro-Peña3, Natalia Santos-Arévalo3

1
Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI). Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias.
Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.
2
Laboratorios Vicar Farmacéutica. Bogotá, D.C., Colombia.
3
Carrera de Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia.

* jdcarias@javeriana.edu.co

Recibido: 27-09-2011; Aceptado: 28-02-2012

Resumen
Objetivo. Evaluar el método de dilución neutralización propuesto en la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007, mediante la utilización
de un desinfectante en gel a base de alcohol. Materiales y métodos. El ensayo se efectuó utilizando Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442, Staphylococcus aureus ATCC 6538 y Enterococcus hirae ATCC 10541, como microorganismos de ensayo. Las temperaturas
del estudio fueron 20±1°C como temperatura obligatoria y 36±1°C y se emplearon cuatro tiempos de contacto entre el desinfectante y
los microorganismos evaluados (0, 2, 5 y 10 minutos). El método fue realizado bajo condiciones limpias (0,3 g/L de albumina de suero
bovino) y sucias (3g/L de albumina de suero bovino y 3g/L de eritrocitos de oveja). Resultados. La implementación del método arrojó
resultados precisos en cada una de las seis repeticiones realizadas en el ensayo. Los resultados obtenidos demostraron una reducción
logarítmica superior a cinco, evidenciando la actividad bactericida ejercida por el desinfectante frente a los microorganismos control.
El establecimiento de las condiciones experimentales y de la metodología demostró no incidir negativamente en el crecimiento de
cada una de las cepas. Igualmente, el neutralizante utilizado no inhibió el desarrollo de los organismos de ensayo. Conclusiones. Se
verificó el método mediante el cumplimiento de los límites establecidos por la norma. Los resultados sugieren que el método evaluado
mediante la implementación del protocolo establecido en la Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007, permite evaluar la eficacia de
un desinfectante bajo condiciones experimentales escogidas y controladas.
Palabras clave: desinfección, condiciones limpias, condiciones sucias, método dilución neutralización, reducción logarítmica.

Abstract
Assessment of the dilution-neutralization method with a disinfectant according to the Colombian Technical Norm 5473 of 2007.
Objective. Evaluate the dilution-neutralization method proposed in the Colombian Technical Norm 5473/07, by using a gel, alcohol-
based disinfectant. Materials and methods. This study was done using Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus
ATCC 6538, and Enterococcus hirae ATCC 10541 as the assay microorganisms. The study was carried out at 20±1°C as obligatory
temperature and additionally at 36±1°C. Four contact times between microorganisms and the disinfectant were evaluated (0, 2, 5 and 10
minutes). The assay was done both under clean conditions (0.3 g/L of bovine serum albumin), and unclean conditions (3 g/L of bovine
serum albumin and 3g/L of sheep erythrocytes). Results. The implementation of this method produced precise results in all of the six
repetitions used during the assay. The obtained results demonstrated a logarithmic reduction higher than five, demonstrating the bactericidal
activity exerted by the disinfectant on the control microorganisms. The established experimental conditions and methodology did not
affect negatively the growth of any of the strains of microorganisms. Similarly, the neutralizing used did not inhibit the development of
the microorganisms of the assay. Conclusions. The method was verified by means of the fulfillment of the limits set by the rule. Our
results suggest that the method evaluated by means of the implementation of the protocol established in the Colombian Technical Norm
5473/07, allows evaluating the effectiveness of a disinfectant under selected and controlled experimental conditions.
Key words: disinfection, clean conditions, unclean conditions, dilution-neutralization method, logarithmic reduction.

72 Arias-Palacios, et al
 Método dilución neutralización aplicado a un desinfectante

Resumo
Avaliação do método de diluição-neutralização aplicado num desinfectante segundo a “Norma Técnica Colombiana 5473 de
2007”. Objetivo. Avaliar o método de diluição-neutralização proposto na “Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007”, pela utilização
de um desinfectante gel à base de álcool. Materiais e métodos. O teste foi realizado utilizando Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Enterococcus hirae ATCC 10541, como microrganismos de ensaio. As temperaturas do estudo
foram de 20 ± 1°C como temperatura requerida e 36 ± 1°C e foram utilizados quatro tempos de contacto entre o desinfectante e os
microorganismos avaliados (0, 2, 5 e 10 minutos). O método foi realizado sob condições limpas (0,3 g/L de albumina sérica bovina) e
sujas (3g/L de albumina sérica bovina e 3g/L de eritrócitos de carneiro). Resultados. A implementação do método produz resultados
precisos sobre cada uma das seis repetições realizadas no ensaio. Os resultados mostraram uma redução logarítmica superior a cinco, o
que evidencia a actividade bactericida exercida pelo desinfectante contra os microrganismos control. O estabelecimento das condições
experimentais e da metodologia provou não incidir negativamente no crescimento de cada uma das cepas. Similarmente, o neutralizador
utilizado não inibiu o desenvolvimento dos organismos do experimento. Conclusões. Verificou-se o método através do cumprimento
dos limites estabelecidos pela norma. Os resultados sugerem que o método avaliado através da aplicação do protocolo estabelecido pela
“Norma Técnica Colombiana 5473 de 2007”, permite avaliar a eficácia de um desinfectante em condições experimentais seleccionadas
e controladas.
Palavras-chave: desinfecção, condições limpas, condições sujas, o método de diluição-neutralização, redução logarítmica.

Introducción transfiriendo asadas de células a un frasco schott con

El control microbiano en el área de la salud, constituye
actualmente, uno de los pilares para la implementación de
procesos que garanticen la seguridad a pacientes y personal
que labora en el área. Por ello, la limpieza y la desinfección
son el mecanismo principal al cual se debe acudir si se
quiere mantener un ambiente libre de microorganismos
que pueden llegar a alterar la salud de pacientes y personal
asistencial (1)
300ml de solución salina. Se agitó con vortex y se midió
la absorbancia a longitud de onda de 540nm. Se prepararon
diluciones 10-6 y 10-7 y se sembraron por duplicado en agar
TSA, utilizando la técnica de vertido en cajas. A partir de
la dilución 10-5 de la suspensión de ensayo, se preparó la
suspensión de validación diluyéndola una cuarta parte. De
esta suspensión se preparó una dilución 10-1 y se sembró por
duplicado en agar TSA. Todas las cajas se incubaron durante
24 horas a 37ºC y se realizaron los respectivos recuentos.

La desinfección efectiva requiere control y monitoreo de todas

la etapas del proceso. Los procesos de limpieza, desinfección
y esterilización tienen como propósito remover o destruir
microorganismos. La selección del método de limpieza
y desinfección depende del riesgo de infección asociado
con el uso del objeto a desinfectar. Esto también depende
de la disponibilidad de método, del tiempo necesario para
el proceso y de la naturaleza del objeto, por ejemplo su
tolerancia al calor, a la humedad y a los agente químicos (2)
Los desinfectantes son agentes que eliminan microorganismos
pero no necesariamente sus esporas y no deben aplicarse
sobre tejidos sino sobre objetos inanimados, en contraste, los
antisépticos son agentes microbicidas que pueden aplicarse
sobre la piel y mucosas pero no pueden ser utilizados
internamente (3)
Materiales y métodos
Preparación de los cultivos de trabajo
Se prepararon tres pases de los microorganismos de ensayo
en agar TSA, incubando cada uno durante 24 horas a 37ºC,
a partir del tercer pase se elaboró la suspensión de ensayo
Establecimiento de las condiciones
experimentales
El ensayo se efectuó empleando una temperatura obligatoria
de 20º±1ºC y una adicional de 36º±1ºC. Los tiempos de
contacto entre el desinfectante y las cepas estudiadas se
ajustaron mediante un ensayo preliminar, teniendo en
cuenta las condiciones reales de uso del desinfectante
evaluado, alcohol glicerinado al 65%. De esta forma, se
implementaron los siguientes tiempos: 0, 2, 5 y 10 minutos.
El ensayo se realizó bajo condiciones limpias (0,3g/L
de albúmina de suero bovino) y bajo condiciones sucias
simuladas (3g/L de albúmina de suero bovino y 3g/L de
eritrocitos de oveja), siguiendo las especificaciones de la
norma. Los microorganismos evaluados fueron Pseudomonas
aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus ATCC
6538 y Enterococcus hirae ATCC 10541, establecidos en
la norma.
Implementación del método
Se pipeteó 1ml de la sustancia interferente en un tubo y
1ml de la suspensión de ensayo. Se mezcló y se colocó

73
Universitas Scientiarum, 2012, Vol. 17 N° 1: 72-81
en un baño de agua a la temperatura seleccionada durante
2min. Se añadieron 8ml de producto y luego de mezclar
se colocó el tubo en un baño de agua a la temperatura y
el tiempo seleccionados. Se tomó 1ml de esta mezcla y
se transfirió a un tubo que contenía 8ml de neutralizante
y 1ml de agua. El tubo fue colocado en un baño de agua a
20º±1ºC durante 5min. Se mezcló con vortex y se sembró
1ml por duplicado en agar TSA mediante la técnica de
vertido en caja. Las cajas se incubaron 24 horas a 37ºC
para luego efectuar el recuento. Se realizaron 6 réplicas
de cada ensayo.
Control de las condiciones experimentales
(Control A)
Se dispensó 1ml de la sustancia interferente y 1ml de la
suspensión de validación en un tubo. Luego de mezclar,
se colocó el tubo en un baño de agua a la temperatura
seleccionada durante 2min. Se añadieron 8ml de agua
destilada estéril, se mezcló y se colocó el tubo en un baño
de agua a la temperatura y tiempos seleccionados. Se mezcló
y se inoculó 1ml de esta mezcla por duplicado mediante la
técnica de vertido en caja. Las cajas se incubaron 24 horas
a 37ºC para luego efectuar el recuento. Se realizaron 6
réplicas de este control.
Control del neutralizante (Control B)
Se transfirieron 8ml del neutralizante (caldo Letheen) y
1ml de agua destilada estéril en un tubo. Se añadió 1ml de
la suspensión de validación. Se mezcló y se colocó el tubo
en un baño de agua a 20º±1ºC durante 5min. Se mezcló,
y se inoculó 1ml por duplicado utilizando la técnica de
vertido en caja. Las cajas se incubaron 24 horas a 37ºC
para luego efectuar el recuento. Se realizaron 6 réplicas
de este control.
Control del método dilución-neutralización
(Control C)
Se pipeteó 1ml de la sustancia interferente y 1ml de diluyente
en un tubo. Se añadieron 8ml de producto, se mezcló y se
colocó el tubo en un baño de agua a la temperatura y tiempos
seleccionados. Se mezcló y se transfirió 1ml de esta mezcla
a un tubo con 8ml de neutralizante. Se colocó el tubo en un
baño de agua a 20º±1ºC durante 5min. Se añadió 1ml de
la suspensión de validación, se mezcló y se colocó el tubo
en un baño de agua a 20º±1ºC durante 30min. Se mezcló
y se inoculó 1ml de esta mezcla por duplicado utilizando
la técnica de vertido en caja. Las cajas se incubaron 24
horas a 37ºC para luego efectuar el recuento. Se realizaron
6 réplicas de este control.
74
Verificación del método dilución-
neutralización
La verificación del método se realizó teniendo en cuenta el
cumplimiento de los límites básicos estipulados en la norma
y consignados en el numeral 5.7.3 de la misma.
Resultados y discusión
Establecimiento de las condiciones
experimentales para el método de ensayo
dilución-neutralización
Las condiciones experimentales establecidas por la norma
no presentaron modificaciones, a excepción del tiempo
de contacto de 60 min, el cual fue omitido ya que las
especificaciones del producto sugieren un tiempo de contacto
corto para ejercer su acción bactericida. Se establecieron los
tiempos de contacto 2, 5 y 10 minutos, luego de un ensayo
preliminar que demostró que el producto ejercía acción
bactericida en el menor tiempo de contacto (5 minutos).
Las condiciones experimentales obligatorias y adicionales
aplicadas en el ensayo se consignan en la figura 1.
Implementación y verificación del método
de ensayo dilución-neutralización según la
norma técnica colombiana 5473 del 2007
Preparación de la suspensión de ensayo y
validación
Se trabajó inicialmente con la cepa de Staphylococcus
aureus ATCC 6538. Para esto se tomó como referencia
el tubo Nº 1 del patrón de McFarland cuya concentración
celular es equivalente a 3x108 UFC/ml, para cumplir con las
exigencias de la norma que determina que el recuento en
esta suspensión debe ser entre 1,5x108 UFC/ml y 5,0x108
UFC/ml. La absorbancia fue calibrada a un valor de 0,2.
Sin embargo, al realizar el recuento este fue de 4x109 por
lo cual fue necesario preparar una suspensión nueva. De
acuerdo con lo anterior, se sugirió trabajar la suspensión
utilizando solución salina como diluyente omitiendo la
adición de triptona, ya que se tenía como hipótesis que
esto podría estar interfiriendo con la absorbancia propia
de la suspensión, se prepararon dos suspensiones, una
empleando únicamente solución salina como diluyente y
la otra utilizando el diluyente especificado en la norma, es
decir, solución salina más triptona. La absorbancia de ambas
suspensiones fue similar al patrón de McFarland (0,199).
Los resultados de los recuentos reflejaron que efectivamente,
Arias-Palacios, et al
 Método dilución neutralización aplicado a un desinfectante

Condiciones experimentales

OBLIGATORIA 20° +/- 1°C

TEMPERATURA

ADICIONAL 36°+/-1°C

0 min.

TIEMPO DE 2 min.
CONTACTO

5 min.

10 min.

Pseudomonas aeruginosa ATCC

15442

MICROOGANISMO Staphylococcus aureus ATCC

DE ENSAYO 6538

Enterococcus hirae ATCC

10541

Solución de Albúmina de suero bovino

Condiciones limpias
0,3 g/L
SUSTANCIA
INTERFERENTE
Mezcla de Eritrocitos de oveja 3 ml/L y
Condiciones sucias solución de albúmina de suero bovino
3 g/L

Figura 1. Condiciones experimentales obligatorias y adicionales aplicadas en el ensayo

la suspensión elaborada solo con solución salina cumplía
con las especificaciones de la norma tabla 1, mientras que
el recuento de la suspensión elaborada con triptona excedía
los requerimientos de la norma.
A partir de la suspensión de ensayo, se preparó la suspensión
de validación, siguiendo las especificaciones de la norma,
es decir a partir de una cuarta parte de la dilución 10-5 de la
Suspensión de ensayo. Igualmente se utilizó como diluyente
solución salina y el recuento fue adecuado para llevar a cabo
el procedimiento (Tabla 2).
Al preparar la suspensión de Pseudomonas aeruginosa
cepa ATCC 15442, siguiendo el procedimiento descrito
para la suspensión de Staphylococcus aureus, se notó que
la turbidez que proporcionaba una colonia de P. aeruginosa
era mayor comparada con una colonia de S. aureus,
posiblemente debido a que Pseudomonas aeruginosa es

75
Universitas Scientiarum, 2012, Vol. 17 N° 1: 72-81

Tabla 1. Especificaciones de la Norma 5473 ICONTEC

Límites básicos establecidos por la NTC 5473 del ICONTEC.

1,5 x 108 UFC/ml y 5 x 108

N 8,17 = Log N = 8,70
UFC/ml

No 1,5 x 107 UFC/ml y 5 x 107 UFC/ml 7,17 = Log No = 7,70

Esta comprendido entre
Nvo 30 UFC/ml y 160 UFC/ml

Nvo 300 UFC/ml y 1600 UFC/ml

A,B,C Son iguales o superiores a 0,5 (Nvo)

Al menos una concentración debe demostrar un LOG R ≥ 5 y al menos una concentración debe demostrar un Log
R<5
En el control de los recuentos de los valores medios ponderados el cociente no es inferior a 5 ni superior a 15

un microorganismo formador de biopelículas. Este tipo de
microorganismos son capaces de producir polisacáridos y
glicoproteínas para formar agregados entre sí (5). Por esta
razón, se ajustó la absorbancia a un valor medio (0,16). Esta
absorbancia emitió un recuento que permitió trabajar con
esta suspensión y elaborar a partir de ella, la suspensión de
validación (Tabla 2).
Tabla 2. UFC/ml en las suspensiones bacterianas
de ensayo (n) y validación (nv). Concentraciones de
los microorganismos utilizados, con recuentos entre
1,5x108 UFC/ml y 5,0x108 UFC/ml
Microorganismo N NV

Limpio Sucio Limpio Sucio

En otros estudios (6), se recomienda ajustar espectrofoto-
métricamente la densidad de las suspensiones bacterianas a P aeruginosa 1,6 x 108 1,9 x 108 3,8 x 102 4,4 x 102
620 nm de longitud de onda, para obtener una absorbancia
de 0,2 a 0,3 para bacilos Gram-negativos y de 0,3 a 0,4 para S. aureus 1,8 x 108 1,5 x 108 4,2 x 102 3,9 x 102
cocos Gram-positivos, lo cual puede ser útil al momento
E. hirae 4,6 x 108 1,5 x 108 1,1 x 103 3 x 102
de preparar una suspensión con un recuento comprendido
entre 1 y 3x108 UFC/ml.

Por otra parte, la preparación de la suspensión de la cepa
de Enterococcus hirae, utilizando como referencia la
absorbancia emitida por la suspensión de S. aureus (0,19) al
tratarse de microorganismos Gram-positivos con morfología
microscópicamente similar, arrojó una absorbancia final de
0,18. El recuento establecido fue el adecuado para trabajar
con esta suspensión (Tabla 2).
Esto permitió determinar que las temperaturas trabajadas
(20ºC y 36ºC), los interferentes, y los tiempos de exposición,
no inciden de forma negativa en el crecimiento de los
microorganismos.
Los resultados fueron similares para los dos interferentes.

Evaluación de las condiciones Verificación de la ausencia de toxicidad del

experimentales (Control A)
De acuerdo con la norma, los resultados de los recuentos
obtenidos en los parámetros de control no deben ser menores
a la mitad del recuento obtenido en cada parámetro al final
del tiempo cero de contacto. Esta condición fue satisfactoria
en este control, tal como se refleja en los resultados
experimentales consignados en la tabla 3.
neutralizante (Control B).
En este estudio se utilizó caldo Letheen que es un
medio altamente nutritivo compuesto por lecitina y
Tween 80, capaz de neutralizar o inhibir la acción de
los componentes activos del desinfectante, en este caso
alcohol, permitiendo la culminación de la reacción
bactericida.

76 Arias-Palacios, et al
 Método dilución neutralización aplicado a un desinfectante

Tabla 3. Parámetro A: control de las condiciones experimentales seleccionadas.

CONTROL A
Microorganismo
LIMPIO SUCIO
0min/ 0 min/ 2min/ 2 min/ 5 min/ 5 min/ 10 min/ 10 min/ 0min/ 0min/ 2min/ 2min/ 5min/ 5min/ 10min/ 10min/
20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C

32 36 30 28 27 19 16 16 37 39 22 28 24 25 20,5 26

34 32 28 30 28 21 19 21 35,5 36,5 25 27,5 21 22,5 26 26

P.aeruginosa

30 30 32 35 32 18 19 15 34 30 27 20,5 27 26 19 22

36 31 32 34 30 16 16 21 32 33 21 23 19 28 25 24,5

38 38 30 30 32 24 14 24 33,5 32,5 20 22,5 24 28 22 28

36 34 28 33 27 21 21 23 35 30 23,5 38,5 22,5 24,5 24,5 24,5

34,5 28,5 37 24,5 21,5 25 28,5 25 34 32 30,5 37 35,5 41,5 31,5 40,5

33 34 33 23 18 22,5 23 26 36 32,5 35 33 37,5 34 35 34

S.aureus

37 36 37 24,5 28,5 21,5 18 30 32 32 39 31,5 36,5 38 34 31,5

38,5 36 33,5 22,5 24 24,5 23 24 31 38 32 35 34,5 35,5 39 30,5

38 32,5 39 21,5 29 25,5 18 24 34,5 39 33 35 34,5 30 35 32

32 37 30 23,5 20 22,5 23 23 30,5 30 33 38 40 31 34,5 35

116 102 96 106,5 121 98 113,5 123 23 29,5 24,5 28,5 24 26 23 31

101 128 100 118 116 114 115 111,5 24 28,5 24,5 27,5 25 27 25 27,5
E hirae

100 112,5 113 118 108,5 116,6 110 105 27 24 24,5 28 23 26,5 22,5 25,5

114 106 125 109 112 127 131 96 26 25 25 27,5 26 28 22,5 25,5

110 105,5 125 121 115 120,5 111 114 27 26,5 23 30 22 28 25 30

104 110 114,5 103,5 122,5 111 106 102 26,5 29,5 25,5 31,5 24 29 24 28

Los datos recopilados en la tabla 4, muestran que el Tabla 4. Parámetro B: control del neutralizante
neutralizante permitió ampliamente el crecimiento de los (verificación de la ausencia de toxicidad del
microorganismos evaluados, y no presentó efectos negativos neutralizante)
que llegaran a ocasionar inhibición en los mismos.
Microorganismo Control B
33
36
Validación del método Dilución P. aeruginosa
34,5
32
Neutralización (Control C) 34
37
De igual manera que en los demás controles, el recuento de 39
todas las replicas en los diferentes tiempos y temperaturas 38
evaluados, fue superior a la mitad del recuento obtenido en S. aureus 39
37
el parámetro al final del tiempo de contacto cero, para los 36
tres microorganismos y las dos condiciones de limpieza 40
simuladas (Tabla 5). 111
93,5
E. hirae 106,5
Este parámetro de control permitió determinar que el método 117
118
está diseñado para conocer la acción bactericida de cualquier 120

77
Universitas Scientiarum, 2012, Vol. 17 N° 1: 72-81
desinfectante sin generar por si mismo efectos negativos
sobre el microorganismo control.
Ensayo NA – método dilución neutralización
Las suspensiones de ensayo de cada uno de los microorganismos
control propuestos en la norma se enfrentaron al desinfectante
para manos en gel a una concentración final de ensayo de
80% del producto.
El comportamiento de cada cepa evaluada fue diferente. La
cepa de S. aureus sólo presentó crecimiento en el tiempo 0,
el cual fue mayor a 330 que fue el límite máximo establecido
por la norma (Tabla 6). Esto debido a que en este tiempo,
el desinfectante es neutralizado inmediatamente después
de la adición del microorganismo, impidiendo que haya
un tiempo de contacto suficiente entre el desinfectante y
la suspensión.
En los demás tiempos evaluados no se presentó crecimiento
del microorganismo, con lo cual se comprueba que el
desinfectante es capaz de actuar desde 2 minutos de
contacto. Estos resultados están de acuerdo con los
resultados establecidos en estudios anteriores (7), en el cual
concentraciones mínimas de etanol causan ruptura celular y
cambios irregulares en la apariencia de las mismas, así como
afección en la función de la membrana celular, interferencia
en la división celular, afección en el crecimiento, variación
en la composición de los ácidos grasos y en la síntesis de
proteínas e inhibición en el transporte de nutrientes a la célula.
Por otra parte, P. aeruginosa mostró crecimiento leve
en todos los tiempos excepto en el tiempo 0 en el que
el recuento en todas la replicas fue mayor a 330 (Tabla
6). Debido a que en las replicas de los tiempos 2, 5 y
10 los recuentos oscilaron entre10 y 15 colonias, se
tomaron como menores a catorce por especificación de
la norma, lo que permitió obtener valores Na menores a
140. La resistencia de P. aeruginosa es atribuida a varios
factores que han sido consignados en diversos estudios
(8), estableció que las bacterias Gram-negativas poseen
reducida sensibilidad hacia los desinfectantes comparadas
con los estafilococos debido a los lipopolisacaridos
de su membrana externa que impiden el flujo de los
desinfectantes al interior de la célula.
Por otra parte (9), estableció que P. aeruginosa es capaz
de crecer en etanol e inducir enzimas capaces de oxidarlo
y metabolizarlo a acetato.
Se esperaba que E. hirae, se comportara de manera
similar al del microorganismo S. aureus por la similitud
78
en morfología y coloración que existe entre estos dos
microorganismos. Sin embargo, E. hirae a diferencia de
S. aureus presentó crecimiento en los tiempos 2, 5 y 10
de los ambos interferentes. Sin embargo, aunque presentó
crecimiento, el número de colonias fue menor a 12 por lo
cual se consideró la especificación de la norma y se reportó
el resultado como menor a 140.
Según el estudio realizado por (10), los enterococos
son importantes patógenos nosocomiales cuyo factor de
virulencia importante es su resistencia intrínseca y adquirida
a muchos agentes antimicrobianos; esto podría explicar
el crecimiento de la cepa de E. hirae, en los tiempos de
contacto 2, 5 y 10min.
En síntesis, el empleo de desinfectantes en gel cuyo principio
activo es alcohol, pueden constituir un mecanismo importante
de desinfección de manos en el ámbito hospitalario, y para
que su efecto sea notorio en bacterias Gram-negativas y otros
microorganismos de difícil eliminación se puede aumentar
la concentración de alcohol al tiempo que se manejen
emolientes que eviten el daño a la piel pero no interfieran
en la acción bactericida del desinfectante.
Verificación de la metodología
Se llevó a cabo de acuerdo con los numerales 5,7 y 5,8
de la NTC 5473 del ICONTEC, mediante la comparación
de la media aritmética de las replicas de los resultados
obtenidos con los límites básicos establecidos por la norma.
El parámetro de aceptación de la Norma es que al menos
una concentración debe demostrar un LOG R ≥ 5 y al menos
una concentración debe demostrar un Log R < 5
Recolección de la información
Para recolectar la información se emplearon los parámetros
establecidos por la norma técnica colombiana 5473 a partir de
la cual se tuvo en cuenta los procedimientos experimentales
para la determinación de la actividad bactericida del
desinfectante empleado.
Además se obtuvo información partir de consulta
bibliográfica con el fin de determinar los mecanismos
de acción del proceso de desinfección y su aplicación en
instrumental médico.
Para la recopilación de los datos experimentales se empleó
una matriz en la cual se registraron los resultados obtenidos
en cada una de las replicas a las condiciones de 38 tiempo,
temperatura, tipo de microorganismo, interferente y
concentración de los desinfectantes evaluados.
Arias-Palacios, et al
 Método dilución neutralización aplicado a un desinfectante

Por otra parte se emplearon tablas en la cual se C

registraron los resultados obtenidos a partir del conteo N =
(n1 + 0,1 n2)10-6 [1]
de células/ ml en cada uno de los ensayos y en los
controles realizados. Donde:

Análisis de información C es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;

Inicialmente se hizo una determinación de los valores Vc,
que son los valores experimentales que se obtuvieron en el
método de dilución-neutralización. Estos valores incluyen
los valores de ensayo y los controles.
n1 es el numero de los valores Vc tenidos en cuenta en la
dilución inferior, es decir (10-6);
n2 es el numero de valores Vc tenidos en cuenta en la
segunda dilución, es decir (10-7);

En el método de dilución-neutralización se tuvo en cuenta 10-6 es el factor de dilución correspondiente a la dilución

valores Vc entre un límite entre 14y 130 colonias. Para el
cálculo del número de células/ ml de la suspensión de ensayo
se calculó la media aritmética ponderada de los recuentos
de dos diluciones escogidas de esta suspensión. Para esto
se utilizara la siguiente fórmula:
inferior.
Para determinar el número de células/ml en la mezcla de
ensayo al comienzo del tiempo de contacto (No) es decir, al
tiempo cero, se obtuvo la decima parte de la media aritmética

Tabla 5. Parámetro c: validación del método de dilución neutralización.

Control C
Microorganismo

Limpio Sucio
0 0 2 2 5 5 10 10 0 0 2 2 5 5 10 10
min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/
20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C
38 37 36,5 28,5 32 34,5 34 37,5 31,5 33,5 30,5 31,5 34,5 35 38,5 33,5
32 36,5 32,5 31 28,5 37,5 40,5 36 33,5 38 38 37 32 39 30 36
p. aeruginosa

35,5 40 39 29 34 32 36 38 34 33,5 40,5 38,5 34,5 39 30 35

37 33 4 32 36,5 34,5 37 33,5 30,5 32 38 36 31 37 34 30,5
31,5 31,5 33,5 39 40 33 31,5 31,5 37 38 37,5 37,5 31,5 37 30 32,5
30 34 31,5 37,5 33,5 30 33 36 33 35 35,5 34 30 38 30 33
48,5 32 42,5 35 40,5 32 47,5 35,5 40,5 34,5 33,5 36,5 33 34,5 38,5 38,5
43,5 35,5 37,5 41,5 49 39,5 39 37 35,5 33,5 33,5 36,5 37 37,5 38,5 40,5
S. aureus

40 32 43 35,5 55 34,5 42 34 36 36,5 35,5 31,5 35,5 35 38 35

37 32,5 39 41,5 42,5 30,5 54 43,5 35,5 42 32,5 40,5 36 34 38,5 38
40,5 36 38 34,5 44,5 37 46 39 37,5 34 37 38,5 33 33,5 34,5 32,5
39,5 35,5 34,5 32,5 49 34 48,5 38,5 34 39 36,5 34,5 41 37,5 36 30
93,5 115,5 95 114 111,5 95,5 95 105,5 28 28,5 32,5 24 26,5 30,5 26 27
96,5 117 95,5 114,5 107 98 95,5 109 23,5 24,5 25,5 27,5 26 25,5 25 26,5
E. hirae

99 108,5 128,5 100,5 108,5 109,5 128,5 95 33,5 27,5 26 25,5 23,5 24 23,5 24,5
119,5 101 105 94 125 98,5 105 102 25,5 28 29,5 29 27 27,5 25,5 24
122 99,5 115,5 113,5 119 102 115,5 100,5 24 24,5 29 25,5 26 25 27 27
126,5 112 127 95,5 127,5 105,5 127 97,5 25 28,5 25,5 25,5 23,5 26 24 25,5

79
Universitas Scientiarum, 2012, Vol. 17 N° 1: 72-81

Tabla 6. Ensayo na: determinación de la actividad bactericida del producto.

Ensayo
Microorganismo

Limpio Sucio
0 0 2 2 5 5 10 0 0 2 2 5 5
10 min/ 10 min/ 10 min/
min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/ min/
20°C 20°C 36°C
20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C 20°C 36°C
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
P. aeruginosa

>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
S. aureus

>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
E. hirae

>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14
>330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14 >330 >330 <14 <14 <14 <14 <14 <14

ponderada de N (número de células/ml en la suspensión de Para calcular el número de sobrevivientes en el control de las
ensayo) debido a que por la adición del producto y de la condiciones experimentales (tiempo, temperatura, sustancia
sustancia interferente se obtiene una dilución a la decima interferente), control del neutralizante y estandarización
parte. del método al final del tiempo de contacto, se empleó la
siguiente fórmula:
Para la determinación del número de microorganismos
supervivientes/ml en la mezcla de ensayo al final del tiempo = C
A,B,C [4]
de contacto y antes de la neutralización (Na), se empleó la n
siguiente fórmula:
C X 10
Na = [2] Donde:
n
c es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta;
C n es el número de valores Vc tenidos en cuenta
Nvo = [3]
n
La tabulación de los datos se hizo teniendo en cuenta la
Donde: matriz de resultados relacionando lo obtenido en cada
C es la suma de los valores Vc tenidos en cuenta uno de los ensayo con las condiciones experimentales
n es el número de valores Vc tenidos en cuenta. trabajadas.

80 Arias-Palacios, et al

Conclusiones
Se determinó que las condiciones experimentales del ensayo
deben establecerse teniendo en cuenta las condiciones
reales a las que se verá sometido el desinfectante a evaluar;
para este fin, deben tenerse en cuenta las especificaciones
del fabricante, el principio activo del desinfectante, su
presentación e incluso el lugar donde se va a utilizar.
Los resultados obtenidos en este estudio elucidan que el
método dilución neutralización de la NTC 5473, resulta
confiable para evaluar la actividad bactericida de un
desinfectante. De este modo, la norma garantiza a quien
emplee su método dilución neutralización, la consecución
de resultados confiables y el control de los parámetros que
pudieran tener un efecto letal sobre los microorganismos de
la prueba. Mediante el análisis de los resultados obtenidos
en el ensayo y en los parámetros de control se determinó
que no se generan inhibiciones del crecimiento bacteriano
por motivos diferentes a la acción del producto a evaluar,
tal como la metodología, las condiciones experimentales y
la sustancia neutralizante. La elaboración del informe del
ensayo permitió reportar y verificar los resultados obtenidos,
comparándolos con los límites exigidos por la norma en
pro de determinar su validez. Se encontró que el diluyente
citado en la norma para la preparación de las suspensiones
de ensayo y validación, puede interferir con la lectura de la
absorbancia; además, si la suspensión de ensayo cumple con
la absorbancia teórica del patrón número 1 de Mc Farland, al
utilizar la cuarta parte de la dilución 10-5 de la suspensión de
ensayo, el recuento de la suspensión de validación cumple
con el rango de especificación de la norma.
Para la preparación de la suspensión de ensayo de P.
aeruginosa y E. hirae, es preferible, ajustar la suspensión
a una concentración alta (absorbancia de 620 nm) y realizar
el recuento, el cual servirá para preparar las suspensiones
por el método de dilución.
Financiación
Este trabajo fue financiado por Laboratorios Vicar de
Colombia
Método dilución neutralización aplicado a un desinfectante
Conflicto de intereses
Los autores manifiestan no tener conflicto de intereses
Referencias
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