Práctica No.

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Espectrofotometría de absorción visible

FUNDAMENTO TEÓRICO:

Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación

electromagnética que es absorbida o emitida por una sustancia. En función de ello se clasifican
fundamentalmente en:

 Métodos de absorción: Se basan en la disminución de la potencia de un haz de radiación

electromagnética al interaccionar con una sustancia.

• Métodos de emisión: Se basan en la radiación que emite una sustancia cuando es excitada
previamente por medio de otro tipo de energía (térmica, eléctrica…).

• Métodos de fluorescencia: Se basan en la radiación que emite la sustancia cuando es excitada

previamente por un haz de radiación electromagnética.

Otras clasificaciones de los métodos espectroscópicos se establecen en función de la región del

espectro electromagnético que interviene en la técnica. Así, pueden utilizarse regiones como rayos
X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. En la Figura 1 pueden verse las regiones del
espectro electromagnético, en función de los valores de la longitud de onda (λ) de cada radiación:

En la figura 1 puede también observarse como la luz visible para el ojo humano constituye
únicamente una pequeña parte del espectro electromagnético.
La base de la espectrofotometría es la ley de Lambert-Beer, la cual se sintetiza en el siguiente
enunciado:

“La cantidad de luz absorbida por una solución coloreada es directamente proporcional a la
concentración o a la cantidad de partículas coloreadas en dicha solución”.

La palabra espectrofotometría deriva de tres raíces: espectro (ver), foto (luz) y metría (medición).

Al incidir radiación electromagnética visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o
totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecerá de color negro y en el segundo de color
blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir
un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, éste absorberá
ciertas longitudes de onda y reflejará otras, siendo éstas últimas las responsables del color. Se dice
que este color (observado) es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera
detectar. Dado que en la parte experimental de esta práctica las medidas van a realizarse con
espectrofotometría visible, es conveniente conocer para qué longitud de onda tiene cada color su
máxima absorción, lo que se muestra en la tabla siguiente:

Componentes del espectrofotómetro:

Para medir los valores de absorbancia y transmitancia de una disolución se utilizan

espectrofotómetros UV-Vis, que, como puede verse en la Figura 2, se componen de cinco elementos
principales:

● Una fuente de radiación que suele ser una lámpara de filamento de wolframio

● Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada originando un haz
monocromático.

●Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material que permite
el paso de la radiación en la región del espectro de interés. Suelen ser de vidrio, plástico o cuarzo.
El espesor de la cubeta más habitual es 1 cm.

● Un detector que convierte la energía radiante en una señal eléctrica.

● Una pantalla de visualización

La absorbancia está relacionada con la concentración de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer,

que se resume con la ecuación: A = ε b c , donde c se expresa en mol/L, b es la longitud del camino
óptico (anchura de la célula que contiene la disolución de la sustancia) y se expresa en cm, y ε es la
absortividad molar, propiedad característica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de
radiación que absorbe a una longitud de onda determinada por unidad de concentración, siendo
sus unidades L mol-1cm-1

Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de
onda puesto que tanto A como ε varían con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de
absorción de la sustancia, que consiste en una representación de los valores de absorbancia frente
a la longitud de onda expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorción puede
seleccionarse el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima.

Si bien la ley de Lambert-Beer indica que a una representación gráfica de la absorbancia frente a la
concentración le correspondería una línea recta, esto sólo tiene lugar para disoluciones diluidas, por
ello, no es conveniente utilizar la expresión matemática directamente, sino construir en cada caso
la recta de calibrado que confirme que la ecuación de Lambert-Beer se cumple en el intervalo de
concentraciones en el que se trabaja. Esta recta se construye midiendo la absorbancia de una serie
de disoluciones de concentración perfectamente conocida.

PRÁCTICA No. 2

Objetivo:

Adquirir los conocimientos básicos sobre espectrofotometría de absorción visible, incluyendo la Ley
de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Bioquímica. Para ello se realizará un experimento en el
laboratorio que muestre cómo utilizar un espectrofotómetro así como también saber preparar un
espectro de absorción y una curva de calibración.

Material y Reactivos:

Material:

10 tubos de ensayo con capacidad de 12ml.

1 gradilla

1 Perilla

1 pipeta graduada de 10ml

1 pipeta graduada de 1ml

Reactivos:

Azul de anilina 300mg/L

Anaranjado de metilo 300mg/L

Eosina 300mg/L

Azul de metileno 300mg/L

NOTA: Cada equipo de trabajo utilizará un colorante. Deberá trabajarse cada solución por separado
y en forma simultánea.

Procedimiento:

Prepare una dilución de las siguientes diluciones: 1/10, a partir de las diluciones madres y agua
destilada. Mezclar bien y proceda a leer en el espectrofotómetro como se indica a continuación:

a) Encender el aparato y dejarlo calentar de 5 a 10 minutos.

b) Seleccionar la longitud de onda adecuada
c) Calibrar el aparato de 0% de absorbancia

La dilución se somete a lecturas contra el blanco de agua destilada, variando cada vez la longitud de
onda de 20 unidades, iniciando la lectura en 400 nm y finalizando en 700nm (espectro visible). Se
anotan las lecturas correspondientes a cada longitud de onda y se grafican los valores de la longitud
de onda de las abscisa y la absorbancia o el % de transmitancia en la ordenada, en papel milimétrico.
 RESULTADOS DE ABSORBANCIAS DE BARRIDO

Absorbancia Eosina Anaranjado de Azul de anilina Azul de

(nm) metilo metileno
400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
660
680
700

Actividad:

Graficar la absorbancia en la ordenada y la concentración de la abscisa, en papel milimétrico.

Para la demostración de la ley de Lambert-Beer a partir de la solución madre (en nuestro caso será
la dilución1/10), se hace una serie de diluciones como sigue: 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60,
1/70, 1/80, 1/90, 1/100. Preparadas las mezclas se hacen las lecturas de cada una, a la longitud de
onda seleccionada en el paso anterior. Se anotan las lecturas.

RESULTADOS DE ABSORBANCIAS DE LAS DILUCIONES

Absorbancias Eosina Anaranjado de Azul de anilina Azul de metilo

Diluciones (nm) metilo
1/10
1/20
1/30
1/40
1/50
1/60
1/70
1/80
1/90
1/100
Actividad: Graficar la concentración en la abscisa contra la absorbancia en la ordenada en papel
milimétrico.
DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PARTE EXPERIMENTAL
 CUESTIONARIO

1.- En que se basa la espectrofotometría.

2.- Enuncie el fundamento de la ley de Lambert-Beer.

3.- ¿Cuáles son las características de la luz?

4.- Mencione cuatro componentes del espectrofotómetro y explique su función.

5.- ¿Qué es una curva de calibración?

6.- Mencione los pasos para el manejo del espectrofotómetro.

7.-Defina los siguientes términos: ruido y desplazamiento.

8.- Defina transmitancia y absorbancia.

9.- Mencione la clasificación de espectroscopia y sus características.

10.- ¿Cuál fue la longitud de onda elegida para medir la absorbancia de su colorante?

BIBLIOGRAFÍA
TEXTO AUTOR PÁGINAS EDITORIAL

DATOS DEL ESTUDIANTE

NOMBRE EQUIPO GRUPO CALIFICACIÓN
Y
CÓDIGO