CRISPR

Los CRISPR (en inglés: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, en
español repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas2) (/
krɪspər /) son familias de secuencias de ADN en bacterias. Las secuencias contienen
fragmentos de ADN de virus que han atacado a las bacterias. Estos fragmentos son
utilizados por la bacteria para detectar y destruir el ADN de nuevos ataques de virus
similares, y así poder defenderse eficazmente de ellos. Estas secuencias juegan un papel
clave en los sistemas de defensa bacterianos, y forman la base de una tecnología conocida
como CRISPR / Cas9 que efectivamente y específicamente cambia los genes dentro de los
organismos. En terminos más técnicos son loci de ADN que contienen repeticiones cortas
de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador"
proveniente de exposiciones previas a un virus.3 Se encuentran en aproximadamente el
40% de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas.4
5 Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas, que codifican para
proteínas nucleasas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema
inmune procariótico que confiere resistencia a agentes externos como plásmidos y fagos6
7 y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen
secuencias específicas y guían a las nucleasas cas para cortar y degradar esos elementos
génicos exógenos de una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos.3

Desde 2013, el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando,

interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación
génica en varias especies.8 Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una
célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán
complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de
genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la
maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones
recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los
genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética.

Quizá puedan usarse los CRISPRs para construir sistemas de entrega de genes guiados por
ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.9

Las bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden
tomar ADN dañado de su medio.

Las secuencias repetidas que luego se conocerían como CRISPR fueron identificadas por
primera vez por un grupo de científicos japoneses en 1987 (Yoshizumi Ishino et al).1112y
luego más tarde de forma independiente por el científico Francisco J. M. Mojica
(Universidad de Alicante) a principios de los años 90 en una arquea Haloferax mediterranei
y los resultados fueron publicados en 1993,13 tras haber sido anteriormente descritas en
bacterias (Escherichia coli12 y Mycobacterium bovis14). Inicialmente fueron utilizadas para
el tipado de bacterias, para diferenciar distintos aislados, cepas y especies.15 Estudios
iniciales por Francisco J. M. Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas
secuencias en la partición de replicones.16 En el año 2000, Francisco J. M. Mojica y
colaboradores detectaron un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias,
arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR,
en español "Repetidos Cortos Regularmente Espaciados" o bien "Repeticiones Cortas
Regularmente Espaciadas").17 Pocos años después, Francisco J. M. Mojica propuso y acuñó
el acrónimo CRISPR (del inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats),
propuesta que quedó recogida en una publicación de microbiólogos holandeses en 200218
y que sería utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias.
También, en la misma publicación, se describieron por vez primera un conjunto de genes,
algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas, asociados a las secuencias
repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR: del inglés: CRISPR associated).18

En el 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los

espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y
ADN extracromosomal como los plásmidos.1920 Nuevamente fue el grupo de Francisco J.
Mojica quien primero se dio cuenta que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados
podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos
procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad.21 Esas
observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad
adaptativa en las bacterias.1 Koonin y sus asociados22 propusieron que los espaciadores
sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes
llamado interferencia por ARN.

En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo

de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia de
Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador.22

Cas9

Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier habían estado explorando de manera

independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan
a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntas, estudiaron un sistema CRISPR más
simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden
ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula
de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA)
y también Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.22
Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte
activos (HNH and RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que
podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico
para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una
molécula llamada single-guide RNA que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar
los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse
para la edición de genes.22

La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería
genética en cultivos de células humanas fue en 2012.2324 Desde entonces se ha utilizado
en muchos organismos, incluida la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae),25 el pez
cebra (Danio rerio),26 la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster),27 nematodos
(Caenorhabditis elegans)28 plantas29 y ratones,30 entre otros.

Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción

programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.31

Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.22

La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos

vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones
de desórdenes genéticos del hígado.32