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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE


PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Stella Maria Andrade Gomes Barreto

UTILIZAÇÃO DO SUBPRODUTO DO BENEFICIAMENTO DO SISAL (Agave


sisalana Perrine): DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES
COSMÉTICAS E AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA.

NATAL-RN
2017
STELLA MARIA ANDRADE GOMES BARRETO

UTILIZAÇÃO DO SUBPRODUTO DO BENEFICIAMENTO DO SISAL (Agave


sisalana Perrine): DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES
COSMÉTICAS E AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFICÁCIA.

Dissertação apresentada à Coordenação do Programa de


Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, para
obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dr. Márcio Ferrari


Coorientadora: Profa. Dra. Raquel Brandt Giordani

NATAL - RN
2017
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS

Barreto, Stella Maria Andrade Gomes.


Utilização do subproduto do beneficiamento do sisal (Agave sisalana
Perrine): desenvolvimento de nanoemulsões cosméticas e avaliação da
segurança e eficácia / Stella Maria Andrade Gomes Barreto. - Natal, 2017.
118f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências


Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
Orientador: Márcio Ferrari.
Coorientadora: Raquel Brandt Giordani.

1. Agave sisalana - Dissertação. 2. Antioxidante - Dissertação. 3.


Cosméticos - Dissertação. 4. Nanoemulsão - Dissertação. I. Ferrari, Márcio.
II. Giordani, Raquel Brandt. III. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 633.526.2


STELLA MARIA ANDRADE GOMES BARRETO

UTILIZAÇÃO DO SUBPRODUTO DO BENEFICIAMENTO DO SISAL


(Agave sisalana Perrine): DESENVOLVIMENTO DE NANOEMULSÕES
COSMÉTICAS E AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E EFiCÁCIA.

Banca Examinadora:

___________________________________________

Profa. Dra. Vera Lúcia Borges Isaac


Examinador Externo - UNESP

Natal, 31 de Março de 2017.

NATAL/RN
2017
Dedico este trabalho: a todos os meus familiares, em
especial aWallério e Adna, fonte de entusiasmo e
amor; ao Prof. Márcio Ferrari, sem o qual nada
teria sido possível.
AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Márcio Ferrari, pelo trabalho que pôs em
minhas mãos, por toda paciência, cumplicidade, dedicação e cobrança, fundamentais
ao desenvolvimento deste trabalho. Por ter me acolhido ainda na Iniciação científica
e me guiado nessa caminhada.

A Professora Dra. Raquel Brandt Giordani, pela coorientação e valiosas


considerações feitas nesse trabalho.

A minha banca de qualificação, Profa. Ana Paula Gomes, Profa.


Cristiane Assis e Prof. Arnóbio, pelas sugestões que contribuíram para o
enriquecimento deste trabalho.

A todos os meus familiares por sempre apoiarem e incentivarem as


minhas decisões em especial a Wallerio e Adna.

Aos amigos do Laboratório de Cosméticos (LACOS), pelas discussões,


incentivo e alegrias proporcionadas, em especial a Matheus, Mayara, Danilo, Hugo,
Alvaro, , Gabriel e Nara(re).

Ao meu amigo Renato César por ter me ensinado a levar a vida


acadêmica de uma maneira mais leve, por ter me ouvido quando precisei desabafar,
por ter me proporcionado ridadas deliciosas... mesmo nos dias mais difíceis, enfim...
por todo companherismo e amizade.

A Emanuelle Patrícia, amiga pernambucana que o laboratório me deu,


por todo incentivo, mesmo que distante.

A professora Dra. Elissa Ostrosky pelas contribuições, ensinamentos e


acompanhamento no estágio à docência.

Aos professores, Dra. Patrícia Santos, Dr. Hugo Rocha e Dra. Valéria
Sales pelas contribuições, essenciais para a realização deste trabalho.
Agradeço imensamente a colaboração dos Laboratórios LASID e
BIOPOL em especial as pessoas de Renato, Bartolomeu (Bartô),Gutemberg (Guto),
Thayane, Débora, Lucas, André, Alexandrino, Henrique e Marília.

Não podia deixar de agradeçar também a Mariana, Érica, Kamilla,


Eduardo, Letícia e Rafaela pela contribuição dada a este trabalho.

A empresa SISALTEC pela doação do resíduo do beneficiamento do


sisal (Agave sisalana).

A UFRN e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas,


pela possibilidade de realizar esse trabalho de mestrado.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior


(CAPES) pelo suporte financeiro durante o período de realização desta dissertação.
RESUMO

O beneficiamento das folhas de Agave sisalana fornece a fibra, com valor


agregado para a indústria de sisal, e o restante do material vegetal, denominado de
subproduto, que é descartado, gera impacto ambiental. Diferentes aplicações têm sido
atribuídas, no entanto, não existem pesquisas científicas que apontem a utilização
deste subproduto como matéria-prima cosmética. O objetivo dessa pesquisa foi obter
e caracterizar uma fração enriquecida em polissacarídeos (FrE) a partir do subproduto
de Agave sisalana, avaliar a segurança in vitro e in vivo, bem como a atividade
antioxidante in vitro, e, então, desenvolver uma nanoemulsão hidratante. A partir da
porção líquida do subproduto foram obtidos o extrato bruto (EB) e duas frações. O EB
e as frações foram avaliados quanto à presença de açúcares, proteínas e polifenois.
A segurança foi avaliada por meio dos testes de citotoxicidade e fototoxicidade in vitro
utilizando o método colorimétrico do vermelho neutro. A irritabilidade primária foi
verificada pelo teste de contato (patch test). A capacidade antioxidante foi avaliada
pelos métodos de sequestro de DPPH e molibdênio. Diferentes sistemas foram
obtidos por meio de pseudodiagrama ternário, aditivados ou não com 0,5% de FrE. As
formulações selecionadas foram submetidas aos testes de estabilidade preliminar e
acelerada por um período de 90 dias. A eficácia hidratante foi avaliada quanto ao
conteúdo hídrico do estrato córneo e quanto à perda de água transepidermal por um
período de 5 horas. As amostras apresentaram, como constituintes químicos,
açúcares, polifenois e proteínas. A FrE não apresentou potencial citotóxico ou
fototóxico, não foi irritante e pode ser considerada um ativo com propriedade
antioxidante. Nanoemulsões estáveis contendo 40% de fase oleosa, 10% de
tensoativos e 50% de fase aquosa foram obtidas. A nanoemulsão foi capaz de
aumentar significativamente o conteúdo hídrico e manter a função de barreira da pele
após 5h de uma única aplicação. A fração obtida do subproduto industrial de Agave
sisalana apresenta um perfil promissor como matéria-prima cosmética para cuidado
da pele com capacidade antioxidante e hidratante, em conjunto com a possibilidade
de agregar valor ao resíduo industrial, reduzindo os danos provocados ao meio
ambiente pelo descarte desse material.

Palavras chave: Agave sisalana, antioxidante, cosméticos, hidratação, nanoemulsão.


ABSTRACT

The processing of the leaves of Agave sisalana provides fiber, with added value
for the sisal industry, and the rest of the plant material, known as by-product, is thrown
and generates environmental impact. Different applications have been attributed,
however, there are no scientific researches that aim to use this product as a cosmetic
raw material. The objective of this research was to obtain and characterize
polysaccharides-enriched fraction (FrE) from the Agave sisalana by-product of, assess
the safety in vitro and in vivo, as well as to evaluate the antioxidant activity in vitro, and
then to develop a nanoemulsion with moisturizer effect. From the liquid portion of the
by-product obtained the crude extract (EB) and two fractions resulting from extractive
process. The EB and the fractions were evaluated for the presence of sugars, proteins
and polyphenols. Safety was evaluated by cytotoxicity and phototoxicity in vitro assays
using the colorimetric method of Neutral Red. Irritability was evaluated by the primary
contact test (patch test). The antioxidant capacity was assessed using the DPPH
scavenging tests and molybdenum method. Different systems were obtained by means
of pseduodiagrama ternary containing, or not, 0.5% FrE. The selected formulations
were submitted to preliminary stability tests and accelerated in different temperatures
conditions for a period of 90 days. The moisturizing efficacy was evaluated by water
content of the stratum corneum and transepidermal water loss for a period of 5 hours.
The samples presented as chemical constituents, sugars, polyphenols and proteins.
The FrE showed no phototoxic potential or cytotoxic, and was not irritating to skin of
volunteers and can be considered an asset with antioxidant property Nanoemulsion
containing 40% oil phase, 50% aqueous phase and 10% surfactants was stable for 90
days.The nanoemulsion was able to significantly increase the water content and
maintain skin barrier function after 5 hours from a single application. The fraction
obtained from the industrial by-product of Agave sisalana demonstrated a promising
profile as raw material for cosmetic skin care with moisturizing and antioxidant
capacity, together with the possibility of adding value to industrial waste, reducing the
damage caused to the environment by disposing of this material.

Key words: Agave sisalana, antioxidant, cosmetics, moisturizing, nanoemulsions.


LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Agave sisalana Perrine. 20

Figura 2 Processo de desfibramento das folhas de Agave sisalana 21


e descarte do resíduo.

Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de obtenção 29


de sistemas nanoestruturados por meio de
homogeneizador ultrassônico.

Figura 4 Processos de instabilidade que podem ocorrer em 30


emulsões.

Figura 5 Representação esquemática da reação de redução da 37


molécula de DPPH por moléculas antioxidantes.

Figura 6 Esquema de obtenção da fração enriquecida em 45


polissacarídeos.

Figura 7 Representação gráfica do pseudodiagrama ternário com 54


a localização dos pontos correspondentes à composição
das formulações.

Figura 8 Cromatograma obtido por cromatografia em camada 62


delgada do EB e suas frações, FrE e FrP.

Figura 9 Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto (EB) e da 68


fração enriquecida em polissacarídeos (FrE).

Figura 10 Avaliação da fototoxicidade do extrato bruto (EB) e da 70


fração enriquecida em polissacarídeos (FrE).

Figura 11 Avaliação da irritabilidade primária da fração enriquecida 71


em polissacarídeos obtida do extrato bruto do subproduto
de Agave sisalana.

Figura 12 Avaliação da capacidade antioxidante da fração FrE 72


frente ao sequestro de radicais DPPH.

Figura 13 Pseudodriagrama ternário de fases para os sistemas 76


constituídos de Caprylic/CapricTriglyceride, Ethylhexyl
Palmitate e Isostearyl Neopentanoate, Polysorbate 80,
Sorbitan Monooleate e água destilada, adicionados ou
não de 0,5% de fração enriquecida em polissacarídeos.

Figura 14 Distribuição do tamanho de gotícula das amostras 15_TS 85


e 15AF_TS após diferentes condições de temperatura
(4°C, 25°C e 45°C) em função do tempo (30, 60 e 90
dias).
Figura 15 Distribuição de tamanho de gotícula (intensidade vs 87
diâmetro de gotícula) obtida por Dynamic Light
Scattering.

Figura 16 Valores de polidispersividade (PDI) obtidos para as 88


formulações 15_TS e 15AF_TS após diferentes
condições de temperatura (4°C, 25°C e 45°C) em função
do tempo (30, 60 e 90 dias).

Figura 17 Valores de potencial zeta obtidos para as formulações 89


15_TS e 15AF_TS após diferentes condições de
temperatura (4°C, 25°C e 45°C) em função do tempo (30,
60 e 90 dias).

Figura 18 Valores do conteúdo hídrico do estrato córneo (Unidades 91


Arbitrárias) antes (basal) e 1, 2, 3, 4 e 5 horas após única
aplicação das formulações em estudo. Os resultados
estão representados em valores médios ± Erro padrão da
média.

Figura 19 Valores da perda de água transepidermal (g/mm2.h) 93


antes (basal) e 1, 2, 3, 4 e 5 horas após única aplicação
das formulações em estudo. Os resultados estão
representados em valores médios ± Erro padrão da
média.
LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 Classificação botânica de Agave sisalana. 22

Quadro 2 Escala de avaliação preconizada pelo International Contact 50


Dermatitis Research Group Guidelines (IRCDG).

Quadro 3 Descrição das áreas demarcadas nos antebraços dos 58


voluntários para aplicação das formulações durante o
estudo da eficácia hidratante.

Tabela 1 Ingredientes selecionados para desenvolvimento das 52


formulações, fases de adição e funções.

Tabela 2 Composição das formulações (% p/p) obtidas pelo 54


pseudodiagrama ternário com suas respectivas
localizações.

Tabela 3 Características organolépticas apresentadas pelos pós 60


liofilizados do extrato bruto de Agave sisalana e suas
frações (FrP e FrE).

Tabela 4 Composição monossacarídica após o processo de hidrólise 64


ácida com ácido trifluoroacético (2M) para o EB e suas
frações (FrP e FrE).

Tabela 5 Quantificação de açúcares totais, proteínas e compostos 66


fenólicos. Os resultados foram apresentados em média
percentual ± desvio padrão.

Tabela 6 Avaliação macroscópica após 24 horas de preparo e teste 74


de centrifugação para determinação do EHL requerido.

Tabela 7 Composição das formulações selecionadas para os testes 77


de estabilidade preliminar (% p/p).

Tabela 8 Avaliação macroscópica das formulações 24 horas após o 78


preparo e teste de centrifugação

Tabela 9 Valores de tamanho de gotícula e polidispersividade, 79


expressos em média e desvio padrão para as formulações
selecionadas.

Tabela 10 Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar 81


para as amostras obtidas com tensoativos isolados (TS).

Tabela 11 Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar 82


para as amostras obtidas com tensoativos adicionados na
fase oleosa (TFO).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Abs absorbância
AF Adicionada com a fração enriquecida em polissacarídeos
ANOVA Análise de Variância
Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária
A/O Emulsão água em óleo
AQP Aquaporina
ATCC American Type Culture Collection
BHA Butilhidroxianisol
BHT Butilidroxitolueno / Butylhydroxytoluene
BraCVAM Brazilian Center for Validation of Alternative Methods
CAT Capacidade antioxidante total
CCD Cromatografia em camada delgada
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CEUAs Comissões de Ética no Uso de Animais
CIR Cosmetic Ingredient Review
CIUCA Cadastro das Instituições de uso científico de animais
Conab Companhia Nacional de Abastecimento
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COSING European Commision Health and Consumers – Cosmetics
Ingredients and Consumers
DLS Dynamic Light Scattering
DMEM Dulbecco’s Modifield Eagle’s Medium
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidade óptica
DPPH 2,2-difenil-1-pricrilhidrazil
EB Extrato bruto
EC Estrato córneo
CE Concentração efetiva
EC50 Concentração efetiva
ECACC European Collection of Cell Cultures
ECVAM European Center for Validation of Alternative Methods
EDTA Disodium EDTA
EG Estrato granuloso
EHL Equilíbrio hidrófilo-lipófilo
EL Estrato lúcido
EsB Estrato basal
EsE Estrato espinhoso
EURL - European Union Reference Laboratory for Alternatives to
ECVAM Animal Testing
FrE Fração enriquecida em polissacarídeos
FrP Fração obtida do precipitado
H Homogênea
IC Concentração inibitória
ICCVAM Interagency Coordinating Committee on the Validation of
Alternative Methods
IM Intensamente Modificado
INCI International Nomeclature of Cosmetic Ingredients
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
IRCDG International Contact Dermatitis Research Group Guidelines
ISO International Organization for Standardization
LM Levemente modificado
M Modificado
MCTI Ministerio da Ciência, Tecnologia e Informação
MPE Mean Phototoxic Effect
NMF Natural Moisturizing Factor
NRU Neutral Red Uptake
O/A Óleo em água
OECD Organisation for Economic Co-operation and Development
PDI Polidispersividade
pH Potencial hidrogeniônico
PIF Photo Irradiation Factor
PLAS Phase Analysis Light Scattering
PLS Projeto de Lei do Senado
QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship
RENAMA Rede Nacional de Métodos Alternativos
RNA Ácido ribonucleico
SF Separação de fases
SLO Sistema líquido opaco
SLT Sistema líquido transparente
SLTL Sistema líquido translúcido
SVO Sistema viscoso opaco
SVT Sistema viscoso transparente
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TEWL Transepidermal Water Loss
TFA Tensoativos na fase aquosa
TFO Tensoativo na fase oleosa
TS Tensoativos isolados
U.A. Unidades arbitrárias
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
UNIC Univesidade de Cuiabá
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UR Umidade relativa
UV Ultravioleta
UVA Ultravioleta A
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 20
2.1 Agave sisalana PERRINE 20
2.1.1 Descrição botânica 22
2.1.2 Composição química do subproduto do beneficiamento
de Agave sisalana 23
2.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE INGREDIENTES
VEGETAIS PARA USO COSMÉTICO 23
2.2.1 Aspectos éticos e legais 24
2.2.2 Métodos alternativos para avaliação da segurança de
ingredientes cosméticos 26
2.3 NANOEMULSÃO 28
2.4 BIOLOGIA DA PELE E ENVELHECIMENTO CUTÂNEO 31
2.5 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE INGREDIENTES E 35
FORMULAÇÕES COSMÉTICAS
2.5.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro 36
2.5.2 Biometrologia cutânia e eficácia clínica hidratante de
produtos cosméticos 39
3 OBJETIVOS 42
3.1 OBJETIVO GERAL 42
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 42
4 MATERIAL, MÉTODOS E CASUÍSTICA 43
4.1 MATERIAL 43
4.2 MÉTODOS 45
4.2.1 Obtenção do subproduto de Agave sisalana (sisal) 45
4.2.2 Obtenção do extrato bruto e da fração enriquecida em
polissacarídeos 45
4.2.3 Caracterização preliminar qualitativa do extrato bruto de
Agave sisalana e suas frações quanto à presença de
açúcares 46
4.2.3.1 Análise cromatográfica por cromatografia em camada
delgada (CCD) 46
4.2.3.2 Determinação da composição monossacarídica do extrato
bruto de Agave sisalana e suas frações 46
4.2.4 Caracterização química do extrato bruto de Agave sisalana
e suas frações 47
4.2.4.1 Dosagem de açúcares totais 47
4.2.4.2 Dosagem de proteínas 47
4.2.4.3 Dosagem de compostos fenólicos 47
4.2.5 Avaliação da segurança do extrato bruto e da fração
enriquecida em polissacarídeos do subproduto 47
4.2.5.1 Avaliação da segurança in vitro 47
4.2.5.1.1 Cultura de células 48
4.2.5.1.2 Avaliação da citotoxicidade 48
4.2.5.1.3 Avaliação da fototoxicidade 49
4.2.5.2 Avaliação da compatibilidade cutânea 49
4.2.5.2.1 Avaliação da irritabilidade primária 50
4.2.6 Avaliação da eficácia in vitro do potencial antioxidante da
fração enriquecida em polissacarídeos 51
4.2.6.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil (DPPH) 51
4.2.6.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total 51
4.2.7 Desenvolvimento das nanoemulsões 52
4.2.7.1 Preparo das formulações 52
4.2.7.2 Determinação do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) requerido
pela fase oleosa 52
4.2.7.2.1 Análise macroscópica 53

4.2.7.2.2 Centrifugação 53
4.2.7.3 Elaboração do pseudodiagrama ternário 53
4.2.8 Avaliação da estabilidade das formulações 55
4.2.8.1 Análise macroscópica 55
4.2.8.2 Centrifugação 55
4.2.8.3 Determinação de tamanho de gotícula e polidispersividade 55
4.2.8.4 Avaliação da estabilidade preliminar das formulações e
adequação de localização do sistema tensoativo 55
4.2.8.4.1 Estudo de adequação de localização do sistema tensoativo
frente a estabilidade das formulações 56
4.2.8.4.2 Avaliação da estabilidade preliminar 56
4.2.8.5 Avaliação da estabilidade acelerada 56
4.2.9 Avaliação da eficácia hidratante 57
4.2.9.1 Casuística e aspectos éticos 57
4.2.9.2 Avaliação clínica da eficácia hidratante 57
4.2.9.2.1 Avaliação do conteúdo hídrico do estrato córneo 58
4.2.9.2.2 Avaliação da perda de água transepidermal (Transepidermal
Water Loss –TEWL) 58
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA 58
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 60
5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E
FRAÇÕES DO SUBPRODUTO DO BENEFIAMENTO DE
Agave sisalana 60
5.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTATO BRUTO E DA
FRAÇÃO ENRIQUECIDA EM POLISSACARÍDEOS DO
SUBPRODUTO DE Agave sisalana 68
5.2.1 Avaliação da citotoxicidade in vitro 68
5.2.2 Avaliação da fototoxicidade in vitro 69
5.2.3 Avaliação da compatibilidade cutânea 70
5.3 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VITRO DO POTENCIAL
ANTIOXIDANTE DA FRAÇÃO ENRIQUECIDA EM
POLISSACARÍDEOS 71
5.3.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-
difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). 72
5.3.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total 73
5.4 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES 73
5.4.1 Determinação do equilíbrio hidrófilo – lipófilo (EHL)
requerido pela fase oleosa 73
5.4.2 Pseudodiagrama ternário de fases 75
5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE 78
5.5.1 Estabilidade Preliminar 80
5.5.1.1 Estudo da adequação de localização do sistema tensoativo e
avaliação da estabilidade preliminar das formulações 80
5.5.1.1.1 Determinação do Valor de pH 83
5.5.1.1.2 Determinação do tamanho de gotícula e polidispersividade 83
5.5.1.1.3 Determinação do potencial zeta 84
5.5.2 Estabilidade Acelerada 85
5.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA HIDRATANTE 90
6 CONCLUSÕES 95
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS 96
REFERÊNCIAS 97
ANEXO A – Parecer Consubstanciado do CEP 110
APÊNDICE A – TCLE – Teste de irritabilidade primária 112
APÊNDICE B – TCLE – Eficácia clínica 115
18

1 INTRODUÇÃO

O Brasil possui grande potencial em recursos naturais para o desenvolvimento


de novas matérias-primas a partir da exploração racional de sua biodiversidade. Neste
contexto, destaca-se a cultura de Agave sisalana Perrine, popularmente conhecida
como sisal. O processo de decorticação das folhas de Agave sisalana é a principal
fonte mundial de fibra dura, utilizada amplamente na produção de fios, cordas e
artesanatos. No entanto, apenas pequena porção das folhas de Agave sisalana é
constituída de fibra sendo, o restante, subproduto, descartado nas regiões produtoras,
provocando danos ao meio ambiente (MARAN; PRYA, 2015).
A utilização de um resíduo industrial como uma nova matéria-prima, para as
mais diferentes aplicabilidades, associa grandes benefícios ambientais e
socioeconômicos, uma vez que promoverá a diminuição de impactos ambientais
danosos e o fortalecimento da renda de famílias que tem a cadeia produtiva de Agave
sisalana como principal ou única fonte de renda (MARAN; PRYA, 2015; MARTIN;
MARTINS; SILVA, 2009).
O resíduo do desfibramento de Agave sisalana apresenta um perfil promissor
como fonte de ativos para veiculação em formulações cosméticas para cuidados da
pele, por possuir em sua constituição química, metabólitos, em especial, carboidratos
(MARAN; PRIYA, 2015; ZHANG; LIU; LIN, 2014), compostos fenólicos (CHEN et al.,
2009) e saponinas (RIBEIRO; BARRETO; COELHO, 2015), com conhecidas
atividades na área cosmética, como hidratante, (FUTRAKUL;
KANLAYAVATTANAKUL; KRISDAPHONG, 2010; RIBEIRO et al., 2015)
antioxidante(STOJILJKOVI´; ARSI´; TADI´C, 2016) e surfactante, respectivamente.
No entanto, os produtos naturais não são necessariamente seguros e eficazes,
podendo ocasionar danos à saúde, tais como irritação, sensibilização e /ou
fotorreações (NOHYNEK et al., 2010), o que justifica a necessidade de avaliação da
segurança de novas matérias-primas vegetais para uso tópico, garantindo, dessa
forma, boa condição de uso (ANTIGNAC et al., 2011; BRASIL, 2012).
Metodologias in vitro alternativas ao uso de animais padronizadas
internacionalmente, como a citotoxicidade (OECD/GD 129) e a fototoxicidade (OECD
TG-432, 2004) aliadas a estudos clínicos de compatibilidade cutânea,
complementares aos testes in vitro, como os testes de contato (patch test), constituem
importantes ferramentas para determinação da ausência ou potenciais riscos
19

alergênicos ou irritativos, garantindo a segurança de novos ingredientes para


veiculação em produtos para cuidados da pele (ANTIGNAC et al., 2011; BRASIL,
2012).
Uma preocupação do uso de matérias-primas vegetais como ativos de produtos
cosméticos é a baixa permeabilidade e a elevada instabilidade desses compostos
(GANESAN; CHOI, 2016). Essas desvantagens podem ser superadas com o uso de
sistemas nanoemulsionados, pois apresentam propriedades superiores em sua
performance quando comparado com formulações convencionais. Devido ao tamanho
reduzido das gotículas, apresentam maior resistência a processos de instabilidade,
melhor permeabilidade e características estéticas e sensoriais atrativas (GIANETI et
al., 2012; IZQUIERDO et al., 2002; LU et al., 2014), sendo de grande valia para
veiculação de ingredientes vegetais para proporcionar maior eficácia.
A eficácia de produtos cosméticos nanoemulsionados pode ser estimada por
meio de técnicas não invasivas, in vivo, de biometrologia cutânea que avaliam
quantitativamente as condições biomecânicas da pele, fornecendo informações
quanto a respostas da pele após o uso de produtos cosméticos (HARRIS, 2003).
Diferentes métodos podem ser utilizados na avaliação da eficácia de produtos
hidratantes, dentre eles, o método da capacitância e a avaliação da perda de água
transepidermal (DARLENSKI et al., 2009). Esses métodos são utilizados de forma
complementar proporcionando a avaliação das condições da pele no tocante à
hidratação (DARLENSKI et al., 2009).
A utilização do resíduo industrial do desfibramento de Agave sisalana, aliado
ao emprego de sistemas nanoemulsionados e protocolos de segurança e eficácia,
trazem uma nova abordagem ambiental para a captação de ingredientes vegetais,
seguros e eficazes, para uso na área cosmética, protegendo os recursos naturais e
tornando-os fonte de novos produtos.
Diante do perfil promissor apresentado pelo subproduto do beneficiamento
de Agave sisalana como matéria-prima cosmética em conjunto com a possibilidade
de agregar valor comercial a um material de descarte industrial, a redução de danos
ocasionados ao meio ambiente e, a contribuição com o desenvolvimento sustentável,
o objetivo desse trabalho foi desenvolver uma nanoemulsão cosmética hidratante
segura e eficaz contendo o subproduto do beneficiamento de Agave sisalana Perrine.
20

2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1 Agave sisalana PERRINE


Agave sisalana Perrine (Figura 1), conhecida popularmente como sisal, é
uma herbácea originada no México e adaptada ao clima semiárido da Caatinga
(GUTIERREZ; RODRIGUEZ; RIO, 2008). Esta espécie está distribuída no Nordeste
do Brasil, onde seu cultivo ocupa extensas áreas de solos pobres, sendo considerada
uma importante alternativa produtiva para para essa região (RIBEIRO; BARRETO;
COELHO, 2015), ocupando um importante papel socioeconômico, especialmente aos
agricultores familiares, desde o manejo da lavoura, a colheita, o desfibramento, o
beneficiamento da fibra, a industrialização e/ou confecção de artesanatos (MARTIN;
MARTINS; SILVA, 2009).

Figura 1 – Agave sisalana Perrine.

Fonte: Invasive Species Compendium (2016).

Por meio do processo de desfibramento das folhas de Agave sisalana obtêm-


se uma fibra dura utilizada principalmente na produção de fios e cordas (GUTIERREZ;
RODRIGUEZ; RIO, 2008), além de serem amplamente utilizadas na agricultura e
indústria marinha devido a sua resistência e durabilidade (MARAN; PRIYA, 2015;
ZHANG; LIU; LIN, 2014). No entanto, apenas 4% a 5 % da decorticação das folhas
de A. sisalana (Figura 2) produzem essa fibra, sendo os 95%-96% restantes
constituídos de resíduos sólidos (bagaço) e líquidos (suco do sisal) normalmente
21

descartados nos locais de beneficiamento sem que haja tratamento prévio (MARAN;
PRIYA, 2015; SANTOS et al., 2009).

Figura 2 – Processo de desfibramento das folhas de Agave sisalana e descarte do


resíduo.

Fonte: Autoria Própria.

O cultivo de Agave sisalana é a principal fonte de fibra dura em todo o mundo


(RIBEIRO; BARRETO; COELHO, 2015). De acordo com a Companhia Nacional de
Abastecimento (Conab) apesar do Brasil manter-se como o maior produtor mundial
de sisal, a estimativa da produção brasileira para 2016 seria em torno de 80 mil
toneladas, sendo que 80% dessa produção, destinar-se-ia à exportação (CONAB,
2017). Tendo em vista a pequena fração de aproveitamento da planta para obtenção
da fibra do sisal, os resíduos são descartados nos solos, aterros e rios, provocando
um efeito negativo sobre o meio ambiente (MARAN; PRIYA, 2015). Dessa forma, a
utilização do resíduo do desfibramento de Agave sisalana, em diferentes aplicações,
pode contribuir sobremaneira com a redução da poluição ambiental, contribuindo com
o desenvolvimento sustentável, na medida em que um produto de descarte industrial
pode tornar-se uma nova matéria-prima comerciável e, dessa forma, proporcionar
uma nova fonte de renda para todos os envolvidos na cadeia produtiva (BOTURA et
al., 2013; CONAB, 2017).
O resíduo do desfibramento das folhas de Agave sisalana tem sido indicado
como potencial fonte de matéria-prima para indústria farmacêutica sendo descrito em
diferentes estudos sua aplicabilidade como agente imunomodulador (CHEN et al.,
2009; ZHANG; LIU; LIN, 2013), antiinflamatório e analgésico (DUNDER et al., 2010),
22

antimicrobiano (SANTOS et al., 2009) e larvicida (BOTURA et al., 2013; PIZARRO et


al., 1999). No entanto, não há relatos de seu uso na produção de produtos cosméticos
com atividade hidratante.

2.1.1 Descrição botânica


Agave sisalana é uma herbácea pertencente à família Agavaceae, amplamente
distribuída em regiões tropicais de clima seco (GUTIERREZ; RODRIGUEZ; RIO,
2008; PIRANI, 2015). A classificação desta espécie está descrita no quadro 1. Existem
dois genótipos: Agave sisalana comum e o híbrido 11648. No Brasil, no entanto, a
Agave sisalana é responsável pela maior parte do cultivo (SILVA; BELTRÃO, 1999).

Quadro 01 - Classificação botânica de Agave sisalana.


Domínio Eukaryota
Reino Plantae
Filo Spermatophyta
Subfilo Angiospermae
Classe Monocotyledonae
Ordem Liliales
Família Agavaceae
Subfamilia Agavoideae
Gênero Agave
Subgênero Euagave
Espécie sisalana
Fonte: Invasive Species Compendium (2016). Disponível em: <www.cabi.org/isc/datasheet/3855;
cirtec123>.

Agave sisalana não apresenta caule (acaulescente), apenas um eixo principal


(tronco) de estrutura lenhosa que pode atingir até 1,2 m de comprimento e 20 cm de
diâmetro, sobre o qual as folhas são inseridas (SILVA; BELTRÃO, 1999; ZHANG; LIU;
LIN, 2014). As folhas desta espécie apresentam coloração verde escura, são
caniculadas, suculentas e apresentam apenas um espinho de coloração marrom
escura em sua extremidade. Podem atingir de 1,0 m a 1,8 metros de comprimento e
10 cm a 15 cm de largura na sua parte média, apresentando-se inseridas no
23

pseudocaule na forma de espiral ascendente formando rosetas (MORS; SHARAPIN,


1974; SILVA; BELTRÃO, 1999).
Agave sisalana floresce apenas uma única vez durante o ciclo vegetativo,
quando o ápice do pseudocaule se transforma em um pedúnculo (escapo floral),
medindo de 6 m a 8 m de altura. A inflorescência é uma panícula com flores
hermafroditas e em cachos, que antes de fenecerem produzem bulbilhos que originam
novas plantas (SILVA; BELTRÃO, 1999).

2.1.2 Composição química do subproduto do beneficiamento de Agave sisalana


O resíduo do processo de desfibramento das folhas de A. sisalana é
constituído de água, parênquima, celulose, fibras de vários tamanhos, compostos
inorgânicos, e componentes relacionados com o metabolismo primário e secundário
da planta (SILVA; BELTRÃO, 1999).
Diferentes tipos de carboidratos têm sido obtidos, como as pectinas (MARAN;
PRIYA, 2015; SANTOS et al., 2013) e polissacarídeos neutros (SP1 e SP2) (ZHANG;
LIU; LIN, 2013; ZHANG; LIU; LIN, 2014), constituídos dos monossacarídeos como:
ácido galacturônico, ramnose, arabinose e galactose, além da presença do D- manitol
(BRANCO et al., 2010). Além destes, saponinas (RIBEIRO et al., 2013; RIBEIRO et
al., 2015) e compostos fenólicos (CHEN et al., 2009) também têm sido apontados
como constituintes do resíduo do desfibramento de Agave sisalana.
Esses componentes possuem atividades importantes para a indústria
cosmética, como hidratante (carboidratos), antioxidante (carboidratos, fenólicos e
saponinas) e surfactante (saponinas) (FUTRAKUL; KANLAYAVATTANAKUL;
KRISDAPHONG, 2010; RIBEIRO et al., 2013; RIBEIRO et al., 2015;; ZHANG; LIU;
LIN, 2013; ZHANG; LIU; LIN, 2014). No entanto, para uso em produtos cosméticos, a
matéria-prima vegetal deve ser considerada segura, minimizando a possibilidade de
reações em seus locais de aplicação.

2.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DE INGREDIENTES VEGETAIS PARA USO


COSMÉTICO

A crescente demanda por produtos para cuidados pessoais contendo


ingredientes naturais é impulsionada pela percepção do consumidor de que esses
produtos são saudáveis e ecológicos. No entanto, ser natural não significa
24

obrigatoriamente ser seguro. Os produtos de origem vegetal não estão isentos de


ocasionar riscos potenciais para a saúde humana (ANTIGNAC et al., 2011). A
exposição diária a produtos cosméticos pode provocar efeitos locais sobre a pele e
mucosa, tais como irritação, sensibilização ou fotorreações (NOHYNEK et al., 2010).
Dados sobre a segurança de ingredientes cosméticos podem ser obtidas por
meio de seus fornecedores, na literatura científica, agencias reguladoras e banco de
dados como o Cosmetic Ingredient Review (CIR) e o Cosmetic Ingredient Database
(COSING), no entanto, são poucas as informações disponibilizadas quanto a
segurança de ingredientes de origem vegetal (BRASIL, 2012; ANTIGNAC et al., 2011).
A avaliação da segurança de ingredientes vegetais deve ser realizada de forma
detalhada do ponto de vista químico e botânico. A caracterização completa de um
ingrediente de origem vegetal é crucial na avaliação de potenciais riscos das espécies
e seus parentes, bem como de substâncias obtidas a partir destas, podendo essas
informações fornecer evidências de potenciais riscos (ANTIGNAC et al., 2011).
Entretanto, a história de ausência de risco conhecido não implica no uso seguro para
o consumidor quando tais ingredientes são aplicados sob diferentes condições de
utilização (NOHYNEK et al., 2010).

2.2.1 Aspectos éticos e legais


A partir do conceito dos “3Rs” (Reduction, Refinement, Replacement),
estratégias para desenvolvimento de pesquisas racionais que minimizem a utilização
e o sofrimento de animais vislumbrando a substituição por modelos experimentais
alternativos têm sido desenvolvidas e fomentadas (BRASIL, 2012; NGO; MAIBACH,
2010). Na Europa foi criado o então Centro Europeu de Validação de Métodos
Alternativos (ECVAM - European Center for Validation of Alternative Methods) hoje
European Union Reference Laboratory for Alternatives to Animal testing (EURL-
ECVAM) e nos Estados Unidos o ICCVAM (Interagency Coordinating Committee for
the Validation of Alternative Methods), ambos destinados ao desenvolvimento,
validação e aceitação de novas metodologias (BRASIL, 2012; NOHYNEK et al., 2010;
NGO; MAIBACH, 2010). No Brasil, o Centro Brasileiro de Validação de Métodos
Alternativos (Brazilian Center for Validation of Alternative Methods - BraCVAM) foi
criado oficialmente em 2013 por meio de uma portaria da direção do Instituto Nacional
de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) (BRACVAM, 2016).
25

A publicação da 7th Amendment to the Cosmetics Directive 2003/15/EC,


proibindo que produtos cosméticos testados em animais sejam comercializados na
União Europeia, impulsionou o desenvolvimento e validação de novos métodos para
avaliação da segurança de produtos cosméticos alternativos ao uso de animais, tendo
em vista a importância desse mercado (FELIPPI et al., 2012; NOHYNEK et al., 2010;
NGO; MAIBACH, 2010).
No Brasil, o tema foi abordado na Lei 11.794/2008 (Lei Arouca) e
posteriormente regulamentada pelo decreto 6.899/2009. Foram estabelecidos a
criação e as normas para funcionamento do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal (CONCEA) com o objetivo, dentre outros, de formular,
monitorar e avaliar as questões éticas e a introdução de metodologias alternativas que
substituam a utilização de animais em ensino ou pesquisa científica. Também foi
definida a obrigatoriedade do Cadastro das Instituições de Uso Científico de Animais
(CIUCA), com atividades relacionadas ao uso de animais no ensino e experimentação,
tendo como condição indispensável a constituição prévia de Comissões de Ética no
Uso de Animais (CEUAs), destinadas a julgar e aprovar projetos de Instituições de
pesquisa, de acordo com as diretrizes postuladas pelo CONCEA (BRASIL, 2008;
BRASIL 2009).
Nesse contexto, por meio da portaria MCTI n° 491/2012 foi criada a Rede
Nacional de Métodos Alternativos (RENAMA) que, por meio de uma rede de
laboratórios, tem por objetivo, dentre outros: estimular a implantação de ensaios
alternativos ao uso de animais, realizar comparações interlaboratoriais; promover o
desenvolvimento, a validação e a certificação de novos métodos alternativos ao uso
de animais. O Art. 4º dessa portaria evidencia que os processos de validação dos
métodos alternativos propostos e/ou desenvolvidos pela rede ocorrerá no âmbito do
Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos (BraCVAM) (BRASIL, 2012b).
Após o episódio da invasão de um grupo de ativistas ao Instituto Royal, na
cidade de São Roque no estado de São Paulo, para resgatar cachorros da raça beagle
que eram utilizados em testes de laboratórios, foi sancionada uma lei no mesmo
estado (Lei 15.316 de 23 de janeiro de 2014) que proibiu o uso de animais no
desenvolvimento de cosméticos, produtos de higiene e perfumes e seus
componentes. Posteriormente, por meio da Lei 18.668 de 22 de dezembro de 2015, o
estado do Paraná também estabeleceu a mesma proibição (PARANÁ, 2015; SÃO
PAULO, 2014).
26

No panorama nacional, em 04 de maio de 2014, a Câmara de Deputados


aprovou o Projeto de Lei da Câmara (PLC 70/2014) que tramita conjuntamente com
outros dois projetos no Senado Federal (PLS 438/2013 e PLS 45/2014). No entanto,
mesmo depois de audiência pública, algumas questões ainda são divergentes e estão
em discussão na Comissão de Ciência, Tecnologia, Inovação, Comunicação e
Informática (AGÊNCIA SENADO, 2017).

2.2.2 Métodos alternativos para avaliação da segurança de ingredientes


cosméticos
Diferentes métodos alternativos estão publicados na forma de protocolos
disponibilizados em guias da Organisation for Economic Co-operation and
Development (OECD). No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa)
disponibilizou o Guia para Avaliação de Seguranças de Produtos Cosméticos com a
finalidade de orientar pesquisadores e empresas quanto aos métodos para avaliação
de produtos cosméticos (BRASIL, 2012).
Inicialmente, a segurança pode ser avaliada por meio de testes não clínicos, in
vitro, alternativos ao uso de animais, afim de se garantir a segurança anteriormente
aos testes clínicos (BRASIL, 2012). Dentre outras, a avaliação do potencial citotóxico
(OECD/GD 129, 2010) e potencial fototóxico (OECD TG-432, 2004) são metodologias
utilizadas para avaliação da segurança, estabelecendo a viabilidade celular após
exposição a diferentes concentrações de agentes químicos e posterior exposição à
radiação UV, respectivamente (BRASIL, 2012) .
A viabilidade celular corresponde a uma resposta à perturbação de uma via
metabólica específica ou o aumento da permeabilidade da membrana. Resposta essa
percebida com a utilização de substâncias impermeáveis, capazes de se ligar às
células viáveis, como, por exemplo o corante vital Neutral Red ( FRESHNEY, 2010).
Uma vez que a concentração de corante aderidos as células cultivadas é diretamente
proporcional ao número de células vivas, a citotoxicidade é expressa como uma
redução dependente da concentração da absorção de Neutral Red após exposição a
agentes químicos (OECD/GD 129, 2010). O teste de fototoxicidade 3T3 NRU baseia-
se numa comparação da citotoxicidade de um produto químico quando testado na
presença e na ausência de exposição a uma dose não citotóxica de luz solar simulada
(OECD TG-432, 2004).
27

Além dos testes in vitro, existem ainda as ferramentas in silico, também


consideradas alternativas ao uso de animais. O modelo in silico é fundamentado em
modelos matemáticos, obtidos a partir de dados experimentais, que geram resultados
quantitativos preditivos sobre a toxicidade de ingredientes, relacionadas a sua
estrutura química (ou propriedades). Essa abordagem é denominada como
Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) (BRASIL, 2012). Com o intuito de
facilitar a aplicação prática da abordagem QSAR em um contexto regulatório, a OECD
desenvolveu e disponibilizou uma ferramenta, denominada QSAR Toolbox, tornando-
a acessível e menos exigente em termos de custos de infraestrutura (OECD, 2017).
No entanto, diferentes ferramentas têm sido utilizadas para aplicação do QSAR como
o Derek, TIMESS, Case Ultra, TOPKAT, VEGA, dentre outros (ALVES et al., 2015a).
Estudos recentes têm utilizado os modelos in silico como alternativa na avaliação da
sensibilização e permeabilidade cutânea (ALVES et al., 2015a; ALVES et al., 2015b;
KUMAR et al., 2016). No entanto, apesar dos ensaios in silico, em um futuro próximo,
puderem se tornar uma metodologia rotineira na avaliação da segurança de produtos
cosméticos, não deve substituir, mas sim complementar a robustez da avaliação
(ADDOR, 2016).
A partir das informações de ensaios in silico e/ou in vitro e confirmação da
segurança, os testes clínicos devem ser realizados. Estudos in vivo da compatibilidade
cutânea, como os testes de contato semi-oclusivos ou oclusivos (patch test),
representam o primeiro contato de uma substância ou produto com a pele, realizados
sob condições maximizadas, com área de aplicação e quantidade aplicada
controladas, sendo uma importante ferramenta utilizada na determinação da ausência
ou potenciais riscos alergênicos ou irritativos (BRASIL, 2012; ANTIGNAC et al., 2011).
As informações pré-clínicas fornecem dados sobre o potencial risco da amostra
avaliada enquanto que os testes clínicos confirmam as evidências de segurança de
uso em seres humanos. Dessa forma, os estudos pré-clínicos não substituem os
estudos clínicos, uma vez que não há, ainda, modelos in vitro ou in sílico com inteira
correlação com a resposta obtida em pele humana in vivo (ADDOR, 2016).
A compatibilidade cutânea é definida como sendo a ausência de irritação na
pele sob circunstâncias normais de uso e razoavelmente previsíveis de uso, sendo os
principais testes de compatibilidade o de irritação dérmica primária e o de irritabilidade
acumulada/ sensibilização. Os estudos da irritação cutânea primária e acumulada tem
a finalidade de comprovar a ausência de irritações dérmicas que por ventura o
28

ingrediente cosmético possa vir a ocasionar (BRASIL, 2012). Assim, após a realização
dos ensaios in vitro e in vivo de uma matéria-prima e, diante da evidência da ausência
de riscos, essa pode ser utilizada para o desenvolvimento de formulações e/ou
submetidos a testes de eficácia específicos in vitro e/ou in vivo.

2.3 NANOEMULSÃO

Na última década, ocorreu um aumento considerável no consumo de


produtos cosméticos impulsionando a busca por formulações de alta performance
para veiculação de ativos, visando melhor aparência, sensorial agradável, segurança
e eficácia (GANESAN, CHOI, 2016).
As nanoemulsões são uma classe de emulsões que apresentam dimensões
de gotículas na escala nanométrica entre 50 nm e 500 nm (IZQUIERDO et al., 2002).
Podem apresentar-se translúcidas quando o tamanho da partícula for inferior a 200
nm ou aspecto leitoso na faixa de 200 e 500 nm (GIANETI et al., 2012). Assim como
as emulsões convencionais, podem ser classificadas do tipo óleo em água (O/A) ou
água em óleo (A/O). São sistemas termodinamicamente instáveis e cineticamente
estáveis, consequentemente não se formam espontaneamente, necessitando do uso
de energia para que o processo de emulsificação ocorra (ADJONU et al., 2014;
McCLEMENTS, 2012).
Os sistemas nanoemulsionados apresentam propriedades superiores em seu
desempenho quando comparado com produtos convencionais: maior área de
superfície, melhor permeabilidade e aspectos físico, estético e sensorial mais
atrativos. Quando comparados às microemulsões, apresentam maior resistência a
alguns processos de instabilidade como floculação, cremagem, coalescência e
sedimentação (GIANETI et al., 2012; IZQUIERDO et al., 2002; LU et al., 2014). Devido
às vantagens apresentadas, as nanoemulsões revelam-se de grande valia para
otimização da veiculação de ativos em produtos para cuidados da pele.
Podem ser obtidas por meio de técnicas de elevada energia, com aplicação
de tensão de cisalhamento (homogeneizadores de alta pressão ou geradores de
ultrassom), ou ainda, pelos métodos de baixa energia, fundamentados nas
propriedades físico-químicas do sistema (GIANETI et al., 2012; PESHKOVSKY;
PESHKOVSKY; BYSTRYAK, 2013).
29

Os métodos de alta pressão são considerados superiores, quando


comparados aos de baixa energia, por proporcionarem menores tamanhos de
gotícula, associados a melhores valores de polidispersão e maior estabilidade
(LEONG et al., 2009; PESHKOVSKY; PESHKOVSKY; BYSTRYAK, 2013; TADROS
et al., 2004). A utilização de métodos de alta energia está fundamentada na razão por
qual tal energia, gerada pelo homogeneizador, deve exceder as forças de equilíbrio
das gotículas, ou seja, o equilibrio que mantém as gotículas em um formato esférico
(McCLEMENTS; RAO, 2011). Tais forças de equilíbrio são determinadas pela pressão
de Laplace, representada na equação (1):

𝛾
∆P = (1)
2r
Onde: γ é a tensão interfacial entre as fases aquosa e oleosa e, r é o raio das gotículas.

Ao observar essa equação, pode-se perceber que a pressão de Laplace


aumenta com a diminuição do raio da gotícula ou com o aumento da tensão interfacial,
ou seja, a força aplicada para formar os sistemas nanoestruturados deve ser maior
que a pressão de Laplace.

Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de obtenção de sistemas


nanoestruturados por meio de homogeneizador ultrassônico.

Quebra de
gotículas

Fonte: Adaptado de McCLEMENTS; RAO, 2011.

No método de ultrassonicação (Figura 3), as gotículas são formadas devido


ao colapso de bolhas decorrentes da cavitação e pela liberação substancial de energia
decorrente desse processo (McCLEMENTS, 2011; PESHKOVSKY; PESHKOVSKY;
BYSTRYAK, 2013). A aplicação de ultrassonicação para obtenção de sistemas
30

nanoemulsionados vem sendo relatada em diferentes trabalhos (ABBAS et al., 2014;


LU et al., 2014; SHAMSARA et al., 2015; SILVA et al., 2016).
As emulsões convencionais estão susceptíveis a processos de instabilidade
ocasionados pela separação gravitacional (cremagem e sedimentação) ou, ainda,
devido à agregação de gotículas (floculação, coalescência ou pontes de Ostwald)
(Figura 4). A coalescência ocorre devido à baixa tensão interfacial entre as fases
enquanto que a ponte de Ostwald ocorre devido à elevada solubilidade do óleo em
água (McCLEMENTS, 2012).

Figura 4 – Processos de instabilidade que podem ocorrer em emulsões.

Sedimentação Cremagem Floculação Coalescência Separação de fases


ou pontes de
Ostwald

Fonte: Adaptado de McCLEMENTS; RAO, 2011.

Devido ao menor tamanho de gotículas, as nanoemulsões possuem maior


resistência aos processos de instabilidade (YUKUYAMA et al., 2016). Menores
tamanhos de gotícula favorecem a estabilidade das nanoemulsões na medida em que
promovem uma redução na força gravitacional o que torna o movimento Browniano
capaz de superá-la (KABRI, 2011). No entanto, o fenômeno de ponte de Ostwald
(maturação de Ostwald), aparece como principal mecanismo de instabilidade desses
sistemas (McCLEMENTS, 2012).
A ponte de Ostwald, provoca o aumento no tamanho da gotícula pela
absorção de menores gotículas formando gotículas de maior tamanho, e esse
fenômeno ocorre devido a diferenças na pressão de Laplace, bem como pela
diferença na solubilidade das gotículas. Dessa forma, as gotículas aumentam de
tamanho, afetando a estabilidade do sistema, podendo resultar na separação de fases
(GIANETE et al., 2012; McCLEMENTS; RAO, 2011; YUKUYAMA et al., 2016).
31

Dentre as diferentes técnicas utilizadas para caracterização de sistemas


nanoestruturados podemos citar a avaliação macroscópica de sua aparência, a
determinação dos valores de pH, condutividade elétrica, tamanho de gotícula e carga
da superfície da gotícula (KLANG et al., 2012; RIBEIRO et al., 2015).
A caracterização e a estabilidade das nanoemulsões estão relacionadas ao
tamanho e distribuição das gotículas na formulação. Por meio da técnica de
espalhamento de luz (Dynamic Light Scattering – DLS) podem ser observados o
tamanho de gotícula e o índice de polidispesividade (PDI). A distribuição do tamanho
revela a homogeneidade do sistema, onde os valores de polidispersividade são
expressos em uma escala de 0,0 a 1,0, sendo os valores inferiores a 0,2 indicativos
de distribuição homogênea e maior estabilidade contra fenômenos de instabilidade
como as pontes de Ostwald (KLANG et al., 2012; TANG et al., 2011).
A determinação do potencial zeta, mensuração da carga de superfície, indica
a força de repulsão entre as gotículas adjacentes de mesma carga, demonstrando o
importante papel da camada superficial das gotículas no processo de estabilização.
Valores de potencial zeta maiores que ǀ30ǀ mV, indicam a resistência à agregação das
partículas, consequentemente demonstram maior estabilidade ao sistema (BALI; ALI;
ALI, 2010).
Devido às vantagens, quanto a processos de instabilidade e permeabilidade
apresentadas pelas nanoemulsões, esses sistemas têm sido utilizados para
veiculação de ingredientes de origem vegetal, proporcionando melhor performance
desses compostos com maior eficácia, aspecto atrativo e sensorial agradável
(GANESAN; CHOI, 2016; GIANETI, 2012; LEONG, 2009; PESHKOVSKY;
PESHKOVSKY; BYSTRYAK, 2013).

2.4 BIOLOGIA DA PELE E ENVELHECIMENTO CUTÂNEO

A pele, sendo a interface entre o corpo e o ambiente externo, exerce diferentes


funções de extrema importância para o ser humano. Sua principal função é evitar a
perda excessiva de água e de outros componentes do corpo para o ambiente e
proteger o organismo contra agentes agressores externos. Além disso, apresenta
funções imunológicas, atua como orgão sensorial, auxilia na regulação da temperatura
corporal, participa da síntese de vitamina D e exerce importante papel nas relações e
interações sociais (BONTÉ, 2011; WICKETT; VISSCHER; OHIO, 2015).
32

A pele, maior órgão do corpo humano, é constituída por duas camadas


principais: a epiderme e a derme, existindo ainda um tecido subcutâneo adiposo, a
hipoderme (ARDA; GÖKSÜGÜR; TÜZÜN, 2014). A epiderme é a camada mais
externa e compreende a principal barreira de defesa contra agentes nocivos. É
dividida em quatro camadas distintas: o estrato córneo (EC), estrato granuloso (EG),
estrato espinhoso (EsE) e a camada mais interna, o estrato basal (EsB) (BARONI et
al., 2012; SEMEDEN et al., 2014), existindo, ainda, apenas na pele espessa, o estrato
lúcido (EL), considerado uma subdivisão do estrato córneo, que exerce uma função
de proteção mecânica (ARDA; GÖKSÜGÜR; TÜZÜN, 2014; HARRIS, 2003). Trata-se
de um tecido homeostático e auto renovável, composto majoritariamente por
queratinócitos, apresentando ainda, em menor quantidade, melanócitos, presentes na
camada basal da pele com a função de proteger a pele da radiação UV e dar cor ao
tecido cutâneo; células de Merkel que participam da percepção sensorial e, células de
Langerhans que possuem papel fundamental na resposta imunológica da pele (ARDA;
GÖKSÜGÜR; TÜZÜN, 2014; BARONI et al., 2012; WICKETT; VISSCHER; OHIO,
2015).
O estrato basal possui células com intensa atividade mitótica, sendo o principal
responsável, juntamente com a camada espinhosa, pela contínua renovação da
epiderme. Apresenta em sua estrutura queratinócitos, que se diferenciam e
movimentam-se até o EC (superfície da pele), em um processo chamado de
renovação celular (SEMEDEN et al., 2014; WICKETT; VISSCHER; OHIO, 2015).
O estrato espinhoso é a camada mais espessa da epiderme. A maioria das
células possuem formas poliédricas que tornam-se achatadas ao se aproximarem da
superfície. Nessa fase inicia-se o processo de queratinização, no qual pequenos
tonofilamentos de queratina (desmossomos) atravessam o citoplasma das células,
unindo-as. Além disso, tem início a formação dos corpos lamelares, posteriormente
responsáveis pela formação do espaço intercelular e manto hidrolipídico (ARDA;
GÖKSÜGÜR; TÜZÜN, 2014; HARRIS, 2003; WICKETT; VISSCHER; OHIO, 2015).
Embora apresente como uma camada delgada, o EG é um componente vital
da epiderme. É nessa camada que as transformações fundamentais que formam a
barreira EC ocorrem (WICKETT; VISSCHER; OHIO, 2015). Os queratinócitos no EG
apresentam elevado número de vacúolos denominados corpos lamelares em que os
lípideos estão armazenados, tais como glicosilceramidas, esfingomielina e
fosfolipídeos, precursores dos principais lipídeos presentes no EC, como as
33

ceramidas, ácidos graxos livres e colesterol (SMEDEN et al., 2014). Nessa fase, o
núcleo é digerido, o citoplasma desaparece, os lípidos são libertados para o espaço
intercelular, os filamentos intermediários de queratina agregam-se para formar
microfibrilas, e a membrana celular é substituída por um envelope celular de proteína
reticulada com lípidos ligados de modo covalente à sua superfície (WICKETT;
VISSCHER; OHIO, 2015).
O EC é constituído de corneócitos ricos em queratina (queratinócitos
anucleados), originados do processo de diferenciação celular, inseridos em domínios
lipídicos complexos e organizados (BONTÉ, 2011). No interior celular, estão presentes
água e queratina microfibrilar, rodeados por um envelope que consiste de uma
camada densamente reticulada de proteínas, tais como filagrina, loricrina e involucrina
(SMEDEN et al., 2014). Essa camada fornece suporte estrutural e proteção mecânica,
atua como uma barreira antimicrobiana e antioxidante, e participa na regulação da
permeabilidade da pele atuando também como reservatório de conteúdo aquoso
necessário para manutenção dos processos fisiológicos e enzimáticos (RAMOS-e-
SILVA; JACQUES, 2012). A presença de água na pele desencadeia importantes
funções, como a degradação da filagrina (proteína de agregação de filamentos) e
microfibrilas de queratina em peptídeos e aminoácidos, constituintes do fator de
hidratação natural da pele (Natural Moisturizing Factor - NMF). A degradação
proteolítica da filagrina em substâncias do NMF fornece uma forte energia osmótica,
que atrai moléculas de água, essenciais para retenção desse componente nos
corneócitos (BONTÉ, 2011; PONS-GUIRAUD, 2007). Além disso, o conteúdo aquoso
juntamente com o conteúdo lípidico formam um filme hidrolipídico capaz de promover
uma barreira efetiva contra a perda de água proveniente das camadas mais profundas
da pele, denominado de perda de água transepidermal (Transepidermal Water Loss –
TEWL) (BONTÉ, 2011; PONS-GUIRAUD, 2007). Diminuição do conteúdo hídrico,
bem como alterações nos níveis lipídicos da pele, contribuem para o surgimento de
diferentes desordens na função de barreira, como por exemplo, a xerose (pele seca
ou ainda dermatite atópica). A pele seca está diretamente associada com a função de
barreira debilitada, causada pela proliferação e diferenciação epidermica
desequilibada, a síntese lipidica defeituosa e mutações no gene da filagrina e
consequentemente de fatores de hidratação natural inadequados (LU et al., 2014).
Na pele xerótica é observado um aspecto áspero e escamoso, perda da
elasticidade e flexibilidade ocasionando rigidez e fragilidade (BARCO, 2008; BONTÉ,
34

2011; WHITE-CHU; REDDY, 2011). A pele seca pode se manifestar por alterações
endógenas ou exógenas, como os fatores hormonais, genéticos, exposição excessiva
á radiação solar e uso contínuo de produtos de higiene pessoal (PONS-GUIRAUD,
2007).
A utilização de produtos hidratantes proporciona melhor função de barreira
na medida em que fornecem topicamente ingredientes adequados para manutenção
da fisiologia da pele, restaurando o estrato córneo e, consequentemente, fortalecendo
a barreira cutânea (LONDÉN, 2014). Os cosméticos hidratantes podem atuar por
diferentes mecanismos por apresentarem propriedades oclusivas, umectantes, ativos
que promovem a hidratação ativa ou ainda estimular a síntese de aquaporinas
(BONTÉ, 2011; RIBEIRO, 2010).
A ação oclusiva, geralmente desencadeada por substâncias graxas,
promovem a formação de um filme sobre a pele capaz de reduzir a perda de água
transepidermal e, dessa forma, aumentar o conteúdo hídrico presente no EC. Os
umectantes são ingredientes capazes de promover a retenção de água por ligação
química com moléculas de água provenientes da pele ou ainda do ambiente para a
pele, como por exemplo, a ureia, glicerina e os açúcares. Na hidratação ativa, o
ingrediente é capaz de permear a camada córnea e promover a retenção de moléculas
em toda sua extensão (BONTÉ, 2011; RIBEIRO, 2010; WAN et al., 2014). Hidratantes
podem, ainda, estimular a síntese de proteínas transmembranares denominadas de
aquaporinas (AQP) capazes de promover o fluxo de água e outros componentes,
como o glicerol e a ureia, das camadas mais inferiores para a superfície da pele
(BONTÉ, 2011).
Alterações nos níveis de água, diminuição nos níveis de aminoácidos e no
fator de hidratação natural, decaimento na síntese de lipídeos e aquaporinas entre
outros fatores estão associados à pele de idosos, favorecendo a perda de água
transepidermal e tornando-a seca e aspera. Isso explica por que a utilização de
produtos hidratantes é essencial para a manutenção das características fisiológicas
da pele e para prevenir o envelhecimento (BONTÉ, 2011; SCOTTI; VELASCO, 2003).
O envelhecimento cutâneo é um processo complexo que envolve alterações
clínicas resultantes de uma combinação de fatores endógenos e exógenos. Diferentes
teorias têm sido propostas para explicar os mecanismos intrínseco (fisiológico) e
extrínseco do envelhecimento, incluindo a teoria da senescência celular, redução da
capacidade de reparo celular e perda de telômeros, mutações pontuais do ácido
35

desoxirribonucleico (DNA) e a teoria dos radicais livres. (ZOUBOULIS;


MAKRANTONAKI, 2011).
O envelhecimento extrínseco é associado, principalmente, ao termo
fotoenvelhecimento, devido aos danos acumulativos, sobrepostos às alterações
intrínsecas, ocasionadas pela radiação solar e a produção de radicais livres (RIBEIRO
2010; SCOTTI; VELASCO, 2003).
Os radicais livres são átomos, moléculas ou íons com elétrons
desemparelhados altamente instáveis e reativos derivados principalmente do
oxigênio, nitrogênio e enxofre (CAROCHO; FERREIRA, 2013). Segundo a teoria dos
radicais livres, o estresse oxidativo é uma das maiores contribuições para o
envelhecimento da pele. O excesso da produção de radicais livres aliado à redução
da capacidade natural antioxidante gera um estresse oxidativo. O excesso de
espécimes reativas, principalmente espécies de oxigênio, reagem com diferentes
células do organismo humano, com proteínas, DNA e ácido ribonucleico (RNA),
açúcares e lipídeos, resultando em alterações moleculares e lesões celulares
(CAROCHO; FERREIRA, 2013; ZOUBOULIS; MAKRANTONAKI, 2011).
Neste contexto, produtos cosméticos, eficazes, com a finalidade de aumentar
ou manter o conteúdo hídrico da pele e prevenir os danos cutâneos ocasionados pelos
radicais livres, podem contribuir para a manutenção da hidratação e da função barreira
da pele mantendo-a saudável e ainda com um aspecto estético atrativo, além de
prevenir o envelhecimento cutâneo

2.5 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DE INGREDIENTES E FORMULAÇÕES


COSMÉTICAS

Diferentes compostos e extratos de plantas têm demonstrado a capacidade de


reduzir radicais livres. Dentre os grupos de compostos bioativos de origem vegetal
atualmente estudados, os polissacarídeos e os compostos fenólicos merecem
destaque (DONG et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2016; STOJILJKOVI´; ARSI´; TADI´C,
2016; ZHANG, X; LIU, L.; LIN, C, 2014; ˇZUGI´C et al., 2014).
Além disso, proteínas e polisacarídeos oriundos de plantas são comumente
utilizados em produtos cosméticos devido a seus benefícios como ativos cosméticos
hidratantes (BONTÉ, 2011; POOTONGKAM; NEDOROST, 2013). As proteínas
proporcionam benefícios à pele tais como a hidratação, elasticidade, firmeza e
36

suavidade (SECCHI, 2008). Podem fornecer aminoácidos, componentes NMF


estimulando a recosntituição do estrato córneo e manutenção do conteúdo aquoso da
pele (BONTÉ, 2011; DAITHANKAR et al., 2005) ou, ainda, assim como os
polissacarídeos, estabelecer ligações com moléculas de água da superfície
aumentando o conteudo de água no estrato corneo (BONTÉ, 2011; RIBEIRO 2010;
SECCHI, 2008).
Atualmente diversas metodologias in silico, in vitro e in vivo para avaliação da
eficácia de ingredientes e produtos cosméticos estão disponíveis. Para determinação
da capacidade antioxidante de compostos bioativos, metodologias in vitro têm sido
utilizadas (SPAGNOL et al., 2017; STOJILJKOVI´; ARSI´; TADI´C, 2016), enquanto
que, para avaliação da eficácia hidratante, métodos biofísicos in vivo de biometrologia
cutânea têm ganhado destaque proporcionando uma avaliação robusta das condições
da pele e garantindo a eficácia de novos produtos cosméticos (DRENO et al., 2014).

2.5.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro


Antioxidantes são substâncias que atuam regulando a produção e a
eliminação dos radicais livres (KHLEBNIKOV et al., 2007). Essas moléculas
geralmente apresentam um grupo doador de elétrons (normalmente um grupamento
hidroxila) capaz de minimizar os danos provocados pelo estresse oxidativo
(CAROCHO; FERREIRA, 2013; URBANIAK; SZELAG; MOLSKI, 2013). A propriedade
antioxidante decorrida da ação direta com radicais livres é reconhecida por três
mecanismos: transferência de átomo de hidrogênio, transferência de eletron e
quelação de metais de transição (LEOPOLDINO et al., 2011).
A toxicidade observada em antioxidantes de origem sintética, como o
Butilhidroxianisol (BHA) e Butilhidroxitolueno (BHT), provocou o interesse em fontes
de antioxidantes seguras para uso tópico. Assim, compostos antioxiantes bioativos
surgem como alternativa na prevenção do envelhecimento cutâneo ou outras
desordens ocasionadas por radicais livres (CAROCHO; FERREIRA, 2013; LIN et al.,
2015; STOJILJKOVI´C; ARSI´C; TADI´C, 2016).
A avaliação da capacidade sequestrante de íons superóxido (O -2), sequestro
de radicais hidroxil (OH-), capacidade quelante do íon ferro (Fe 2+), capacidade
quelante de íons de cobre (Cu2+), avaliação do poder redutor, capacidade
sequestrante de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH) e a capacidade
37

antioxidante total (CAT) são exemplos de metodologias in vitro utilizadas para


avaliação da atividade antioxidante de ingredientes vegetais.
O ensaio do sequestro de radicais DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) é o método
mais amplamente utilizado, devido, de uma maneira geral, ser simples, eficiente e de
baixo custo (CARMONA-JIMENEZ et al., 2014). No ensaio do sequestro do radical
livre DPPH, a atividade antioxidante é avaliada por meio do fornecimento de radicais
livres em uma solução contendo compostos antioxidantes capazes de promover a
redução desses radicais (OLIVEIRA et al., 2016). A redução dos radicais DPPH por
substâncias antioxidantes altera a coloração de roxo para amarelo, levando à
diminuição dos valores de absorbância, avaliadas espectrofotometricamente (Figura
5). Após o equilíbrio da reação, a quantidade de antioxidante utilizado para reduzir
50% da atividade do radical é calculada, sendo essa denominada concentração
efetiva (CE50). Quanto maior o consumo de DPPH por uma amostra, menor será a sua
EC50 e maior o seu potencial antioxidante (CARMONA-JIMENEZ et al., 2014).

Figura 5 - Representação esquemática da reação de redução da molécula de DPPH


por moléculas antioxidantes.

DPPH (oxidado) DPPH (reduzido)


coloração roxa coloração

Fonte: Adaptado de TEIXEIRA et al., 2013.

ZHA e colaboradores (2009) demostraram a capacidade sequestrante de


radicais DPPH de polissacarídeos extraídos de farelo de arroz. Zhang, Liu e Lin (2014)
demonstraram a capacidade de polissacarídeos isolados do resíduo de Agave
sisalana em reduzir os radicais DPPH. No entanto, os grupamentos hidroxila
presentes na estrutura de polissacarídeos podem atuar como doadores ou receptores
38

de hidrogênio ou, ainda, atuarem como sítio ativos para sequestro de radicais através
da doação de átomos de hidrogênio, caracterizando esses compostos como
moléculas multipotentes (ALIMI et al., 2011).
A capacidade antioxidante total (CAT) de compostos pode ser avaliada por
meio do método molibedênio. Nesse ensaio verifica-se a capacidade dos compostos
antioxidantes doarem elétrons para o molibdato (VI) reduzindo-o a molibdato (V) e
subsequente formação de um complexo verde de fosfato Mo (V) em um pH ácido.
Este complexo adquire uma coloração esverdeada que pode ser mensurada por meio
de espectrofotômetro em um comprimento de onda de 695 nm (PRIETO; PINEDA;
AGUIAR, 1999). A capacidade antioxidante total de xilana oriunda do sabugo de milho
foi apresentada por Melo – Silveira e colaboradores (2012). Utilizando o método
molibedênio, Kocak e colaboradores (2016) demonstraram a capacidade de doar
elétrons do extrato de Salvia cadmica.
Em adição, a avaliação da capacidade antioxidante de compostos pode ser
avaliada em sistemas biológicos pela medida da sobrevivência de células de
leveduras de Saccharomyces cerevisiae expostas a agentes promotores do estresse
oxidativo como por exemplo, a apomorfina, o paraquat e o glutamato monossódico
(GUARIENTI; BERTOLINI; COSTA, 2010). A resposta de S. cerevisiae contra o
estresse oxidativo está bem caracterizada e envolve mecanismos pós-transcricionais
e transcricionais, resultando eventualmente na ativação de estratégias de resposta
enzimática e não-enzimática, podendo dessa forma ser utilizada como uma
ferramenta de previsão da capacidade antioxidante (ODRIOZOLA-SERRANO et al.,
2016). O método não invasivo, ex vivo, de tape stripping é utilizado para determinar a
eficácia antioxidante de formulações aplicadas topicamente in vivo por meio do
percentual de inibição da peroxidação lipídica na camada mais externa da pele
(ALONSO et al., 2009). Essa técnica se caracteriza pela remoção sequencial de fitas
adesivas em uma mesma área, levando a uma quase completa remoção da camada
superficial da pele (DARLESKI et al., 2009). Alonso e colaboradores (2009) avaliaram
a atividade antioxidante de formulações tópicas contendo vitamina A,C, E e o extrato
de peixe, após exposição à radiação ultravioleta. Os resultados demonstraram que as
formulações reduziram os níveis de peroxidação lipídica da pele, indicando a eficácia
na proteção contra danos ocasionados por radicais livres.
39

Metodologias in vivo para avaliação da eficácia de produtos cosméticos têm


sido empregadas de diferentes formas, fornecendo, de uma maneira geral,
informações quanto a respostas ocasionadas pela utilização dessas.

2.5.2 Biometrologia cutânia e eficácia clínica hidratante de produtos cosméticos


Metodologias in vivo de biometrologia cutânea permitem avaliar
quantitativamente os efeitos de produtos cosméticos sobre a pele em condições reais
de uso e de forma não invasiva (HARRIS, 2003). Diferentes metodologias têm
facilitado a interpretação dos resultados obtidos com a aplicação de produtos para
cuidados da pele, dentre elas a determinação do conteúdo aquoso do estrato córneo
e a perda transepidermal de água. Tais métodos têm sido empregados de forma
complementar, garantindo de maneira conclusiva a avaliação das condições da pele
no tocante à hidratação pois, devido as suas funções e complexidade estrutural, um
único parâmetro não é suficiente (DARLENSKI et al., 2009).
A medida da hidratação da pele tem despertado interesse devido a influência
do estrato córneo em diferentes características da pele, como a função de barreira, a
penetração de medicamentos e propriedades mecânicas (MELO; MAIA CAMPOS,
2016a).
As propriedades elétricas da pele estão diretamente relacionadas ao teor de
água presente no estrato córneo. Alterações na hidratação do estrato córneo resultam
em alterações das propriedades elétricas, demonstrado por um aumento da
capacitância, condutância ou impedância (BYRNE, 2010). O aumento nos valores da
capacitância e impedância indicam a elevação do conteúdo hídrico do estrato córneo
enquanto que a impedância reflete o conteúdo aquoso viável na epiderme (MELO;
MAIA CAMPOS, 2016a). No entanto, o método da capacitância é o método mais
comumente utilizado na avaliação do conteúdo aquoso do estrato córneo devido a sua
alta reprodutividade, facilidade de manuseio e curto tempo de medição (BYRNE,
2010).
O Corneometer® é um dos equipamentos utilizados para avaliação da
capacitância da pele de acordo com a constante dielétrica da água. As alterações
promovidas pela hidratação do estrato córneo são convertidas numericamente em
unidades arbitrárias, equivalentes ao conteúdo aquoso da pele avaliada (DARLENSKI
et al., 2009; BYRNE, 2010). A sonda do corneometer é constituída por placas
metálicas posicionadas próximas a superfície da pele e separadas por uma lâmina de
40

vidro, que, quando aplicada sobre a pele, forma um campo elétrico que, permiti a
determinação do conteúdo aquoso (BYRNE, 2010).
A avaliação da perda de água transepidermal é de grande utilidade no
monitoramento da função barreira da pele, onde baixos valores de TEWL refletem
uma condição de função de barreira intacta e maiores valores indicam uma função de
barreira alterada (DARLENSKI et al., 2009; MAIA CAMPOS et al., 2012).
O Tewameter® é um evaporímetro de câmera aberta, fundamentado na
medição de um gradiente de pressão de vapor. A sonda consiste em um cilindro oco
posicionado perpendicularmente à superfície da pele. A umidade relativa e
temperatura são medidas por dois sensores localizados em duas distâncias da pele.
A diferença de pressão de vapor entre os pontos é diretamente relacionada com a
perda de água por evaporação da pele. Os dados são processados e expressados
numericamente em g/m²/h (FLUHR; FEINGOLD; ELIAS, 2006).
A avaliação do conteúdo aquoso do extrato córneo juntamente com a avaliação
da função barreira da pele são comumente utilizadas na comprovação da eficácia de
produtos cosméticos hidratantes. Diferentes mecanismos de atuação de formulações
cosméticas podem ser propostos a partir da avaliação desses parâmetros como, por
exemplo, a umectação, promovendo a retenção de água na extensão da pele e a
oclusão, formando um filme capaz de reduzir a perda de água da pele, sendo o
mecanismo de ação dos ativos influenciado pelo tipo de veículo utilizado (DAL’BELO;
GASPAR; MAIA CAMPOS, 2006; DAMASCENO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2015).
De uma maneira geral, existe uma proporcionalidade entre a TEWL e a
hidratação do extrato córneo. Uma elevação inicial da TEWL é observada após
aplicação de agentes hidratantes na superfície da pele, o que não ocorre devido ao
aumento da hidratação do estrato córneo, mas devido à evaporação da água do
produto cosmético em si. Além disso, a hidratação da pele aumenta a espessura do
estrato córneo em nível molecular. Consequentemente, podem indicar prejuízos para
a evaporação da água na área (MELO; MAIA CAMPOS, 2016b).
Além disso, novas ferramentas não invasivas de microscopia e técnicas de
imagem como por exemplo, a microscopia confocal e a ressonância magnética, vem
sendo utilizadas no monitoramento de alterações biomoleculares da pele em tempo
real e assim determinando a eficácia de produtos cosméticos quanto à hidratação da
pele e antienvelhecimento (DRENO et al., 2014).
41

Diante do exposto, a avaliação da segurança e eficácia antioxidante do resíduo


industrial de Agave sisalana combinado ao desenvolvimento de um produto
nanotecnológico com eficácia hidratante trará uma nova perspectiva para utilização
de resíduos industriais. Esse trabalho contribuirá com a obtenção de uma nova
matéria-prima comprometida com as questões ambientais e socioeconômicas aliada
a aplicação de protocolos científicos e tecnológicos utilizando metodologias capazes
de mensurar os benefícios obtidos com a aplicação desse material de descarte.
42

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Obter e caracterizar uma fração enriquecida em polissacarídeos a partir do


resíduo industrial de Agave sisalana Perrine (Sisal). Avaliar a segurança (in vitro e in
vivo) e a eficácia antioxidante in vitro da fração obtida para verificar a sua viabilidade
como matéria-prima cosmética. E então, desenvolver uma nanoemulsão e avaliar a
eficácia clínica hidratante.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Obter uma fração enriquecida em polissacarídeos a partir do subproduto do


beneficiamento de Agave sisalana Perrine;

- Caracterizar químicamente o subproduto e frações obtidas do resíduo de


Agave sisalana Perrine;

- Avaliar a segurança in vitro do extrato bruto e da fração enriquecida em


polissacarídeos obtidos a partir do subproduto quanto à citotoxicidade e
fototoxicidade;

- Avaliar in vivo a compatibilidade cutânea;

- Avaliar o potencial antioxidante in vitro da fração enriquecida em


polissacarídeos;

- Desenvolver e caracterizar nanoemulsões, contendo a fração enriquecida em


polissacarídeos de Agave sisalana;

- Avaliar a estabilidade preliminar e acelerada das formulações;

- Avaliar a eficácia clínica hidratante das formulações.


43

4 MATERIAL, MÉTODOS E CASUÍSTICA

4.1 MATERIAL
Para o preparo das formulações foram utilizados:Caprylic/Capric
Triglyceride (Crodamol™ GTCC), Polysorbate 80 (Tween® 80), Sorbitan Monooleate
(Span® 80), Ethylhexyl Palmitate (Crodamol™ OP) doados pela Croda do Brasil Ltda.
(Campinas, Brasil); Isostearyl Neopentanoate (Eschercemol™ 185) cedido pela
Lubrizol do Brasil Aditivos Ldta. (São Paulo, Brasil); Phenoxyethanol, Caprylyl Glycol
(Optiphen™) fornecido pela Ashland Inc. (São Paulo, Brasil), Disodium EDTA (DEG
importação de produtos químicos, São Paulo, Brasil), Butylhydroxytoluene – BHT
(Galena química e farmacêutica Ltda., Campinas, Brasil) e distilled water.
A nomenclatura dos ingredientes foi apresentada de acordo com a International
Nomenclature of Cosmetic Ingredient – INCI (COSING, 2014) seguido pelo nome
comercial de acordo com o fornecedor.
Todas as matérias-primas utilizadas no desenvolvimento das formulações,
citadas acima, são de grau cosmético e constantes nas listas da Cosmetic Ingredient
Review – CIR (CIR, 2014) e na European Commision Health and Consumers –
Cosmetics Ingredients & Substances – Cosing (COSING, 2014). Quando os
ingredientes constam nessas bases de dados, indicam que os mesmos são seguros
para fins cosméticos.
Para a obtenção do extrato bruto e as frações foi utilizado o álcool etílico
(Labsynth produtos para laboratórios Ltda., Diadema, Brasil).
Para as metodologias relacionadas a caracterização preliminar qualitativa do
extrato bruto de Agave sisalana e suas frações foram utilizados os seguintes produtos
e reagentes: ácido trifluoroacético (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), piridina
(Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), 1-propanol (Vetec química fina Ltda., Duque
de Caxias, Brasil), água destilada, acetato de etila (Labsynth produtos para
laboratórios Ltda., Diadema, Brasil), solução metanólica de ácido sulfúrico (J. T.
Baker, Hecho, México) a 10% (v/v),solução de timol/sulfúrico (0,5 g timol, 95 mL etanol
e 5 mL ácido sulfúrico 97%), (Merck, Darmstadt, Alemanha), solução etanólica de
ninhidrina 0,2% (p/v) (Vetec química fina Ltda., Duque de Caxias, Brasil). Placas de
sílica gel 60 (0,20 mm) em suporte de alumínio F254 (Machery-Nagel, Duren,
Alemanha) foram utilizadas para as análises em CCD. Os monossacarídeos ácido
galactucurônico, arabinose, galactose, glicose, manose, ramnose e xilose foram
44

utilizados como padrões (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), solução de nitrato
de prata 3,3% (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil).
Para as metodologias quantitativas relativas à caracterização química do
extrato bruto e suas frações foram utilizados: ácido gálico (CAQ Casa da química Ind.
e Com.,São Paulo, Brasil), D-galactose (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil),
albumina sérica bovina (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil) ácido sulfúrico P.A.
(Labsynth produtos para laboratórios Ltda., São Paulo, Brasil), reagente de Bradford
(Bio-Rad, São Paulo, Brasil), reagente de Folin-Ciocalteau (Merck, Darmstadt,
Alemanha), solução de fenol 80% (Quimiobrás indústrias químicas S.A., Rio de
Janeiro, Brasil).
Para avaliação da segurança foram utilizados: meio Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM) (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), penicilina, estreptomicina,
anfotericina, glutamina e soro fetal bovino (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), solução de
tripsina a 0,05%, EDTA (Vitrocell®, São Paulo, Brasil), tampão fosfato a pH 7,4 e
corante Neutral Red (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil). Para o teste de
segurança in vivo, foram utilizados apósitos (patch test) de 1,0 cm2 (Allergo Chamber,
IPI ASAC Brasil, São Paulo, Brasil)
Na avaliação da eficácia do potencial antioxidante foram utilizados 2,2-difenil-
1-picrilhidrazil (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), álcool etílico (Labsynth
produtos para laboratórios Ltda., Diadema, Brasil), ButylHidroxiTolueno - BHT (Sigma-
Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil), fosfato de sódio (Alphatec, Rio de Janeiro, Brasil),
molibdato de amônia (Vetec química fina Ltda., Duque de Caxias, Brasil) e ácido
ascórbico (Sigma-Aldrich Brasil, São Paulo, Brasil).
Para o teste de eficácia clínica foi utilizado como controle positivo o produto
bruma perfumada Vitória-Régia flor do dia, Lote: K602353, validade: 07/2017
(L’occitane - K&G Indústria e Comércio Ltda, São Paulo, Brasil) e as formulações
desenvolvidas contendo ou não fração enriquecida em polissacarídeos.
45

4.2 MÉTODOS

4.2.1 Obtenção do subproduto de Agave sisalana (sisal)


A matéria-prima foi obtida por meio de parceria com a empresa Sisaltec -
Indústria de Sisal. O subproduto foi obtido diretamente do processo de desfibramento
das folhas de Agave sisalana na fazenda de cultivo de sisal localizada na cidade de
Pedra Grande, Rio Grande do Norte, Brasil (5°07'56.3"S 35°54'31.7"W). Uma exsicata
foi depositada no Herbário da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sob
número de registro UFRN- 20544. O subproduto se refere ao material vegetal obtido
após o processo de desfibramento.

4.2.2 Obtenção do extrato bruto e da fração enriquecida em polissacarídeos


O subproduto da indústria do sisal foi prensado e as porções líquida e sólida
foram separadas. A fração rica em polissacarídeos foi obtida a partir da porção líquida
do subproduto (extrato bruto – EB), utilizando metodologia adaptada de Santos e
colaboradores (2013). O extrato bruto foi submetido à extração com etanol 95 °GL, na
proporção extrato bruto/ solvente de 1:3 (v/v), por 24 h a 4 °C, em seguida filtrado e
rotaevaporado (Büchi, mod. R3, Flawil, Suíça), em temperatura não superior a 45 °C
e, posteriormente, liofilizado (Christ Alpha 1-2 LD, Osterode am Harz, Alemanha) por
48 h.

Figura 6 - Esquema de obtenção da fração enriquecida em polissacarídeos.

Subproduto de Agave sisalana

1 Prensagem

Porção Sólida Porção líquida/Extrato bruto(EB)

2 Extração com etanol 95°GL


1:3 (v/v)
3 Filtração

Precipitado Extrato hidroetanólico

Rotaevaporação Rotaevaporação
Liofilização Liofilização

Fração enriquecida em
Fração do Precipitado (FrP)
polissacarídeos (FrE)
46

4.2.3 Caracterização preliminar qualitativa do extrato bruto de Agave sisalana e


suas frações quanto à presença de açúcares
Uma investigação preliminar qualitativa foi realizada para verificar a presença
de açúcares no extrato bruto de Agave sisalana (EB) e suas frações (FrP e FrE) por
meio de cromatografia em camada delgada (CCD) e determinação da composição
monossacarídica.

4.2.3.1 Análise cromatográfica por cromatografia em camada delgada (CCD)


Para avaliação do perfil cromatográfico as amostras foram solubilizadas em
água e aplicadas em placas de sílica gel em bandas de 0,5 cm de largura. Os
cromatogramas foram eluídos de forma ascendente em cuba pré-saturada com um
sistema eluente composto por 1-propanol; água; acetato de etila nas proporções de
4: 0,5: 0,5 (v/v/v), respectivamente (SKALSKA-KAMIŃSKA et al., 2009). Após
secagem, a revelação das placas cromatográficas foi realizada mediante aspersão de
diferentes sistemas reveladores: (1) solução metanólica de ácido sulfúrico a 10% (v/v);
(2) solução de timol/sulfúrico; (3) solução etanólica de ninhidrina 0,2% (p/v).
Experimentos realizados no Laboratório de Farmacognosia da UFRN.

4.2.3.2 Determinação da composição monossacarídica do extrato bruto de Agave


sisalana e suas frações
As amostras foram hidrolisadas com ácido trifluoroacético (2M) a 100 °C
durante 2 h (ZANG; LIU; LIN, 2014). Após hidrólise ácida, a composição
monossacarídica presente em EB, FrP e FrE foi determinada por meio de
cromatografia descendente em papel. A solução de acetato de etila; piridina; água
destilada (8:2:1 v/v/v) foi utilizada como sistema eluente. Os monossacarídeos
arabinose, ramnose, xilose, galactose, glicose, ácido galacturônico, manose (ZANG;
LIU; LIN, 2014) foram utilizados como padrões. Os cromatogramas foram revelados
com uma solução de nitrato de prata (3,3% p/v). As amostras e os padrões foram
aplicados nas mesmas concentrações e os testes realizados em duplicata. Esses
testes foram realizados no Laboratório de Biopolímeros da UFRN.
47

4.2.4 Caracterização química do extrato bruto de Agave sisalana e suas frações


O extrato bruto e frações foram caracterizados, por meio de métodos
espectrofotométricos, quanto às concentrações de açúcares totais, proteínas e
compostos fenólicos. Estes experimentos foram realizados no Laboratório de
Biopolímeros da UFRN.

4.2.4.1 Dosagem de açúcares totais


Determinada por meio do método fenol/ ácido sulfúrico (DUBOIS et al., 1956).
A D-galactose foi utilizada como padrão. A absorbância foi determinada em
espectrofotômetro (FTIR-8400S, IRAffinity-1, São Paulo, Brasil) na região de 490nm.

4.2.4.2 Dosagem de proteínas


A dosagem de proteínas foi determinada por meio do método de Bradford
(BRADFORD, 1976) utilizando soro de albumina bovina como padrão. A absorbância
foi determinada em espectrofotômetro (Biotek Epoch Microplate, California, USA) na
região de 595nm .

4.2.4.3 Dosagem de compostos fenólicos


O teor de compostos fenólicos foi verificado pelo método de Folin-Ciocalteu
(ATHUKORALA et al., 2006) utilizando o ácido gálico como padrão. A absorbância foi
determinada na região em espectrofotômetro (Biotek Epoch Microplate, California,
USA) na região de 765nm.

4.2.5 Avaliação da segurança do extrato bruto e da fração enriquecida em


polissacarídeos do subproduto
A avaliação da segurança do extrato bruto e da fração enriquecida em
polissacarídeos do subproduto de A. sisalana foram realizadas por meio de
metodologias in vitro e in vivo. Os ensaios in vitro foram realizados em colaboração
com o laboratório de cultura celular da Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal de São Paulo – UNIFESP.

4.2.5.1 Avaliação da segurança in vitro


Os testes in vitro foram realizados em cultura de células fibrosblasto 3T3
(embrião de rato): BALB/c 3T3 (ATCC CCL-163) de acordo com as metodologias in
48

vitro de citotoxicidade e fotoxicidade 3T3 NRU descritos respectivamente pela ISO


10993-5 (1992) e pela Organisation for Economic Co-operation and Development –
OECD (OECD 129, 2010).

4.2.5.1.1 Cultura de células

As células foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium


(DMEM) suplementado com 1 % (v/v) de solução de antibióticos contendo 10.000
UI.mL-1 de penicilina, 10 mg.mL-1 de estreptomicina e 1 mg.mL-1 de anfotericina B, 4
mM de glutamina e 10% (v/v) de soro fetal bovino (OECD 129, 2010). As culturas
celulares foram mantidas em condições padrão (5% de CO 2, 37 °C, 97% UR) por 24
horas. Após incubação (Thermo Scientic®, modelo 3425, Massachusetts, EUA), o
processo de separação celular ocorreu pela ação da solução de tripsina a 0,05% (p/v)
e EDTA 0,02% (p/v) em tampão fosfato a pH 7,4 (ICCVAM, 2006), repicadas e
semeadas em placas de 96 poços (P96w) com 2x104 células por poço. As passagens
celulares utilizadas para os ensaios foram entre P16 e P18.

4.2.5.1.2 Avaliação da citotoxicidade

O efeito citotóxico do EB e FrE foi avaliado por meio do ensaio de absorção de


vermelho neutro (Neutral Red - NR). Após esse período, a solução de NR foi retirada,
os poços foram lavados com solução fisiológica (Baxter®), para então adicionar
150 μL da solução de dessorção de NR (49 % (v/v) de água destilada, 50 % (v/v) de
álcool etílico P.A, Synth® e 1 % (v/v) de ácido acético glacial, Synth®). Em seguida, as
placas foram agitadas por 10 minutos. A leitura das absorbâncias foi realizada em
espectrofotômetro de placas (Biotek®, modelo Synergy HT, Vermont, EUA ) no
comprimento de onda de 540 nm e os valores de IC50 foram calculados através do
programa PHOTOTOX®. EB e FrE, foram avaliados em diferentes concentrações
(0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5,0, 10,0 e 20,0 mg/ml). Os valores de concentração inibitória
(IC) para 10% (IC10) e 50% de inibição (IC50) foram calculados ea viabilidade celular
foi calculada de acordo com a equação 1:
 DOam ostra 
VC (%)    x100
 DOcontrole  (1)

Onde: VC é a viabilidade celular, DOamostra é a densidade óptica do extrato, DOcontrole é a densidade


óptica do controle de células do teste.
49

4.2.5.1.3 Avaliação da fototoxicidade

A partir do ensaio de citotoxicidade (4.2.5.1.2) foram determinadas as


concentrações de EB e FrE a serem avaliadas no teste de fototoxicidade, de forma a
garantir que os resultados observados fossem descritos apenas como fototóxico. As
amostras foram expostas à radiação (UVA +) durante 1 hora e 50 minutos, para chegar
a uma dose de 5 J/cm2. Além disso, também foram avaliados nas mesmas
concentrações, na ausência de luz (UVA). Após este período, as células foram
submetidas a ensaio de Neutral Red e avaliado espectrofotometricamente a 540 nm
(conforme descrito no item 4.2.5.1.2). Os dados foram submetidos ao programa
Phototox® e determinado o Photo Irradiation Fator (PIF) e o efeito fototóxico médio
(Mean Phototoxic Effect - MPE) (OECD TG 432, 2004).

4.2.5.2 Avaliação da compatibilidade cutânea


Os testes de segurança clínicos foram realizados no Laboratório de segurança
e eficácia de produtos cosméticos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
(UFRN). Os testes realizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa
envolvendo Seres Humanos da Universidade de Cuiabá – UNIC sob o Registro n.041
CEP/UNIC – nº 195.680/2013 CEP/UNIC (ANEXO A).
Foram selecionados 18 indivíduos voluntários, ambos os sexos, com fototipo
de pele de I a IV (PATHAK; FITZPATRICK, 1993) e idade entre 22 e 46 anos, após
lerem e assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE),
(APÊNDICE A).
Foram utilizados diferentes critérios de exclusão como: marcas cutâneas na
área experimental que pudessem interferir na avaliação de possíveis reações
cutâneas (distúrbios de pigmentação, má formações vasculares, cicatrizes, aumento
de pilosidade, efélides e/ou nevus em grande quantidade, queimaduras solares);
dermatoses ativas (local ou disseminada); gestantes ou lactantes; antecedentes de
reações alérgicas, irritação ou sensações de desconforto intenso a produtos tópicos
(cosmético ou medicamentos); voluntários com histórico de alergia ao material
utilizado no estudo; antecedentes de atopia; antecedentes de patologias agravadas
ou desencadeadas pela radiação ultravioleta; portadores de imunodeficiências;
transplantados renais, cardíacos ou hepáticos; exposição solar intensa ou a sessão
de bronzeamento até 15 dias antes da avaliação inicial; previsão de exposição solar
intensa ou a sessão de bronzeamento durante o período de condução do estudo;
50

previsão de banho de mar, piscina, utilização de sauna durante o estudo; voluntários


que praticam esportes aquáticos; utilização de medicamentos de uso tópico ou
sistêmico: imunossupressores, anti-histamínicos, antiinflamatórios não hormonais e
corticoides até duas semanas antes da seleção; tratamento com vitamina a ácida e/ou
seus derivados via oral ou tópica até 3 meses antes do início do estudo; previsão de
vacinação durante a realização do estudo ou até 3 semanas antes do estudo.

4.2.5.2.1 Avaliação da irritabilidade primária


Três apósitos para testes de contato (patch test), foram fixados na parte
superior do dorso dos voluntários, cada um contendo 20 µL de uma solução contendo
0,5% e 1,0% da fração enriquecida em polissacarídeos do subproduto de Agave
sisalana e o controle negativo (água destilada). Os apósitos foram mantidos em
contato com a pele por 48 horas. As respostas à irritação da pele foram avaliadas
após 30 minutos, 24 horas e 48 horas, da remoção dos apósitos. Os resultados foram
interpretados de acordo com o International Contact Dermatitis Research Group
Guidelines (IRCDG), conforme representado no quadro 2 (FELLIPI et al., 2012;.
KLIGMAN E WOODING, 1967; WILKINSON et al., 1970).

Quadro 2 – Escala de avaliação preconizada pelo International Contact Dermatitis


Research Group Guidelines (IRCDG).

Reação Resultado

0 - Ausente Negativo (-)

1 – Eritema leve Duvidoso (?)

2 – Eritema nítido Positivo (+)

3 – Eritema + edema+ pápulas Positivo (++)

4 – Eritema + edema + pápulas + vesículas Positivo (+++)

Fonte: Adaptado de WILKINSON e colaboradores (1970).


51

4.2.6 Avaliação da eficácia in vitro do potencial antioxidante da fração


enriquecida em polissacarídeos

4.2.6.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil


(DPPH).
O potencial antioxidante da fração enriquecida em polissacarídeos, oriunda do
subproduto do desfibramento das folhas de Agave sisalana, foi determinado por meio
do teste de sequestro de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (BRAND-
WILLIAMS; CUVELIER; BERSET, 1995). A FrE foi avaliada nas concentrações de
0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 e 10,0 mg/mL. Solução etanólica de DPPH 0,1mM (2 mL)
foi adicionada a 1 mL das amostras (ZHANG; LIU; LIN, 2014). Após agitação, as
amostras foram mantidas a temperatura ambiente por um período de 30 minutos e as
absorbâncias foram mensuradas a 517 nm. As análises foram realizadas em triplicata
e os resultados expressos em média e desvio padrão. O BHT foi utilizado como
controle positivo e a solução de DPPH e água (solvente das amostras) como controle
negativo. A concentração efetiva do extrato em que 50% dos radicais foram
eliminados (EC50) foi determinada por meio de regressão linear. A capacidade da
amostra de sequestraros radicais DPPH (%) foi calculada de acordo com a equação
2.

Sequestro de radicais DPPH (%) = 1- [ Abs amostra /Abs controle negativo] x100(2)
Onde: Abs é a absorbância.

4.2.6.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total


A capacidade antioxidante total (CAT) da fração enriquecida em
polissacarídeos foi determinada segundo método adpatado de Prieto, Pineda e Aguiar
(1999). Uma alíquota de 0,5 mL da amostra (1 mg/mL) foi combinada com 1,0 mL da
solução reagente (ácido sulfúrico 0,6 M, fosfato de sódio 28 mM e molibdato de
amónio 4 mM) e adicionada de 4,5 mL de água destilada. As amostras foram
incubadas em banho-maria a 95 °C durante 90 min. Após arrefecimento das amostras
à temperatura ambiente, os valores de absorbância foram mensurados no
comprimento de onda de 695 nm. Uma solução branco, contendo 1 mL do solvente
utilizado para solubilização da amostra (água destilada) foi submetida e avaliada nas
mesmas condições. A CAT foi expressa como equivalente de ácido ascórbico (mg/g).
52

4.2.7 Desenvolvimento das nanoemulsões


A seleção dos componentes das formulações foi fundamentada nas
nanoemulsões desenvolvidas por Ribeiro e colaboradores (2015). Os ingredientes
selecionados para o desenvolvimento das formulações, suas fases de adição e
respectivas funções estão descritos na tabela1.

Tabela 1 – Ingredientes selecionados para desenvolvimento das formulações, fases


de adição e funções.
Composição (INCI) Função
Caprylic/CapricTriglyceride Emoliente
Ethylhexyl Palmitate Emoliente
Fase Oleosa

Isostearyl Neopentanoate Emoliente


Phenoxyetanol (and) Caprylic glicol Sistema conservante
Butyl HidroxiToluene Antioxidante
Sorbitan Monooleate Tensoativo
Polyssorbate 80 Tensoativo
Aquosa
Fase

Dissodium EDTA Agente sequestrante


Distilled Water Veículo

4.2.7.1 Preparo das formulações


As fases oleosa e aquosa foram pesadas separadamente conforme descritas
na Tabela 1. A fase aquosa foi vertida na fase oleosa e submetida à ultrassonicação
(High Intensity Ultrasonic Processor VCX 750, Newtown, EUA), na potência de 30 W
por 4 minutos, sob banho de gelo (SILVA et al., 2016). Para as formulações contendo
a fração enriquecida em polissacarídeos (FrE), essa foi adicionada à fase aquosa da
formulação.

4.2.7.2 Determinação do equilíbrio hidrófilo-lipófilo (EHL) requerido pela fase oleosa


O equilíbrio hidrófilo – lipófilo (EHL) foi determinado utilizando um sistema
contendo 5% de fase oleosa, 5% de diferentes proporções do sistema tensoativo
(Sorbitan Monooleate e Polyssorbate 80) e 90% de água. As amostras foram obtidas
com uma mistura de tensoativos em que os valores de EHL variavam em uma escala
de 8 a 15 com intervalos de 1,0, resultando em 8 sistemas. Os cálculos para
determinação do valor de EHL foram realizados utilizando a equação 3: Após 24 horas
53

do preparo, conforme item 4.2.7.1, as amostras foram submetidas ao teste de


centrifugação e avaliadas macroscopicamente.

A + B = 100
EHL A x 0,01. A + EHLB x 0,01. B= EHLRequerido(3)

Onde:
A = Porcentagem de tensoativo hidrofílico;
B = Porcentagem de tensoativo lipofílico;
EHLA= Equilíbrio hidrófilo – lipófilo de A;
EHLB = Equilíbrio hidrófilo – lipófilo de B;
EHL R = Equilíbrio hidrófilo – lipófilo resultante ou requerido pela fase oleosa.

4.2.7.2.1 Análise macroscópica


As características organolépticas (cor e odor), bem como a presença de
fenômenos de instabilidade foram observados. As amostras foram classificadas como:
homogênea, sem alterações (H); levemente modificada (LM); modificada (M) e
intensamente modificada (IM) (BRASIL, 2005).

4.2.7.2.2 Centrifugação
As amostras (10 g) que não apresentaram separação de fases após 24 horas
de preparo, foram submetidas a 3000 rpm durante trinta minutos (Fanen, mod 206 BL,
Brasil) à temperatura ambiente (25±2°C) (BRASIL, 2005).

4.2.7.3 Elaboração do pseudodiagrama ternário


Após a determinação do EHL requerido pela fase oleosa da formulação, um
pseudodiagrama de fases foi mapeado. O pseudodiagrama foi preparado variando as
concentrações dos componentes em intervalos de 10% de forma que todo o triângulo
equilátero fosse preenchido. Deste modo, 36 formulações foram obtidas (LO et al.,
1976). Cada ponto foi denominado numericamente de acordo com sua localização,
sendo que o ponto 1 está localizado no vértice superior do triângulo seguindo a
sequência numérica da esquerda para a direita (Figura 7). Na tabela 2, é possível
observar a composição de cada ponto do pseudodiagrama. Um segundo
54

pseudodiagrama ternário foi obtido acrescido com 0,5% da fração enriquecida em


polissacarídeos.

Figura 7 – Representação gráfica do pseudodiagrama ternário com a localização dos


pontos correspondentes à composição das formulações.

2 3

Fa
%) 4 5 6

s
eO
s(
vo

7 8 9 10

leo
ati

sa
so

(%
11
n

12 13 14 15
Te

)
16 17 18 19 20 21

22 23 24 25 26 27 28

29 30 31 32 33 34 35 36

Fase Aquosa (%)

Tabela 2 –Composição das formulações (% p/p) obtidas pelo pseudodiagrama


ternário com suas respectivas localizações.
Fase Fase Fase Fase
Localização Tensoativos Localização Tensoativos
oleosa aquosa oleosa aquosa
1 80 10 10 19 30 30 40
2 70 20 10 20 30 20 50
3 70 10 20 21 30 10 60
4 60 30 10 22 20 70 10
5 60 20 20 23 20 60 20
6 60 10 30 24 20 50 30
7 50 40 10 25 20 40 40
8 50 30 20 26 20 30 50
9 50 20 30 27 20 20 60
10 50 10 40 28 20 10 70
11 40 50 10 29 10 80 10
12 40 40 20 30 10 70 20
13 40 30 30 31 10 60 30
14 40 20 40 32 10 50 40
15 40 10 50 33 10 40 50
16 30 60 10 34 10 30 60
17 30 50 20 35 10 20 70
18 30 40 30 36 10 10 80
55

4.2.8 Avaliação da estabilidade das formulações


Anteriormente aos testes de estabilidade preliminar, as formulações obtidas
e selecionadas a partir dos pseudodiagramas foram manipuladas em três lotes e
submetidas a centrifugação e análise macroscópica 24 horas após o preparo. As
formulações que se mantiveram homogêneas após a centrifugação foram avaliadas
quanto ao tamanho de gotícula e índice de polidispersividade.

4.2.8.1 Análise macroscópica


A avaliação macroscópica foi realizada conforme descrito no item 4.2.7.2.1. Os
sistemas obtidos foram classificados como: sistema líquido transparente (SLT);
sistema líquido translúcido (SLTL); sistema viscoso transparente (SVT); sistema
líquido opaco (SLO); sistema viscoso opaco (SVO) e, separação de fases (SF)
(CHORILLI, 2007).

4.2.8.2 Centrifugação
Após a classificação dos sistemas obtidos, os sistemas classificados como SLO
foram submetidas ao teste de centrifugação, conforme descrito no item 4.2.7.2.2.

4.2.8.3 Determinação de tamanho de gotícula e polidispersividade


A determinação do tamanho de gotícula e a polidispersividade foram
determinadas por espalhamento de luz dinâmico (Dynamic Light Scattering - DLS)
(Malvern Zetasizer Nano ZS, Malvern, United Kingdom) em 25 °C. O ângulo de leitura
foi fixado em 173°. Anteriormente às análises, as formulações foram diluídas com
água destilada numa proporção de 1:200 (v/v) (RIBEIRO et al., 2015). As análises
foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em média e desvio padrão.

4.2.8.4 Avaliação da estabilidade preliminar das formulações e adequação de


localização do sistema tensoativo
As amostras consideradas adequadas para desenvolvimento de nanoemulsões
foram selecionadas para o estudo de adequação de localização do sistema tensoativo
frente à estabilidade e posteriormente aos testes de estabilidade. As formulações
foram preparadas em três lotes e as avaliações realizadas em triplicata em cada lote.
Os resultados foram expressos em média e desvio padrão.
56

4.2.8.4.1 Estudo de adequação de localização do sistema tensoativo frente à


estabilidade das formulações
As formulações selecionadas foram avaliadas em grupos onde no primeiro
grupo (TS), o sistema tensoativo foi adicionado de acordo com as características de
solubilidade de cada tensoativo, ou seja, em fases separadas. No segundo grupo
(TFO), o sistema tensoativo foi adicionado à fase oleosa e em um terceiro grupo (TFA),
o sistema tensoativo foi adicionado à fase aquosa.

4.2.8.4.2 Avaliação da estabilidade preliminar


As amostras foram mantidas por cinco dias em estufa (Odontobrás, mod. ECB1.1,
São Paulo, Brasil) a 45 ± 2°C. As avaliações foram realizadas após 24 horas do
preparo (t0) e ao final do quinto dia (t5), de acordo com os seguintes parâmetros:

Análise macroscópica: observação do aspecto, cor e odor das formulações (RIBEIRO


et al., 2015).

Determinação do valor do pH: em um tubo de ensaio foram adicionados 1,0 g da


amostra e 9,0 g de água recém destilada, homogeneizadas e determinado o valor do
pH, inserindo o eletrodo (Hanna Instruments, mod. HI 21, São Paulo, Brasil)
diretamente na amostra diluída (DAVIS, 1977).

Determinação do tamanho de gotícula e polidispersividade: conforme descrito no item


4.2.8.3.

Determinação do potencial zeta: o potencial zeta foi determinado por Phase Analysis
Light Scattering (PALS) (Malvern, Malvern Zetasizer Nano ZS,Worcestershire, United
Kingdom) em 25 °C. Anteriormente às análises, as formulações foram diluídas com
água destilada numa proporção de 1:200 (v/v) (RIBEIRO et al., 2015). As análises
foram realizadas em triplicata e os resultados expressos em média e desvio padrão.

4.2.8.5 Avaliação da estabilidade acelerada


As nanoemulsões, consideradas estáveis pelos testes preliminares, foram
acondicionadas em frascos de vidro hermeticamente fechados e submetidas aos
testes de estabilidade acelerada. As formulações foram avaliadas inicialmente (24
57

horas após sua obtenção) e 30, 60 e 90 dias após exposição a diferentes condições
de temperatura: 4°C ± 2°C (Consul, Mod. CRB36AB, São Paulo, Brasil), temperatura
ambiente (25°C ± 2°C) e 45°C ± 2°C (Odontobrás, mod. ECB1.1, São Paulo, Brasil).
O tamanho de gotícula, o potencial zeta e o valor de pH, foram utilizados como
parâmetros avaliativos da estabilidade (BRASIL, 2005).

4.2.9 Avaliação da eficácia hidratante

4.2.9.1 Casuística e aspectos éticos


A avaliação da eficácia clínica hidratante foi realizada com aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Cuiabá - UNIC sob o Registro n.041
CEP/UNIC – nº 195.680/2013 CEP/UNIC (ANEXO A) e realizada no Laboratório de
segurança e eficácia de produtos cosméticos da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte.
Foram selecionados 18 voluntários, entre 22 e 35 anos, ambos os sexos, que
declararam não apresentar história de doenças de pele, sensibilidade conhecida a
produtos cosméticos, lesões visíveis no momento dos testes ou ainda estar no período
gestacional ou de lactação.Todos os voluntários foram esclarecidos e orientados
sobre os objetivos e métodos da pesquisa e concordaram em participar, após leitura
e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (APÊNCIDE B). Os
voluntários foram orientados a não se expor ao sol ou utilizar produtos cosméticos
durante duas semanas antes e no dia do experimento, exceto produtos de limpeza,
como sabonetes. O estudo realizado foi do tipo monocego, aleatorizado, controlado
por placebo (FLUHR, 2011; RIBEIRO et al., 2015).

4.2.9.2 Avaliação clínica da eficácia hidratante


Anteriormente ao início dos testes, os voluntários permaneceram no ambiente
por um período de, pelo menos, 30 minutos, para adaptação da pele às condições de
temperatura (21°C ± 2°C) e umidade relativa (55% ± 5%) do ambiente (FELIPPI et al.,
2012).
Quatro áreas, de 9 cm2 cada, (A1 a A4) foram demarcadas, aleatoriamente, nos
antebraços dos voluntários e aplicados 2 mg/cm 2 de cada formulação e reservada
uma área para o controle negativo, na qual não foi aplicada formulação (Quadro 3).
58

Quadro 3 - Descrição das áreas demarcadas nos antebraços dos voluntários para
aplicação das formulações durante o estudo da eficácia hidratante.

Área Descrição

A1 Controle negativo

A2 Veículo

A3 Veículo + 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos

A4 Controle positivo ( formulação comercial)

4.2.9.2.1 Avaliação do conteúdo hídrico do estrato córneo


Foram realizadas nove leituras, por área, antes da aplicação das formulações
(basal) e 1, 2, 3, 4, e 5 horas após a uma única aplicação das formulações e também
na área utilizada como controle negativo (RIBEIRO et al., 2015). Os resultados foram
obtidos por meio da medida da capacitância da pele (Corneometer® CM 825 -
Courage-Khazaka eletronic GmbH, Nordrhein-Westfalen, Alemanha) e expressas
numericamente em unidades arbitrárias.

4.2.9.2.2 Avaliação da perda de água transepidermal (Transepidermal Water Loss –


TEWL)
As medidas foram determinadas antes (basal) e 1, 2, 3, 4 e 5 horas após uma
única aplicação das formulações. Foi realizada uma leitura em cada área, registradas
por 120 segundos, sendo os primeiros 30 segundos, referentes à estabilização da
sonda, desconsiderados (RIBEIRO et al., 2015). A avaliação da perda de água
transepidermal foi realizada por meio de evaporímetro de câmera aberta (Tewameter®
TM 300 - Courage-Khazaka eletronic GmbH, Nordrhein-Westfalen, Alemanha) e os
resultados expressos numericamente em g/m2.h.

4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos para avaliação da estabilidade das nanoemulsões foram


expressos em média ± desvio padrão da média e interpretados por meio da análise
59

da variância (ANOVA) e pós teste de Tukey (considerando p<0,05 como


estatisticamente significativo), utilizando o software estatístico GraphPad Prism 6.
Os resultados da avaliação da eficácia clínica foram expressos em média ± erro
padrão da média e interpretados por meio da análise da variância (ANOVA) e pós
teste de Tukey, para avaliação do conteúdo hídrico, e análise da variância (ANOVA)
e pós teste de Dunnett, para a TEWL, (considerando p<0,05 como estatisticamente
significativo), utilizando o software estatístico GraphPad Prism 6.
60

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO BRUTO E FRAÇÕES DO


SUBPRODUTO DO BENEFICIAMENTO DE Agave sisalana
A partir da prensagem do subproduto de Agave sisalana foi obtida uma porção
líquida, denominada de extrato bruto (EB), a qual foi então submetida a um processo
de extração com etanol, de modo a se obter uma fração enriquecida em
polissacarídeos. As frações líquida (sobrenadante) e sólida (precipitado),
denominadas de FrE e FrP, respectivamente, foram obtidas. Posteriormente, com o
intuito de se obter uma matéria-prima mais estável, as amostras foram submetidas ao
processo de liofilização. As características organolépticas apresentadas para os pós
liofilizados do extrato bruto e suas frações (FrP e FrE) estão apresentadas na Tabela
3.

Tabela 3 - Características organolépticas apresentadas pelos pós liofilizados do


extrato bruto de Agave sisalana e suas frações (FrP e FrE).

Extrato/Fração Pó liofilizado Característica organolépticas

Pó, verde-amarelado, odor característico da


EB
planta.

Pó, branco-amarelado, odor característico da


FrP
planta.

Pó, amarelo-esverdeado, odor característico da


FrE
planta.

Onde: EB: extrato bruto; FrP: fração obtida a partir do precipitado do processo de extração e FrE: fração
obtida a partir do sobrenadante do processo de extração.

A precipitação etanólica para obtenção de diferentes polissacarídeos tem sido


descrita (SANTOS et al., 2013; ZHANG; LIU; LIN, 2014). Entretanto, nestas pesquisas
o foco foi a elucidação dos constituintes presentes na porção sólida, ou seja, o
precipitado do processo. Assim, este trabalho centrou-se na quantificação de
açúcares e outros metabólitos presentes na porção líquida do subproduto de Agave
sisalana sob novas perspectivas química e bioativa.
61

Os polissacarídeos tem ampla distribuição na natureza e, quando ocorrem em


vegetais superiores tem função de reserva (amido, frutanos, mucilagens), estrutural
(celulose, hemicelulose, pectinas) ou defesa (gomas). Assim, podem ser considerados
os principais constituintes da parede celular de plantas e por esse motivo, são obtidos
em abundância. As principais estruturas de polissacarídeos de origem vegetal são
extremamente complexas e diversas (SHI, 2016).
A complexa estrutura polimérica e hidrofilia dos polissacarídeos, torna sua
investigação dificultada, especialmente na etapa do isolamento. Dessa forma,
anteriormente à investigação cromatográfica desses componentes é tradicionalmente
realizado um processo de hidrólise ácida, de tal forma que a estrutura dos
polissacarídeos seja quebrada em suas unidades básicas para identificação
estrutural. Contudo, a visualização desses monossacarídeos é prejudicada por
possuírem carcaterísticas cromatográficas de eluição muito semelhantes, dificultando
a separação das moléculas em sistemas convencionais (SHI, 2016; SKALSKA-
KAMIŃSKA et al, 2009), o que requisita equipamentos com maior capacidade de
resolução. Neste estudo, a caracterização química preliminar foi realizada por
cromatografia em camada delgada (CCD) utilizando diferentes reagentes (Figura 8).
Inicialmente, as amostras foram avaliadas utilizando como reagente revelador
o ácido sulfúrico, com o objetivo de oxidar as moléculas orgânicas presentes na
amostra. Através desse reagente inespecífico, os carboidratos podem ser visualizados
na coloração marrom escuro e observa-se na Figura 8A algumas bandas compatíveis
com esse perfil.
A especificidade na identificação de açúcares pode ser alcançada com a adição
de compostos fenólicos, como o timol, que em meio ácido, estabelecem a reação entre
a estrutura cíclica dos açúcares com o grupamento fenil, resultando em uma coloração
amarelada, sendo o reagente timol/sulfúrico tradicionalmente utilizado para revelação
de açúcares em CCD (DUBOIS et al., 1956; SKALSKA-KAMINSKA et al., 2009). Na
figura 8B observa-se de forma mais significativa a ocorrência de bandas com esse
perfil na amostra EB.
62

Figura 8 – Cromatograma obtido por cromatografia em camada delgada do EB e suas


frações, FrE e FrP.

Onde: (A) Revelação com solução de ácido sulfúrico 10% (v/v); (B) Revelação com solução de
timol/ácido sulfúrico; (C) Revelação com solução de ninhidrina 0,2%. EB: extrato bruto do subproduto
de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do processo de extração do subproduto
de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do processo de extração do subproduto
de Agave sisalana.

Além disso, um cromatograma revelado com o reagente ninhidrina também foi


obtido (Figura 8C). A ninhidrina é um reagente específico para a revelação de
moléculas que contenham o grupamento amino tais como aminoácidos e pequenos
peptídeos. Dessa forma inferindo o perfil proteico da amostra. Através dessa técnica
observa-se coloração púrpura característica e também é possível observar coloração
amarela na presença do aminoácido prolina e azul metálica na presença de tirosina.
Considerando a coloração e intensidade das bandas visualizadas em CCD, os
perfis cromatográficos indicam a presença predominante de açúcares no EB quando
comparado com suas frações FrE e FrP, para os reagentes ácido sulfúrico e ácido
sulfúrico adicionado do composto fenólico (timol/ ácido sulfúrico). É possível observar
na Figura 8C que as bandas do cromatograma apresentaram coloração compatível
com aminoácidos/peptideos indicando maior presença de proteínas na amostra EB
em comparação às demais frações. Considerando a intensidade da coloração das
bandas cromatográficas após as diferentes condições de revelação sugere-se que as
amostras sejam compostas em sua maioria por açúcares e que o perfil químico da
amostra FrE é similar ao EB enquanto que para a amostra FrP sugere-se a ocorrência
de macromoléculas de alto peso molecular e elevada polaridade, visto que não eluiu
do ponto de aplicação nas condições testadas.
63

A elucidação da composição monossacarídica das amostras foi obtida por meio


de cromatografia descendente em papel, técnica tradicionalmente utilizada para este
fim, em comparação com padrões de monossacarídeos. A técnica de cromatografia
em papel tem sido empregada na identificação e isolamento de açúcares e múltiplos
componentes, preliminarmente ou acoplada a outras diferentes técnicas, mostrando-
se uma técnica eficaz e de baixo custo (YASSA et al., 2009; YU; WHITE, 2013;
ZHANG et al., 2017).
O ensaio foi realizado em duas etapas: i) em um primeiro momento, as
amostras foram avaliadas sem que tenham sido submetidas ao processo de hidrólise,
com o objetivo de identificar a presença de monossacarídeos livres e, ii) em uma
segunda etapa, as amostras foram submetidas a uma hidrólise ácida com ácido
trifluoroacético (2M) (ZHANG; LIU; LIN, 2014).
As amostras não hidrolisadas apresentaram glicose e manose como
monossacarídeos livres. A composição monossacarídica obtida para as amostras
após hidrólise está representada na Tabela 4.
Em comparação com o observado para o produto não hidrolisado, a presença
dos monossacarídeos apresentados na Tabela 4 sugere que os polissacarídeos
presentes no extrato bruto e frações do subproduto de A. sisalana apresentam em sua
composição química os monossacarídeos: arabinose, galactose, glicose, manose,
ramnose e xilose, de acordo com os padrões disponíveis no experimento. A
determinação da estrutura primária dos polissacarídeos (sequência e tipo dos
monossacarídeos), o grau de polimerização (número de unidades monossacarídicas
contidas nas macromoléculas) e a conformação espacial são objetivos de estudos
futuros.
A composição de polissacarídeos apresentada por EB e suas frações é
diferente daquela previamente relatadas em estudos anteriores para o subproduto de
Agave sisalana. Os autores Zhang, Liu e Lin (2013), utilizando um método de extração
exaustivo a quente (soxhlet), relataram a ocorrência de polissacarídeos constituídos
de arabinose, galactose, glicose, manose, ramnose e ribose. Posteriormente, os
mesmos autores, utilizando um método de extração com etanol sob aquecimento,
obtiveram polissacarídeos constituídos de galactose, glicose, manose e ramnose
(ZHANG; LIU; LIN, 2014).
64

Tabela 4 – Composição monossacarídica após o processo de hidrólise ácida com


ácido trifluoroacético (2M) para o EB e suas frações (FrP e FrE).
MONOSSACARÍDEOS/ ESTRUTURA
EB FrP FrE
PADRÕES QUÍMICA

Ácido galacturônico

Arabinose x

Galactose x x

Glicose x x x

Manose x x

Ramnose x x

Xilose x

Onde: EB: extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana.

É importante destacar que as diferenças na composição monossacarídica


encontrada nos estudos pode ser atribuída a diversos fatores, dentre eles a
disponibilidade de padrões para comparação cromatográfica, a utilização de
temperatura e/ou agitação para otimização da extração e também as condições
climáticas às quais a planta está submetida em seu habitat de coleta. Esse último fator
é de extrema importância, visto que os carboidratos assumem importantes papeis na
constituição e sinalização celular frente a estresses abióticos (LIVINGSTON; HINCHA;
65

HEYER, 2009). Sabe-se que a disponibilidade de carboidratos nas plantas para


fornecer energia e gerar biomassa tem importante impacto nas redes moleculares que
coordenam a divisão e expansão celular. Ainda, os níveis de carboidratos são
temporalmente e espacialmente regulados na planta, onde diferentes açúcares podem
ter papeis regulatórios específicos em processos bioquímicos, de acordo com o
estágio de desenvolvimento da planta e com os estresses ambientais aos quais está
submetida (LASTDRAGER; HANSON; SMEEKENS, 2014). Assim, Agave sisalana
cultivada no nordeste brasileiro pode apresentar características fitoquímicas
diferenciadas em relação à mesma matéria-prima oriunda de outros locais com
biomas diferentes. Esse complexo e dinâmico cenário da oscilação de constituição
química entre indivíduos da mesma espécie valoriza a matéria-prima estudada neste
trabalho.
No procedimento adotado nesta pesquisa, a temperatura não foi utilizada como
catalisador no processo extrativo, o que favorece a preservação da identidade química
dos metabólitos da planta. Além disso, pode-se destacar que a obtenção de uma
matéria-prima bioativa de interesse para a indústria cosmética, preferencialmente,
deve ser obtida com número reduzido de procedimentos e de fatores que possam
aumentar o seu custo de obtenção.
Considerando que o objetivo deste estudo é a aplicação em cosmetologia do
ativo vegetal, torna-se relevante a investigação de proteínas e compostos fenólicos
no subproduto de A. sisalana visto que a ocorrência desses metabólitos são, assim
como os polissacarídeos, desejáveis em tal matéria-prima. Dessa maneira, foi
realizada determinação do total de açúcares, proteínas e compostos fenólicos (Tabela
5).
Semelhante ao observado qualitativamente por CCD foi identificada uma
concentração significante de açúcares nas amostras (Tabela 5). A fração FrE,
apresentou concentração mais elevada de açúcares quando comparada ao extrato
bruto, indicando que o processo de extração com etanol foi eficiente para gerar uma
amostra enriquecida em polissacarídeos, uma vez que viabilizou a precipitação das
proteínas. Esse resultado se confirma com a verificação de maior concentração
protéica na fração precipitado. Ainda, a fração FrP apresentou maior concentração de
compostos fenólicos, quando comparada a EB e FrE.
66

Tabela 5 - Quantificação de açúcares totais, proteínas e compostos fenólicos. Os


resultados foram apresentados em média percentual ± desvio padrão.
Açúcares totais Proteínas Compostos
(%) (%) fenólicos (%)

EB 41,31 ± 2,41 0,12 ± 0,01 1,27 ± 0,13

FrP 12,30 ± 1,46 0,23 ± 0,06 4,23 ± 0,00

FrE 65,49 ± 0,51 0,04 ± 0,01 2,53 ± 0,04

Onde: EB: extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; FrP: fração obtida a partir do precipitado do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana; FrE: fração obtida a partir do sobrenadante do
processo de extração do subproduto de Agave sisalana.

A caracterização de extratos vegetais quanto ao teor de açúcares totais,


proteínas e compostos fenólicos, é uma importante ferramenta no desenvolvimento
de um produto cosmético para cuidados da pele, tendo em vista as diferentes
aplicabilidades a que esses compostos estão relacionados. Sabendo da atividade
hidratante atribuída aos polissacarídeos e proteínas, além do potencial antioxidante
atribuído aos compostos fenólicos e polissacarídeos, foram selecionados para dar
continuidade aos estudos e avaliados quanto à segurança cosmética as amostras EB
e FrE.
Em produtos cosméticos, os polissacarídeos são utilizados como agentes
hidratantes capazes de promover a regulação do conteúdo hídrico da pele, podendo
atuar capturando a umidade na pele ou ainda formar um filme superficial capaz de
promover melhorias no sensorial das formulações (BONTÉ, 2011). Os polissacarídeos
podem, ainda, atuar como estabilizantes de emulsões, característica interessante no
desenvolvimento de novos produtos (SHAO; ZHU; JING, 2017). Além disso, o
potencial antioxidante desses compostos também pode ser relacionado à prevenção
do envelhecimento cutâneo, função essa reconhecidamente desempenhada pelos
compostos fenólicos (GARBOSSA; MAIA CAMPOS, 2016; STOJILJKOVI; ARSI;
TADIC, 2016).
Os benefícios das proteínas em produtos para cuidados da pele foram
demonstrados em estudos com proteínas da seda realizados por Daithankar e
colaboradores (2005), quando as proteínas promoveram o aumento do conteúdo
67

hídrico da pele. A eficácia das proteínas como ativos hidratantes também foi
demonstrada em extratos proteicos de trigo (Triticum vulgare) e soja (Glycine soya)
(GIANETE; MAIA-CAMPOS, 2012).
Rodrigues (2016), utilizando as mesmas metodologias empregadas no
presente estudo, caracterizou o extrato hidroetanólico liofilizado de folhas de
Kalanchoe brasiliensis. O extrato apresentou açúcares (14,61 ± 0,35%), proteínas
(0,12 ± 0,05 %) e compostos fenólicos (4,60 ± 0,07 %). Comparado ao estudo
realizado por Rodrigues (2016), pode-se observar que FrP possui constituição química
semelhante ao extrato de Kalanchoe brasiliensis no que se refere aos grupos de
metabólitos investigados, enquanto EB e FrE apresentam maior concentração de
açúcares totais além da presença de compostos fenólicos. O extrato obtido por esse
autor promoveu aumento do conteúdo hídrico da pele e ainda diminuiu a perda de
água transepidermal, promovendo um efeito barreira, comprovando o potencial
cosmético desses constituintes.
Tais resultados evidenciam o potencial do subproduto de Agave sisalana como
ingrediente cosmético. Outras espécies de Agave têm sido avaliadas como fonte de
compostos bioativos. Ahumada-Santos e colaboradores (2013) avaliaram a
composição química quanto à presença de metabólitos secundários, nas folhas de
seis diferentes espécies de Agave (A. rzedowskiana, A. impressa, A. ornithobroma, A.
schidi-gera, A. angustifólia e A. tequilana). As espécies demonstraram composição
química diferentes entre si e variadas conforme o tipo de solvente utilizado (metanol,
etanol, clorofórmio e água) no processo de extração. Baixas concentrações de
flavonoides foram obtidas nessas espécies enquanto que os triterpenos foram
observados em moderadas concentrações. Agave tequilana tem sido avaliada como
fonte de carboidratos para aplicações nutricionais e de bioenergia (ARRIZON J. et al.,
2010). Além disso, aminoácidos como serina, fenilalanina e lisina também foram
identificados na espécie de Agave salmiana (SANTOS-ZEA et al., 2016)
Outras fontes naturais de carboidratos têm sido avaliadas quanto às
concentrações de polissacarídeos. Fidelis e colaboradores (2014) avaliaram o
conteúdo de polissacarídeos de algas marinhas Gracilaria birdiae e obtiveram
concentrações inferiores a 15%. Polissacarídeos isolados de sabugos de milho
apresentaram concentrações elevadas de carboidratos (70%) (Melo-Silveira et al.,
2012), valor semelhante ao encontrado para FrE, evidenciando novamente o potencial
68

dessa fração de A. sisalana como fonte de polissacarídeos e, portanto, potencial


aplicação em cosméticos.

5.2 AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA DO EXTATO BRUTO E DA FRAÇÃO


ENRIQUECIDA EM POLISSACARÍDEOS DO SUBPRODUTO DE Agave sisalana

5.2.1 Avaliação da citotoxicidade in vitro


Nas concentrações de 0,128 e 0,45 mg/mL, das amostras EB e FrE,
respectivamente, verificou-se a viabilidade celular > 90% para BALB/c 3T3 (IC10)
(Figura 9). A amostra EB apresentou um valor de IC50 de 0,252 mg/mL, sugerindo que
a utilização de concentrações superiores podem provocar efeitos citotóxicos sobre a
pele. Assim, a partir desses resultados o extrato bruto não foi avaliado nos testes
subsequentes. Nas concentrações avaliadas, não foi possível calcular o valor IC50
para FrE, indicando esta fração como não-citotóxica, assim considerada segura para
aplicação cosmética.

Figura 9- Avaliação da citotoxicidade do extrato bruto (EB) e da fração enriquecida


em polissacarídeos (FrE).

Onde:(A) avaliação da citotoxicidade do extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; (B) avaliação
da citotoxicidade da fração enriquecida em polissacarídeos obtidas do extrato bruto do subproduto de
Agave sisalana. Gráficos plotados pelo programa PHOTOX®.

Apesar dos polissacarídeos serem considerados usualmente não-tóxicos, as


misturas de componentes presentes nos extratos vegetais podem produzir reações
locais quando aplicadas sobre a pele sendo, dessa forma, um fator crítico para a
utilização como ingredientes cosméticos (NOHYNEK et al., 2010; ZHANG; LIU; LIN,
2014).
69

Negreiros (2015) avaliou a citotoxicidade de polissacarídeos, em células do tipo


3T3, oriundos de quatro diferentes espécies de algas (Dictyopteris justii
J.V.Lamouroux; Dictyota mertensii (Martius) Kützing; Sargassum filipendula C.Agardh
eSpatoglossum schröederi (C.Agardh). Em concentrações de 1,0 mg/mL, os
polissacarídeos promoveram diminuição significativa da viabilidade celular. Assim os
resultados obtidos pela autora demonstraram o potencial irritante desses ingredientes,
evidenciando a importância da avaliação da segurança desses para uso em produtos
para cuidados da pele.

5.2.2 Avaliação da fototoxicidade in vitro


Elevado número de casos de irritação ou sensibilização (foto-dermatite)
induzida por exposição à radiação UVA, após o contato da pele humana com plantas
ou ingredientes vegetais, tem sido relatada na literatura (ANTIGNAC et al., 2011).
Uma característica comum das substâncias que induzem efeitos fototóxicos é a sua
capacidade para absorver a radiação ultavioleta (FREITAS; GASPAR, 2016).
O potencial fototóxicos de três diferentes produtos naturais (Apigenina, Crisina
e betacaroteno) foi avaliado por Freitas e Gaspar (2016). Crisina (flavonoide) e
betacaroteno (tetraterpeno) apresentaram perfil fototóxico quando valores de PIF
superiores a 1,0 e MPE de superios a 0,15 foram observados. A OCDE TG 432 (2004)
descreve os parâmetros para a previsão de PIF e MPE, com base no estudo de
validação: uma substância com PIF < 2 ou um MPE < 0,1 prediz: "nenhuma
fototoxicidade". Valores de PIF > 2 e <5 ou MPE > 0,1 e <0,15 prediz: "fototoxicidade
provável" e PIF > 5 ou MPE > 0,15 prediz: "fototoxicidade".
A fototoxicidade é uma resposta aguda gerada após a aplicação de uma
substância ativa sobre as células, com a subsequente exposição à luz ultravioleta e
ausência de citotoxicidade. Assim, as células foram submetidas a diferentes
concentrações de amostras e expostas ou não à luz UVA. A Figura 10 apresenta os
resultados obtidos para EB e FrE.
70

Figura 10- Avaliação da fototoxicidade do extrato bruto (EB) e da fração enriquecida


em polissacarídeos (FrE).

Onde: (A) avaliação da fototoxicidade do extrato bruto do subproduto de Agave sisalana; (B) avaliação
da fototoxicidade da fração enriquecida em polissacarídeos obtidas do extrato bruto do subproduto de
Agave sisalana. Gráficos gerados pelo programa PHOTOX®.

As amostras de EB e FrE apresentaram valores de MPE de -0,133 e -0,024,


respectivamente, e ambos um valor de PIF igual a 1,0. Portanto, de acordo com a
OCDE TG 432 (2004), os valores de MPE e PIF obtidos, EB e FrE não apresentam
fototoxicidade.
No entanto, diante dos resultados observados nos testes de citotoxicidade,
onde a concentração máxima considerada não citotóxica para EB foi inferior a 0,5%,
apenas FrE foi selecionada para os testes de segurança in vivo.

5.2.3 Avaliação da compatibilidade cutânea


Os produtos cosméticos contendo ingredientes vegetais podem ser utilizados
diariamente permanecendo em contato com a pele por longos períodos. Assim é de
suma importância a avaliação da segurança in vivo.
Devido a sua complexa estrutura química, matérias-primas de origem vegetal
podem conter substâncias potencialmente alérgicas ou irritantes. A avaliação da
compatibilidade cutânea proporciona uma visualização prévia de possíveis
mecanismos irritativos e ou alérgicos, principais preocupações na avaliação da
segurança de novos ingredientes para cuidados pessoais (ANTIGNAC et al., 2011;
BRASIL, 2012).
A irritabilidade primária foi avaliada por meio do patch teste em condições
maximizadas, utilizando apósitos com oclusão (Figura 11). As concentrações
avaliadas, 0,5% e 1,0%, foram escolhidas a partir dos resultados observados nos
71

testes de segurança in vitro e devido essas serem concentrações comumente


utilizadas em formulações cosméticas.

Figura 11 – Avaliação da irritabilidade primária da fração enriquecida em


polissacarídeos obtida do extrato bruto do subproduto de Agave sisalana.

Fonte: Autoria própria.

Nas concentrações avaliadas, nenhum dos voluntários apresentou quaisquer


sinais de eritema, edema, pápulas e ou vesículas, de acordo com a escala
preconizada pelo International Contact Dermatitis Research Group Guidelines
(IRCDG) (WILKINSON et al., 1970), portanto, a fração enriquecida em polissacarídeos
nas concentrações de 0,5 e 1,0% foram consideradas seguras para veiculação em
produtos para uso tópico.

5.3 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA IN VITRO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE DA


FRAÇÃO ENRIQUECIDA EM POLISSACARÍDEOS

Extratos vegetais ricos em moléculas bioativas com capacidade antioxidante,


representam importante oportunidade para a área cosmética, tendo em vista o
potencial como matéria-prima na prevenção do envelhecimento cutâneo ou outras
desordens ocasionadas pelos radicais livres (STOJILJKOVI; ARSI; TADIC, 2016). Nos
últimos anos, os polissacarídeos e os polifenois tem despertado o interesse de
pesquisadores na crescente busca por ativos antioxidantes de origem vegetal para
72

diferentes aplicabilidades (LIN et al., 2015; ZHANG; LIU; LIN, 2013; ZHANG; LIU; LIN,
2014; ZUGI´C et al., 2014).

5.3.1 Avaliação da capacidade do sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil


(DPPH).
O teste de sequestro de radicais DPPH é um importante método in vitro,
amplamente utilizado na avaliação da eficácia de potenciais antioxidantes naturais
(CARMONA-JIMÉNEZ et al., 2014).

Figura 12 – Avaliação da capacidade antioxidante da fração FrE frente ao sequestro


de radicais DPPH.

100
Sequestro de radicais DPPH (%)

80

BHT
60 FrE

40

20

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
mg/mL

Onde: BHT- Butilhidroxitolueno; FrE - Fração enriquecida em polissacarídeos, obtida a partir do


extrato bruto do subproduto de Agave sisalana.

A fração FrE foi capaz de sequestrar os radicais DPPH de forma


concentração dependente até a concentração de 5 mg/mL (Figura 12). Acima dessa
concentração a atividade se mostrou constante. Nas concentrações de 1, 2 e 5 mg/mL
(0,1, 0,2 e 0,5%) a capacidade sequestrante de radicais DPPH para FrE foi 31,38 ±
6,70, 57,37 ± 8,17 e 94,40 ± 1,94%, respectivamente. O valor de EC50 encontrado
para a fração foi de 1,79 mg/mL. Quando comparado ao BHT (controle positivo), a
capacidade antioxidante de FrE se mostrou superior a partir da concentração de 3
mg/mL, evidenciando o potencial antioxidante da matéria-prima em estudo.
73

Polissacarideos isolados do subproduto de Agave sisalana apresentaram


atividade antioxidante máxima, de 63,9%, na concentração de 8 mg/mL (0,8%)
(ZHANG; LIU; LIN, 2013) e 38,5% na concentração de 4 mg/mL (ZHANG; LIU; LIN,
2014). O maior potencial antioxidante obtido por FrE pode ser justificado pela
presença de compostos fenólicos em sua constituição química, compostos estes
fortemente associados à atividade antioxidante de diferentes extratos de plantas
(ZUGIC et al., 2014).

5.3.2 Avaliação da Capacidade Antioxidante Total


O resultado apresentado para a capacidade antioxidante total (CAT) mostrou
que a fração enriquecida em polissacarídeos (FrE) possui significante atividade
antioxidante. A FrE apresentou capacidade antioxidante total equivalente a 917,48
mg/g de ácido ascórbico. Fidelis e colaboradores (2014) reportaram uma atividade
antioxidante total de 75 mg/g de ácido ascórbico para polissacarídeos sulfatados
oriundos da espécie de alga Gracilaria birdiae. A presença de atividade antioxidante
indica que os constituintes da fração enriquecida em polissacarídeos de Agave
sisalana interagem com os sistemas que enviam elétrons para minimizar o ataque de
radicais (ZHANG et al., 2010).
A propriedade antioxidante apresentada pela amostra FrE demonstra o
potencial do subproduto de Agave sisalana como matéria-prima em formulações
cosméticas com finalidade hidratante e também na prevenção do envelhecimento
cutâneo.
Assim, após a caracterização da FrE e avaliação da segurança in vitro e in vivo,
de acordo com as metodologias propostas nesta pesquisa, a matéria-prima foi
utilizada para o desenvolvimento de formulações cosméticas para, então, demonstrar
a sua aplicabilidade como ingrediente em produtos.

5.4 DESENVOLVIMENTO DAS NANOEMULSÕES

5.4.1 Determinação do equilíbrio hidrófilo – lipófilo (EHL) requerido pela fase


oleosa
O conceito de EHL foi introduzido por Griffin (1949) para expressar
numericamente a relação existente entre as porções hidrofílica e lipofílica de
moléculas anfifílicas (tensoativos). De acordo com as propriedades físico-químicas de
74

um óleo específico ou mistura de óleos, um sistema de agentes tensoativos adequado


pode estabilizar de forma eficiente as gotículas de um sitema. A composição da
mistura é avaliada pelo seu equilibrio hidrófilico-lipófilico (AMARAL-MACHADO et al.,
2016). Dessa forma, cada emulsão possui um EHL próprio, dependente de sua fase
oleosa.
Para obtenção das nanoemulsões estudadas, foi utilizado um sistema
tensoativo composto pelo Polysorbate 80 (EHL=15) e o Sorbitan Monooleate
(EHL=4,3), considerados seguros e comumente empregados em formulações
cosméticas (RIBEIRO et al., 2015). Segundo Griffin (1949), a faixa de EHL entre 8 e
18 leva à formação de emulsões do tipo óleo em água (O/A). Assim, objetivando a
obtenção de nanoemulsões do tipo O/A, 8 formulações foram propostas e obtidas
variando o valor de EHL entre 8 e 15 com intervalos de 1,0.
Para o estudo do EHL, as formulações foram preparadas seguindo as
concentrações apresentadas por Silva e colaboradores (2016): 5% de fase oleosa,
5% de tensoativos e 90% fase aquosa. A constituição da fase oleosa permaneceu fixa
variando apenas a proporção dos tensoativos de forma que conseguissem alcançar o
valor de EHL requerido.

Tabela 6 – Avaliação macroscópica após 24 horas de preparo e teste de centrifugação


para determinação do EHL requerido.
EHL Avaliação macroscópica Centrifugação
8 IM NA
9 IM NA
10 LM LM
11 H LM
12 H LM
13 H LM
14 H H
15 IM NA
Onde:IM= intensamente modificadas; LM = levemente modificadas; H= homogênea, sem alterações;
NA= não se aplica..

As amostras foram observadas macroscopicamente após 24 horas do preparo


e submetidas à centrifugação. As características macroscópicas apresentadas após
75

24 horas para cada formulação, bem como os resultados após a centrifugação estão
apresentados na Tabela 6.
Após avaliação macroscópica e centrifugação, as amostras com valor de EHL
14 mantiveram-se estáveis, ou seja, sem sinais evidentes de instabilidade.. Sendo
assim, a amostra de EHL 14 foi definida como a correspondente ao EHL requerido.
Dessa forma, foram escolhidas as proporções de tensoativos hidrofílico e lipofílico o
que possibilitou a preparação das formulações do pseudodiagrama ternário

5.4.2 Pseudodiagrama ternário de fases


O delineamento do pseudodiagrama ternário de fases permite observar a
formação de diferentes sistemas a partir da obtenção de um amplo número de
amostras em diferentes proporções de óleo-tensoativo-água, onde cada vértice
corresponde a 100% de cada fase (LO et al., 1977). Essa metodologia de obtenção
de diferentes formulações é uma ferramenta útil no desenvolvimento de sistemas
dispersos, uma vez que é possível obter as formulações com melhor performance,
capazes de produzir diferentes sistemas, como géis, emulsões, microemulsões,
nanoemulsões, dentre outros (AMARAL-MACHADO et al., 2016).
Um ponto importante no desenvolvimento de nanoemulsões é a escolha dos
seus componentes. Um blend de emolientes foi selecionado pensando na
performance das formulções no tacante ao sensorial. A seleção dos tensoativos
Polysobarte 80 e Sorbitan Monooleate para serem utilizados nesta pesquisa, foi dada
devido aos resultados alcançados quando esses tensoativos foram utilizados em
combinação na obtenção de emulsões do tipo O/A em diferentes valores de EHL
(RIBEIRO et al., 2015; MAHDI et al., 2011; SILVA et al., 2016). Um dos fatores que
propiciam o tipo de emulsão (O/A ou A/O) é o sistema tensoativo utilizado no processo
de emulsificação, sendo que as concentrações de cada fase (aquosa e oleosa)
influenciam no processo de formação de nanoemulsões (RIBEIRO et al., 2015).
Nanoemulsões são sistemas translúcidos, transparentes ou leitosos, com
tamanho de gotícula entre 50 e 500nm, constituídas predominantemente de água e
consequentemente apresentando baixa viscosidade, obtidas em concentrações de
tensoativos numa faixa de 5 a 10% (GIANETI et al., 2012; IZQUIERDO et al., 2002;
MAHDI et al., 2011; JAFARI et al., 2006; TADROS et al., 2004). A Figura 13A
representa os diferentes sistemas obtidos no pseudodiagra ternário constituído de
Caprylic/CapricTriglyceride, Ethylhexyl Palmitate, Isostearyl Neopentanoate, como
76

fase oleosa; Polysorbate 80, Sorbitan Monooleate, sistema tensoativo e água


destilada (fase aquosa), enquanto que a Figura 13B apresenta o pseudodiagrama
obtido com a adição de 0,5% de fração enriquecida em polissacarídeos (FrE) na fase
aquosa.

Figura 13 - Pseudodriagrama ternário de fases para os sistemas constituídos de


Caprylic/CapricTriglyceride, Ethylhexyl Palmitate e Isostearyl Neopentanoate,
Polysorbate 80, Sorbitan Monooleate e água destilada, adicionados ou não de 0,5%
de fração enriquecida em polissacarídeos. SF
SLT
0 0
100 100 SLO
10 10 SVO
90 90 SLT
20 20
80 80 SVT
30 30
Fa

Fa
%)

%)
70 70
se

se
s(

s(
40 40
vo

vo
Ole

60 60

ole
50 50
ti

ti

o
oa

oa
o

sa
sa

50 50
ns

ns

60 60

(
(%

%)
Te

Te

40 40
)

70 70
30 30
80 80
20 20
90 90
10 10
100 100
0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
(A) (B)
Fase aquosa (%) Fase aquosa (%)

Onde: (A) = sistemas obtidos sem adição da fração enriquecida em polissacarídeos (veículo); (B) =
sistemas obtidos aditivados de 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos;●= Separação de fases
(SF); ●= Sistemas líquidos transparentes (SLT);●=Sistemas líquidos opacos (SLO); ●= Sistemas
viscosos opacos (SVO); ●=Sistema líquidostranslúcidos (SLTL);●= Sistemas viscosos transparentes
(SVT).

A adição da FrE á fase aquosa das formulações propiciou um novo sistema


antes não observado, o sistema líquido translúcido (SLTL). Além disso, a expansão
das áreas de SLT e SVO também foram observadas. Uma área de SLO numa região
contendo 10 a 20% de tensoativos e 10 a 40% de óleo foi obtida.
Os sistemas SLO obtidos apresentaram-se fluídos e em concentrações de
tensoativos entre 10 e 20% e de 10 a 40% de fase oleosa, sugerindo sistemas com
possíveis características de formulações nanoemulsionadas. Resultados semelhantes
foram obtidos por Silva e colaboradores (2016) quando obtiveram regiões de
emulsões com menores concentrações de tensoativos (Polyssorbate 80 e Sorbitan
Monooleate) e fase olesosa (Caprylic/CapricTriglyceride). Amaral - Machado e
colaboradores (2016) obtiveram sucesso em estudo similar para determinação da
77

melhor composição para sistemas nanoemulsionados utilizando pseudodiagrama de


fases. Esses autores obtiveram nanoemulsão estável em concentração oleosa de
12% (óleo de rã-touro), 8% de tensoativos (Sorbitan Laurate e Polyssorbate 80) e 80%
de água.

Tabela 7 – Composição das formulações selecionadas para os testes de estabilidade


preliminar (% p/p).
Composição 15 21 28 36 15AF 21AF 28AF 36AF

Caprylic/CapricTriglyceride 16,0 12,0 8,0 4,0 16,0 12,0 8,0 4,0

Ethylhexyl Palmitate 16,0 12,0 8,0 4,0 16,0 12,0 8,0 4,0

Isostearyl Neopentanoate 8,0 6,0 4,0 2,0 8,0 6,0 4,0 2,0

Phenoxyetanol (and)
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Caprylic glicol

BHT 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Sorbitan Monooleate 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9

Polyssorbate 80 9,1 9,1 9,1 9,1 9,1 9,1 9,1 9,1

Dissodium EDTA 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

Fração enriquecida (FrE) - - - - 0,5 0,5 0,5 0,5

Distilled Water 48,8 58,8 68,8 78,8 48,3 58,3 68,3 78,3

Onde: AF = formulações aditivadas com fração enriquecida em polissacarídeos.

Diante disto, pretendendo a obtenção de nanoemulsões adequadas para uso


tópico, as formulações localizadas nos pontos 15, 21, 28 e 36, classificadas em
comum nos diferentes diagramas obtidos como SLO, contendo 10% de tensoativos
(menor concentração estudada), foram selecionadas para dar continuidade a estudos
posteriores. A composição das formulações localizadas nos pontos 15, 21, 28 e 36 de
ambos os diagramas, estão descritas na Tabela 7. Tendo em vista a idêntica
localização das formulações avaliadas, as formulações aditivadas de FrE serão, a
partir de agora, denominadas pela numeração pontual do diagrama acrescido da sigla
AF.
.
78

5.5 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE

Anteriormente aos testes de estabilidade preliminar, as formulações obtidas


a partir dos diagramas foram manipuladas em três lotes e submetidas à centrifugação
e análises macroscópicas após 24 horas. (Tabela 8). As formulações que se
mantiveram estáveis após a centrifugação foram avaliadas quanto ao tamanho de
gotícula e índice de polidispersividade.

Tabela 8 – Avaliação macroscópica das formulações 24 horas após o preparo e teste


de centrifugação.
Localização no Avaliação macroscópica após
Centrifugação
pseudodiagrama 24 horas de preparo
15 H H
21 H H
28 LM M
36 H H
15AF H H
21AF H H
28AF H H
36AF H H
Onde: M = modificada; LM = levemente modificadas; H= homogênea, sem alterações.

As formulações 15, 21, 28 e 36 apresentaram-se fluidas, com coloração


branca e odor característico. A adição de FrE promoveu alteração na coloração das
formulações de branca para amarelo-clara, mantendo-se fluidas e com odor
característico.
O teste de centrifugação foi realizado a fim de se obter informações rápidas
quanto a possíveis processos de instabilidade (RIBEIRO et al., 2015). Com exceção
da formulação 28, as demais amostras mantiveram suas características iniciais, não
sendo observados modificações ou processos de instabilidade.
Os valores de tamanho de gotícula e polidispersividade caracterizam a
formulação quanto à distribuição do tamanho de gotícula e sua homogeneidade,
menor tamanho de gotícula e uma distribuição homogênea podem indicar uma maior
estabilidade contra fenômenos de instabilidade, como por exemplo as pontes de
Ostwald (KLANG et al., 2012; TANG et al., 2011). Assim, as determinações do
79

tamanho de gotícula e os valores de polidispersividade foram utilizados como


parâmetros avaliativos e estão demonstrados na Tabela 9.

Tabela 9– Valores de tamanho de gotícula e polidispersividade, expressos em média


e desvio padrão para as formulações selecionadas.

Localização Pontual Tamanho de gotícula (d.nm) Polidispersividade

15 177,8 ± 0,11 0,11 ± 0,01

21 182,7 ± 1,81 0,17 ± 0,01

28 NA NA

36 89,0 ± 2,81 0,19 ± 0,01

15AF 157,0 ± 0,72* 0,07 ± 0,01

21AF 126,8 ± 2,5* 0,13 ± 0,02

28AF 114,0 ± 0,78* 0,17 ± 0,01

36AF 79,15 ± 0,53* 0,22 ± 0,01

Onde: AF = formulações aditivadas com fração enriquecida em polissacarídeos; NA= não avaliada;
* = p < 0.05 comparado aos valores de tamanho de gotícula apresentados por suas correspondentes
formulações base (veículo).

Zhongchen, Xuefeng e Xiao-Bin (2016) avaliaram a influência do conteúdo


oleoso no tamanho de gotícula e constataram a relação inversa entre o conteúdo
oleoso e o tamanho de gotícula. Nossos resultados corroboram com o observado
pelos autores, tendo em vista que os maiores tamanhos de gotícula foram observados
para as formulações contendo 40% de fase oleosa (15 e 15AF), quando comparadas
às formulações contendo 10% de conteúdo oleoso (36 e 36AF).
Uma redução no tamanho de gotícula foi observada quando adicionadas de
FrE (p<0,05). De acordo com Kabri e colaboradores (2011), menores tamanhos de
gotícula favorecem a estabilidade das nanoemulsões na medida em que promovem
uma redução na força gravitacional o que torna o movimento browniano capaz de
superá-la. Dessa forma, podemos sugerir que a adição da fração enriquecida em
polissacarídeos proporcionou a obtenção de formulações com maior estabilidade.
80

5.5.1 Estabilidade preliminar


Os testes avaliativos preliminares da estabilidade fornecem indicações
preditivas quanto ao comportamento de um novo produto frente a condições
ambientais a que possa vir a ser submetido (BRASIL, 2005).

5.5.1.1 Estudo da adequação de localização do sistema tensoativo e avaliação da


estabilidade preliminar das formulações
Nanoemulsões são comumente obtidas utilizando misturas de tensoativos de
forma separada, onde os tensoativos são dispersos conforme as suas características
intrínsecas, ou seja, tensoativos com características hidrofílicas, como por exemplo o
Polyssorbate 80, são dispersos em meio aquoso, enquanto que tensoativos com
características lipofílicas são dispersos em meio lipofílico (RIBEIRO et al., 2015;
SILVA et al., 2016). No entanto, alguns estudos demonstram que as misturas de
agentes tensoativos, em uma única fase, apresentam melhor desempenho do que
quando isolados em fases distintas, dispersando e solubizando mais facilmente na
fase contínua da emulsão, sendo possível utilizar menor concentração do agente
tensoativo e produzir emulsões estáveis a longo prazo (PENG et al., 2010; ROCHA-
FILHO et al., 2014).
Fundamentados nos trabalhos citados a cima, as namoemulsões foram
avaliadas quanto a sua estabilidade preliminar contendo o sistema tensoativo: a)
adicionado a fase aquosa; b) na fase oleosa e, c) o Polyssorbate 80 na fase aquosa e
o Sorbitan Monooleate na oleosa.
As amostras estão denominadas de acordo com a metodologia utilizada, onde
aquelas formulações obtidas com os tensoativos separados foram, juntamente ao
número que indica a localização no diagrama ternário, acrescidas da sigla TS.
Formulações obtidas com os tensoativos juntos na fase oleosa foram denominadas
de TFO enquanto a sigla TFA foi utilizada para designar aquelas obtidas com a mistura
de tensoativos na fase aquosa da nanoemulsão.
81

Tabela 10 – Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar para as amostras obtidas com tensoativos isolados (TS).
Tamanho Potencial zeta
pH PDI
(d.nm) (mV)
Formulação
Pós estufa Pós estufa Pós estufa Pós estufa
Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0)
(t5) (t5) (t5) (t5)

15_TS 5,01± 0,05 5,17± 0,06 155,80 ± 3,99 158,60± 3,33 0,09± 0,02 0,07± 0,00 * -20,41± 2,58 -16,01± 0,43

21_TS 4,88± 0,32 5,24± 0,11 130,0 ± 1,99 134,0± 1,92 * 0,12± 0,02 0,09± 0,01 -17,33± 1,51 -14,23± 1,13*

28_TS SF SF SF SF SF SF SF SF

36_TS 5,21± 0,04 5,33± 0,06 * 84,69± 1,64 160,01± 15,81* 0,24± 0,00 0,05± 0,03 * -13,57± 1,30 -12,70± 0,75

15AF_TS 4,47± 0,09 4,48± 0,01 155,0± 1,29 158,4± 2,91 0,10± 0,01 0,09± 0,01 -17,67± 0,40 -12,27± 1,88

21AF_TS 4,43± 0,02 SF 124,3± 4,50 SF 0,12± 0,01 SF -14,67± 1,24 SF

28AF_TS 4,42± 0,02 4,45± 0,03 113,5± 1,24 133,2± 7,30 * 0,17± 0,00 0,09± 0,01* -13,02± 1,8 -11,30± 0,44

36AF_TS 4,42± 0,02 4,44± 0,01 83,57 ± 2,35 188,07± 7,30 * 0,23± 0,00 0,05± 0,00 * -10,64± 1,73 -10,67± 0,67

Onde:* = p < 0.05 comparado aos valores iniciais; SF = separação de fases.


82

Tabela 11 – Resultados obtidos para os testes de estabilidade preliminar para as amostras obtidas com tensoativos adicionados na
fase oleosa (TFO).
Tamanho Potencial zeta
pH PDI
(d.nm) (mV)
Formulação
Pós Pós Pós Pós
Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0) Inicial (t0)
estufa (t5) estufa (t5) estufa(t5) estufa(t5)

15_TFO 5,30 ± 0,37 SF 153,37 ± 2,43 SF 0,10 ± 0,01 SF -15,08 ± 1,20 SF

21_TFO 5,31 ± 0,12 SF 130,89 ± 3,54 SF 0,12 ± 0,01 SF -12,21 ± 1,55 SF

28_TFO 5,19 ± 0,05 5,11 ± 0,15 111,74 ± 3,14 113,34 ± 6,16 0,16 ± 0,00 0,10 ± 0,01 -12,52 ± 1,38 -12,69 ± 0,77

36_TFO 5,29 ± 0,04 5,30 ± 0,09 95,97 ± 17,98 144,29 ± 6,14* 0,23 ± 0,01 0,07 ± 0,02* -13,88 ± 1,35 -12,56 ± 1,88

15AF_TFO 4,46 ± 0,03 SF 152,07 ± 1,40 SF 0,09 ± 0,02 SF -13,97 ± 1,15 SF

21AF_TFO SF SF SF SF SF SF SF SF

28AF_TFO SF SF SF SF SF SF SF SF

36AF_TFO 4,49 ± 0,03 4,46 ± 0,06 85,49 ± 1,29 169,98 ± 8,88* 0,24 ± 0,01 0,05 ± 0,02* -18,07 ± 6,32 -11,01 ± 1,89

Onde: * = p < 0.05 comparado aos valores iniciais; SF = separação de fases.


83

Os resultados obtidos para a estabilidade preliminar, após 24 horas da


manipulação (t0) e cinco dias após armazenagem em temperatura de 45°C (t5) dos
sistemas estão apresentados nas tabelas 10 e 11, respectivamente.
Contrariamente ao descrito por Peng e colaboradores (2010) e Rocha-Filho et
al. (2014), as formulações contendo a mistura de tensoativos na fase aquosa (fase
contínua) foram instáveis, apresentando cremagem ou separação de fases 24 horas
após a obtenção. Os resultados para as formulações obtidas com a mistura de
tensoativos na fase oleosa (TFO) não apresentaram benefícios significativos que
justificassem a sua utilização como melhor forma de obtenção.

5.5.1.1.1 Determinação do valor de pH


A determinação dos valores de pH é de grande importância em formulações
tópicas, uma vez que essas devem apresentar valores de pH compatíveis com os da
pele 4,5 - 6,0 (RIBEIRO et al., 2015). As formulações apresentaram-se levemente
ácidas e não foram observadas alterações nos valores de pH após o armazenamento
em 45°C ± 2°C, indicando que não houveram modificações nos componentes das
formulações capazes de alterar os valores destes, exceto para a formulação 36, onde
foi observado aumento nos valores de pH (p>0,05).

5.5.1.1.2 Determinação do tamanho de gotícula e polidispersividade


Inicialmente, todas as amostras apresentaram diâmetro médio máximo de 155
nm. Apenas as formulações 15_TS e 15AF_TS, não apresentaram aumento
significativo (p>0,05) no tamanho de gotícula. Além disso, após 5 dias em estufa, as
formulações 36_TS e 36AF_TS apresentaram redução significativa (p>0,05) nos
valores de polidispersividade .
Menores tamanhos de gotícula representam maior estabilidade para
nanoemulsões frente a fenômenos de instabilidade, tendo em vista que pequenas
gotículas reduzem a força gravitacional tornando o movimento browniano capaz de
superá-la (KABRI et al., 2011; McCLEMENTS; RAO, 2011). No entanto, a formação
de pontes de Ostwald é o principal fenômeno de instabilidade observado em
nanoemulsões (YUKUYAMA et al., 2016).
Pontes de Ostwald alteram a estabilidade dos sistemas favorecendo a difusão
de pequenas gotículas em gotículas maiores e dessa forma alterando a estabilidade
a longo prazo (McCLEMENTS; RAO, 2011; YUKUYAMA et al., 2016). Assim, o
84

aumento significativo do tamanho de gotícula aliado a uma expressiva redução dos


valores de PDI podem sugerir a instabilidade das formulações 36_TS e 36AF_TS.
Gupta e colaboradores (2016) relataram que a solubilidade da fase dispersa
na fase contínua é um fator crítico para a formação de pontes de Ostwald. Wooster et
al. (2008), avaliaram a influência da composição oleosa na formação de pontes de
Ostwald e relacionou que a insolubilidade dos óleos proporciona uma barreira cinética
capaz de impedir o surgimento desse fenomeno de instabilidade em nanoemulsões e
sugeriram proporções de pelo menos 50% de óleos insolúveis na fase contínua.
McClements e Rao (2011) observaram resultados semelhantes e relataram que a
adição de 10% de óleos insolúveis em suas formulações foi suficiente para manter a
estabilidade das nanoemulsões. As formulações desenvolvidas apresentam em sua
fase oleosa o Caprylic/CapricTriglyceride (Triglicerídeo de cadeia média), Ethylhexyl
Palmitate (éster de cadeia ramificada) e o Isostearyl Neopentanoate(éster de cadeia
longa) na proporção de 1:1:0,5 (p/p/p). Fundamentados nas literaturas citadas acima,
pode-se inferir que se a concentração de óleo de cadeia longa na fase oleosa das
formulações 36_TS e 36AF_TS fosse mais elevada, o processo de instabilidade
poderia ter sido minimizado e possivelmente o sistema seria estável.

5.5.1.1.3 Determinação do potencial zeta


O potencial zeta é um parâmetro amplamente utilizado na avaliação da
estabilidade de nanoemulsões (MAHADI et al., 2011; RIBEIRO et al., 2015; TICHOTA
et al., 2014). Tal parâmetro indica a força de repulsão entre as gotículas adjacentes
de mesma carga, e dessa forma demonstram o importante papel da camada
superficial das gotículas no processo de estabilização. Altos valores de potencial zeta
(>ǀ30ǀ mV) indicam a resistência à agregação das partículas, consequentemente maior
estabilidade (BALI; ALI; ALI, 2010). No entanto, além da estabilização eletrostática, a
adição de estabilizadores não iônicos aos sistemas coloidais promove uma
estabilização estérica alcançada pelo efeito de solvatação (WU; ZHANG;
WATANABE, 2011).
As formulações apresentaram valores de potencial zeta negativos e menores
que ǀ30ǀmV, inferiores ao recomendado pela literatura. No entanto, após o
armazenamento em 45°C, apenas a formulação 21_TS apresentou redução
significativa (p<0,05). Os menores valores de potencial zeta não representa um
indicativo de instabilidade, pois neste caso, a estabilização do sistema pode ser
85

relacionada ao mecanismo de estabilização estérica (WU; ZHANG; WATANABE,


2011).
Diante da análise geral dos parâmetros após estocagem das formulações em
temperatura de 45°C± 2°C, as formulações 15_TS e 15AF_TS foram selecionadas
para continuidade dos estudos de estabilidade, pois não apresentaram alterações
significativas (p<0,05) nos parâmetros estudados sendo, portanto, consideradas
preliminarmente estáveis.

5.5.2 Estabilidade Acelerada


Durante o período de avaliação da estabilidade acelerada, não foram
observadas alterações nos valores de tamanho de gotícula nas temperaturas de 4°C
e 25°C, para ambas formulações, no entanto, a formulação 15AF_TS apresentou
aumento significativo no tamanho de gotícula (p< 0,05) na temperatura de 45°C. Os
resultados obtidos para avaliação do tamanho de gotícula estão representados na
Figura 14.

Figura 14 - Distribuição do tamanho de gotícula das amostras 15_TS e 15AF_TS após


diferentes condições de temperatura (4°C, 25°C e 45°C) em função do tempo (30, 60
e 90 dias).

4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C


250 250
*
Tamanho de gotícula (d.nm)

Tamanho de gotícula (d.nm)

200 200 *

150 150

100 100

50 50

0 0
0 30 60 90 0 30 60 90
(A) (B)
Tempo (dias) Tempo (dias)

Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS. (*) = p < 0.05 comparado aos valores iniciais.

O aumento no tamanho de gotícula pode favorecer o surgimento de fenômenos


de instabilidade podendo levar a separação de fases (SABERI; FANG;
86

MCCLEMENTS, 2013). Silva e colaboradores (2016) utilizando os mesmos pares de


tensoativos, observaram um aumento significativo no tamanho de gotícula na
temperatura de 45°C, e essas apresentaram separação de fases no 15º dia.
Semelhante ao observado em nossos estudos, alterações no tamanho de
gotícula em nanoemulsões provocadas pela exposição a temperaturas mais elevadas
foi observada por Luo e colaboradores (2017). Esses autores obtiveram
nanoemulsões estáveis com alterações no tamanho de gotícula quando armazenadas
em temperaturas de 55°C, por um período de 14 dias, sendo observada uma pequena
agregação de gotículas, o que não foi observado para as amostras armazenadas a
4°C e 25°C.
Carpenter e Saharan (2017) utilizando a mesma metodologia de obtenção
(ultrassonicação) e o mesmo par de tensoativos, observaram um aumento
proporcional no tamanho de gotícula de nanoemulsões quando expostas às
temperaturas de 40°C, 60°C e 80°C, por 90 dias. Resultados esses não observados
com o aumento do tempo e sonicação das amostras de 15 para 30 minutos. Esses
resultados podem indicar que o aumento no tempo de sonicação das nossas amostras
poderia vir a inibir as alterações provocadas pelo exposição de nanoemulsões a
temperaturas mais elevadas.
Em contrapartida, Ribeiro e colaboradores (2015) observaram redução
significativa no tamanho de gotícula nessa temperatura quando as suas formulações
foram submetidas a temperatura de 45°C por um período de 60 dias. Esses autores
consideraram as nanoemulsões estáveis por não apresentarem macroscopicamente
alterações quando comparadas às suas características iniciais. Alterações no
tamanho de gotícula podem ser associadas à sensibilidade dos tensoativos não
iônicos a temperatura (KAMAIKO; McCLEMENTS, 2014).
Durante o tempo de armazenamento, não houve evidência macroscópica de
fenômenos de instabilidade como cremagem, coalescência ou floculação, o que pode
ser atribuído ao tamanho de gotícula permanecerem na escala manométrica durante
o período de avaliação. A distribuição de tamanho de gotícula foi do tipo monomodal
com ocorrência de apenas um pico de alta intensidade avaliado por espalhamento de
luz (Dynamic Light Scattering – DLS) (Figura 15). Esse resultado confirma a eficiência
do método de ultrassonicação na obtenção de nanoemulsões estáveis.
87

Figura 15 – Distribuição de tamanho de gotícula (intensidade vs diâmetro de gotícula)


obtida por Dynamic Light Scattering.

25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 (24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)

Intensidade (percentual)
20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 4°C 15 4°C

10 10

5 5
(A) (B)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)
25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 ( 24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)

Intensidade (percentual)

20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 25°C 15 25°C

10 10

5 5
(C) (D)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)
25 25
0 ( 24 horas após obtenção) 0 ( 24 horas após obtenção)
30 dias 30 dias
Intensidade (percentual)

Intensidade (percentual)

20 60 dias 20 60 dias
90 dias 15_TS 90 dias 15AF_TS
15 45°C 15 45°C

10 10

5 5

(E) (F)
0 0
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
Tamanho (d.nm) Tamanho (d.nm)

Onde:(A)= formulação 15_TS para a temperatura de 4°C; (B) = formulação 15AF_TS para a
temperatura de 4°C; (C) = formulação 15_TS para a temperatura de 25°C; (D) = formulação 15AF_TS
para a temperatura de 25°C; (E) = formulação 15_TS para a temperatura de 45°C; (F) = formulação
15AF_TS para a temperatura de 45°C.
88

Apesar do aumento significativo no tamanho de gotícula na temperatura de


45°C, os valores de PDI não foram alterados significativamente, permanecendo por
volta de 0,1 (Figura 16). Alterações no tamanho de gotícula sem mudanças
significativas nos valores de polidispersividade foram observados por Ribeiro e
colaboradores (2015). Esses autores, consideraram as nanoemulsões estáveis por
não apresentarem alterações macroscópicas.

Figura 16 – Valores de polidispersividade (PDI) obtidos para as formulações 15_TS e


15AF_TS após diferentes condições de temperatura (4°C, 25°C e 45°C) em função do
tempo (30, 60 e 90 dias).

0,30 0,30
4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C
0,25 0,25

0,20 0,20
PDI

PDI

0,15 0,15

0,10 0,10

0,05 0,05

0,00 0,00
0 30 60 90
(A) 0 30 60 90
(B)
Tempo (dias) Tempo ( dias)

Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS.

Os resultados obtidos para o potencial zeta demonstraram que a diferença de


potencial nas formulações adicionadas do FrE sofreu um decréscimo quando
comparada às formulações sem a adição da fração FrE e ambas apresentaram
valores negativos (Figura 17).
89

Figura 17 - Valores de potencial zeta obtidos para as formulações 15_TS e 15AF_TS


após diferentes condições de temperatura (4°C, 25°C e 45°C) em função do tempo
(30, 60 e 90 dias).

20 20
4°C 25°C 45°C 4°C 25°C 45°C

10 10
Potencial Zeta (mV)

Potencial Zeta (mV)


0 0

-10 -10

-20 -20

-30 -30
0 30 60 90 0 30 60 90
(A) (B)
Tempo (dias) Tempo (dias)

Onde: (A) = Resultados obtidos para a formulação 15_TS; (B) = Resultados obtidos para a formulação
15AF_TS.

O valor de potencial zeta para a formulação veículo (15_TS) inicialmente foi de


-23,03 ± 1,94, enquanto que para a formulação 15AF_TS esses valores foram de -
15,77 ± 2,20. Mahdi e colaboradores (2011) encontraram valores negativos de
potencial zeta e relacionaram esta característica à adsorção de íons hidroxila a partir
das cadeias de polioxietileno presentes nos tensoativos utilizados (Polysorbate 80 e
Sorbitan Monooleate). Após noventa dias de acondicionamento nas temperaturas de
4°C, 25°C e 45°C nenhuma das formulações apresentou alterações nos valores de
potencial zeta, indicando uma boa estabilidade para as nanoemulsões. Quando o
potencial zeta é relativamente alto, as forças repulsivas excedem as forças atrativas
de Van der Walls, dessa forma, evitando agregação e melhorando a estabilidade dos
sistemas. Em adição, estabilizadores não iônicos conferem a estabilização estérica,
alcançada pelo efeito de solvatação (WU; ZHANG; WATANABE, 2011).
Diante dos resultados expostos pode-se considerar que tanto a formulação
15_TS, veículo, como a 15AF_TS, formulação aditivada com a fração enriquecida em
polissacarídeos, são estáveis, consistindo então, em um produto cosmético
nanoemulsionado.
A primeira etapa desta pesquisa consistiu na obtenção da matéria-prima
provinda do subproduto de A. sisalana. Após essa obtenção e comprovação da sua
90

segurança, seguiu-se para realizar o desenvolvimento do produto, ou seja, avaliar se


realmente essa matéria-prima poderia ser incorporada em um produto cosmético.
Nesta etapa, foi possível obter uma nanoemulsão estável contendo a fração FrE,
consagrando a possibilidade da obtenção de um produto cosmético, dito
tecnicamente, “produto acabado”. No entanto, um produto cosmético desenvolvido por
pesquisa sem o mesmo apresentar eficácia, não apresenta nenhuma viabilidade
comercial, tornando essa pesquisa apenas científica sem o cunho de aplicabilidade
comercial. Dessa forma as nanoemulsões estáveis, aditivadas ou não com a matéria-
prima desenvolvida, foram submetidas aos testes clínicos para avaliar a eficácia
hidratante, face à composição química da fração obtida do resíduo industrial de A.
sisalana.

5.6 AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA CLÍNICA HIDRATANTE

Os avanços científicos e tecnológicos no desenvolvimento de ferramentas de


investigação em torno das funções biológicas da pele mudaram a compreensão a
respeito dos efeitos provocados pelos produtos cosméticos, facilitando a interpretação
de resultados obtidos em condições reais de uso. Os métodos de bioengenharia
possibilitam investigar as diferentes respostas da pele aos múltiplos estímulos
provocados, incluindo a hidratação da camada superficial da pele e seu efeito barreira
(BYRNE, 2010; DRENO et al., 2014).
A avaliação da resposta da pele, quanto ao conteúdo hídrico do estrato córneo,
foi avaliada por meio do equipamento Corneometer® fundamentado nas alterações na
capacitância da pele ocasionada pelo aumento no seu conteúdo aquoso.De forma
complementar, a perda de água transepidermal, consequente à função de barreira da
pele foi avaliada por meio do evaporímetro de câmera aberta Tewameter ®, dessa
maneira dispondo da estimativa do gradiente de vapor de água da pele lançado ao
ambiente (BYRNE, 2010).
As condições da pele foram investigadas após única aplicação das
nanoemulsões estudas juntamente com a investigação de uma área sem a aplicação
de formulações (controle negativo), eliminando quaisquer possibilidades de
sobreposição de resultados e, assim, garantindo a eficácia exclusiva das
nanoemulsões desenvolvidas. Em adição, um produto nanotecnológico (164 nm) já
disponível no mercado foi utilizado como comparativo da atividade das nanoemulsões,
91

bem como das condições de uso dos equipamentos, aumentando a robustez dos
resultados obtidos.
A Figura 18 apresenta os resultados obtidos quanto ao conteúdo hídrico do
estrato córneo. Inicialmente, os voluntários apresentaram valores de hidratação
inferiores a 40 Unidades arbitrárias (UA), o que, segundo a escala preconizada
descrita no manual do equipamento, equivale a uma condição de pele seca
(COURAGE KHAZAKA, 2014).

Figura 18 – Valores do conteúdo hídrico do estrato córneo (Unidades Arbitrárias)


antes (basal) e 1, 2, 3, 4 e 5 horas após única aplicação das formulações em estudo.
Os resultados estão representados em valores médios ± Erro padrão da média.

70
A1 A2 A3 A4
abc abc abc abc abc
60
ab ab ab
ab a
a
(Unidades arbitrárias)

50 a
Hidratação do EC

40

30

20

10

0
BASAL 1 2 3 4 5
Tempo ( horas)

Onde: a = p-valor < 0,05 para ANOVA + Tukey vs controle negativo; b= p-valor < 0,05 para ANOVA +
Tukey vs veículo; c = p-valor < 0.05 para ANOVA + Tukey vs controle positivo; A1 – Controle negativo;
A2 – veículo; A3- formulação contendo 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos, oriunda do
resíduo industrial de Agave sisalana; A4 -Controle positivo (hidratante comercial).

Quando comparado ao controle negativo (A1), o veículo (A2) aumentou


significativamente (p<0,05) o conteúdo aquoso do estrato córneo e esse efeito
perdurou até a quarta hora do estudo. No entanto, a nanoemulsão contendo 0,5% da
92

fração enriquecida em polissacarídeos (A3) alcançou maior hidratação da pele a partir


da primeira hora e esse efeito foi mantido durante todo o período de estudo (5 horas).
Vale destacar que, a partir da segunda hora, os valores de hidratação alcançados pela
nanoemulsão contendo a fração oriunda do resíduo de Agave sisalana (FrE) foi
significativamente maior (p<0,05) que o veículo, evidenciando que a capacidade de
hidratação é da fração FrE e não dos componentes do veículo da formulação.
A capacidade hidratante da fração enriquecida em polissacarídeos pode ser
relacionada aos compostos presentes em sua constituição química, como
polissacarídeos e proteínas, compostos esses com atividade hidratante já relatada.
Futrakul, Kanlayavattanakul e Krisdaphong (2010) avaliaram a capacidade hidratante
de um gel de polissacarídeos obtidos de Durio zebethinus Murr e demonstraram a
capacidade desses constituintes em promover o aumento do conteúdo hídrico do
estrato córneo. Polissacarídeos obtidos biotecnologicamente de Klebsiella
pneumoniae e polissacarídeos obtidos do extrato de Myrtus communis promoveram
aumento da hidratação da pele (CAMARGO JUNIOR; GASPAR; MAIA CAMPOS,
2012). Segundo Dal’belo, Gaspar e Maia Campos (2006) a associação de
polissacarídeos e aminoácidos (histidina, arginina, treonina, serina, glicina e alanina)
foi capaz de promover o aumento da hidratação da pele.
A Figura 19 demonstra os valores de perda de água transepidermal obtidos
para as áreas tratadas (A2, A3 e A4) e área não tratada (A1) comparando os valores
obtidos aos seus valores basais.
93

Figura 19 – Valores da perda de água transepidermal (g/m2.h) antes (basal) e 1, 2, 3,


4 e 5 horas após única aplicação das formulações em estudo. Os resultados estão
representados em valores médios ± Erro padrão da média.

16
Basal t1 t2 t3 t4 t5

14

12

10
g/m2/h

0
A1 A2 A3 A4
Área tratada

Onde: A1 – Controle negativo; A2 – veículo; A3- formulação contendo 0,5% da fração enriquecida em
polissacarídeos, oriunda do resíduo industrial de Agave sisalana; A4 -Controle positivo (hidratante
comercial); t1 – Após 1 hora; t2 – Após 2 horas; t3 – Após 3 horas; t4 – Após 4horas; t5 – Após 5 horas.

Não foram observadas alterações estatisticamente significativas na perda de


água transepidermal. Resultados semelhantes foram observados por Ribeiro e
colaboradores (2015) onde nanoemulsões contendo extrato hidroglicólico de Opuntia
ficus-indica promoveram o aumento do conteúdo de água na camada superficial da
pele e mantiveram a condição de barreira da pele sem alterações. Segundo Dal’belo,
Gaspar e Maia Campos (2006), a capacidade de elevar os níveis de água na camada
superficial da pele aliada a não modificação nos valores de perda de água podem
estar relacionadas à capacidade higroscópica dos mono e polissacarídeos presentes
nos extratos. A característica higroscópica desses compostos aliada à maior
94

capacidade de permeação obtida pelas nanoemulsões podem favorecer a permeação


dos ativos pela camada córnea e a retenção de água pela sua extensão (DAL’BELO;
GASPAR; MAIA CAMPOS, 2006; LU et al., 2014). No entanto, deve ser observado
que o tipo de veículo pode influenciar no mecanismo de ação pelo qual os ativos
hidratantes podem atuar (DAMASCENO et al., 2016).
Segundo Lóden (2012) a redução da perda de água transepidermal é
dependente da quantidade de conteúdo lipídico presente nas formulações. Dessa
forma, o conteúdo predominantemente aquoso das nanoemulsões pode justificar a
não formação de filme capaz de reduzir a perda de água da pele. Por outro lado, o
aumento do conteúdo hídrico ocasionado por ativos umectantes que promovam a
retenção de água no estrato córneo pode favorecer o aumento na perda de água
transepidermal (DRAELOS, 2000; RIBEIRO et al., 2015).
Os resultados apresentados neste trabalho demonstram o potencial do
subproduto de Agave sisalana como fonte de ingredientes ativos para produtos
cosméticos com diferentes aplicações como hidratação e pela atividade antioxidante
apresentada pela matéria-prima, possivelmente para prevenção do envelhecimento
cutâneo, no entanto para comprovação dessa última atividade outros testes de
eficácia necessitam ser conduzidos.
Finalmente, por meio desse trabalho, é possível configurar que a FrE, uma
matéria-prima obtida a partir de resíduos da indústria de sisal, pode ser considerada
uma nova matéria-prima para indústria cosmética com comprovação inédita da sua
eficácia hidratante. Este trabalho contribui sobremaneira, agregando valores à cadeia
produtiva de Agave sisalana, propondo outros usos para o resíduo que pode causar
impacto ambiental, além da contribuição socioeconômica, especialmente para a
agricultura familiar, que tem suas rendas pautadas na plantação e produção do sisal.
95

6 CONCLUSÕES

Nas condições experimentais padronizadas nessa pesquisa, foi possível


concluir que:

A partir do resíduo industrial de Agave sisalana foram obtidos: o extrato bruto


que após precipitação com etanol gerou uma fração sobrenadante (FrE) e um
precipitado (FrP).
O extrato bruto e as duas frações apresentaram açúcares, polifenois e
proteínas, sendo a fração resultante do sobrenadante a que apresentou maior
concentração de açúcares totais (65,49% ± 0,51).
Testes de segurança in vitro demonstraram que a fração enriquecida em
polissacarídeos (FrE) é segura, não apresentando citotoxicidade ou fototoxicidade,
enquanto que o extrato bruto apresentou citotoxicidade.
A avaliação in vivo da compatibilidade cutânea demonstrou que a fração
enriquecida em polissacarídeos não é irritante para uso tópico, obtendo-se assim, uma
nova matéria-prima para uso cosmético a partir do resíduo de Agave sisalana.
O potencial antioxidante da fração foi demonstrado pela capacidade de
sequestro de radicais DPPH com uma concentração efetiva de 50% equivalente a
1,79mg/mL e uma capacidade antioxidante total de 917,48 equivalente grama de
ácido ascórbico, indicando um potencial uso em cosméticos como ativo antioxidante.
Nanoemulsões constituídas de 40% de fase oleosa, 50% de fase aquosa e 10%
de tensoativos adicionados em fases separadas, aditivada ou não com 0,5% da fração
enriquecida em polissacarídeos do resíduo de Agave sisalana, foram obtidas a partir
do pseudodiagrama e avaliadas como estáveis por um período de 90 dias em
diferentes temperaturas.
Como a nanoemulsão contendo 0,5% da fração enriquecida em
polissacarídeos foi diferente significativamente do veículo nos testes clínicos, pode-se
concluir que a atividade hidratante é atribuída à fração estudada.
A nanoemulsão contendo 0,5% da fração enriquecida em polissacarídeos
promoveu o aumento no conteúdo hídrico do estrato córneo e manteve a função de
barreira da pele após 5h de uma única aplicação, podendo assim ser considerado um
produto cosmético hidratante.
96

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Esta pesquisa contribuiu tanto com a área cosmética como ambiental,


apresentando uma nova matéria-prima para indústria cosmética, a partir de um
produto de descarte do subproduto do sisal, o que pode contribuir em um futuro
próximo com o desenvolvimento ecológico, diminuição do impacto ambiental e
socioeconômico das regiões que cultivam a Agave sisalana. Esta pesquisa também
possibilitou demonstrar a aplicabilidade dessa matéria-prima em um produto
cosmético, produto este, que seguiu a tendência da área de cosmetologia, no que
tange aos aspectos nanotecnológicos. Por fim, e para consagrar o caráter inovador e
inédito do projeto desenvolvido, foi demonstrada a eficácia in vitro antioxidante e in
vivo hidratante, contemplando assim, grande parte da cadeia produtiva de um produto
cosmético e também agregando valor à cadeia produtiva de Agave sisalana.
Em adição, este trabalho também contribuiu para formação de recursos
humanos especializados na área cosmética, incluindo alunos de iniciação científica
com trabalho apresentado e premiado como primeiro lugar na categoria Engenharias
e Meio Ambiente no Congresso de Iniciação Científica da UFRN. Finalmente, essa
pesquisa resultou em produção científica aprovada em congressos internacionais,
inclusive com apresentação oral, e em um conteúdo científico que culminará com a
publicação de dois artigos científicos em periódicos indexados internacionalmente.
Ainda, a abordagem ambiental trazida neste trabalho cria novas perspectivas
para utilização de resíduos de descarte industriais como matérias-primas úteis e
comerciáveis, inclusive para futuros projetos utilizando o resíduo de Agave sisalana
com foco na eficácia fotoprotetora e antienvelhecimento.
97

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ANEXO A

PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP

DADOS DO PROJETO DE PESQUISA

Título da Pesquisa: Avaliação in vivo da eficácia de formulações cosméticas aditivadas com extratos
vegetais por meio de técnicas de bioengenharia cutânea.
Pesquisador: Marcio Ferrari
Área Temática:
Versão: 1
CAAE: 12394613.5.0000.5165
Instituição Proponente:
Patrocinador Principal: Financiamento Próprio

DADOS DO PARECER

Número do Parecer: 195.680

Data da Relatoria: 07/02/2013

Apresentação do Projeto:
Projeto dentro dos padrões científicos, com apresentação clara e bom detalhamento. Procedimentos
com bom rigor e boa técnica.

Objetivo da Pesquisa:
Objetivo Primário:
Desenvolvimento de diferentes formas cosméticas aditivadas com extratos de plantas e avaliação in
vivo da eficácia das mesmas por meio de metodologias de bioengenharia cutânea.
Objetivo Secundário:
Coleta dos espécimes vegetais e subsequente identificação; Avaliação da segurança dos extratos
obtidos; Desenvolvimento de diferentes formas cosméticas contendo os extratos obtidos; Avaliação
clínica do sensorial das formulações; Avaliação da estabilidade preliminar e acelerada das formulações
em estudo; Avaliação in vivo do conteúdo aquoso do estrato córneo; Avaliação in vivo da perda de
água transepidermal; Avaliação in vivo da viscoelasticidade da pele; Avaliação in vivo do micro relevo
cutâneo; Avaliação in vivo do potencial fotoprotetor quanto ao Fator de ProteçãoSolar (FPS) e Fator
de Proteção UVA (FPUVA)
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Riscos:
111

Não há riscos aos voluntários


Benefícios:
Comprovação da eficácia cosmética

Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:


O projeto visa desenvolver diferentes formas cosméticas aditivadas com extratos vegetais dos biomas
brasileiros buscando determinar a eficácia cosmética de hidratação, envelhecimento cutâneo e
atividade fotoprotetora. O estudo da eficácia será realizado por meio de metodologias não invasivas
de bioengenharia cutânea. O resultado esperado do projeto é obter informações que comprovem a
eficácia cosmética dos extratos estudados, sinalizando o uso para indústria cosmética
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória: foram
cumpridos corretamente todos os termos obrigatórios

Recomendações: sem
recomendações

Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:

Não há pendências

Situação do Parecer:
Aprovado

Necessita Apreciação da CONEP:


Não

Considerações Finais a critério do CEP:


O projeto atende a resolução nº 196/96 sendo o meu parecer favorável sem ressalvas a aprovação
pelo CEP/UNIC.

CUIABA, 08 de Fevereiro de 2013

Assinador por:
Margarete Lovato
( Coordenador )
112

APÊNDICE A

LABORATÓRIO DE SEGURANÇA E EFICÁCIA DE PRODUTOS COSMÉTICOS


TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PESQUISA DE IRRITABILIDADE PRIMÁRIA

 Todos os itens do Termo de Consentimento Livre e esclarecido foram lidos pelo voluntário ou pelo
investigador, em voz alta, para o voluntário;
 Você está sendo convidado (a) a participar de uma pesquisa. Pedimos que entenda detalhadamente todas
as etapas e, se concordar, assine este termo de consentimento;
 Esta pesquisa tem por objetivo observar os efeitos da aplicação de uma matéria-prima e/ou produto na
pele e comprovar o não aparecimento de irritação e/ou alergia;
 Será aplicado o “teste de contato” no dorso direito e/ou esquerdo, e será removido após 48 horas. As
leituras serão realizadas 30 minutos, 24 e 48 horas após a remoção.
 Não molhe o “teste de contato” durante todo o período de aplicação;
 Você será previamente avaliado (a) por um médico e acompanhado (a) durante a realização da pesquisa.
Todas as dúvidas que venham a surgir durante e após o trabalho serão prontamente esclarecidas;
 Sua contribuição garantirá à comunidade um produto seguro e eficaz;
 Conforme legislação em vigor, você não receberá nenhuma quantia em dinheiro;
 Você poderá se retirar da pesquisa a qualquer instante se assim desejar, ou se necessário, a critério do
pesquisador;
 Sua contribuição voluntária será de grande importância para o nosso trabalho, portanto pedimos que
compareça nos horários e datas indicados durante o decorrer da pesquisa;
 Se houver qualquer modificação nos seus hábitos, solicitamos que nos comunique para melhor
interpretação dos resultados;
 Não usar qualquer tipo de produto (desodorante ou antiperspirante, talco, óleo para banho, cremes,
loções, perfumes, colônias e medicamentos tópicos) nas áreas próximas à do teste. Caso utilize algum
destes produtos ou faça uso de medicamento sistêmico, avise;
 No caso de coceira intensa ou outros sinais fortes de irritação, comunique imediatamente comparecendo
ao local de aplicação do teste ou pelo telefone (084) 3342-9838 (horário comercial) ou (084) 99406-6479
24 horas;
 Garantimos que reação adversa provocada pela amostra /produto em teste será acompanhada pelo
médico e/ou especialista responsável pelo projeto e que, se necessário, será fornecida tratamento
adequado, assim como qualquer nova informação que seja relevante você será notificado;
113

 Todas as matérias primas utilizadas no produto são aprovadas para uso tópico e não tóxicas. Entretanto,
como qualquer produto, poderá causar reações inesperadas como “vermelhidão”, “inchaço”, coceira e
“ardor” nos locais de aplicação do produto;
 Todas as informações obtidas sobre os voluntários são mantidas em sigilo;
 Em caso de dúvida ou problema, você poderá entrar em contato com a equipe pelo telefone (084) 3342-
9838 com Stella Maria Barreto.
 Uma via deste termo permanecerá no arquivo do Laboratório de Segurança e eficácia de Produtos
Cosméticos e outra de posse do voluntário.

1 Eu,

2
Data de nascimento RG

Casado
Solteiro(a) (a) Separado (a) Judic. Ou Desquitado (a)

3
Divorciado (a) Viúvo (a) União estável

Estado civil

4
Rua, Avenida ou Travessa (por extenso) Número

5
Complemento

6
Bairro Cidade

7
Telefone Endereço eletrônico

Concordo em participar do estudo descrito e declaro ter sido esclarecido sobre todos os itens acima.
114

Testemunha (nome completo, sem abreviações

8 RG

Assintura da testemunha

Data

Assinatura do responsável por aplicar o TCLE Assinatura do Voluntário


9

Data Data
115

APÊNDICE B

PROJE TO DE PESQUISA

Utilização do subproduto do beneficiamento do sisal (Agave sisalana Perrine):


desenvolvimento de nanoemulsões cosméticas e avaliação da segurança e eficácia.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

As informações estão sendo fornecidas para participação voluntária neste estudo, que
objetiva determinar a hidratação da pele após aplicação de formulação (nanoemulsão) contendo
fração enriquecida em polissacarídeos, oriunda do subproduto do beneficiamento de Agave
sisalana, bem como seu veículo correspondente e controle positivo (hidratante disponível no
mercado).
Caso o (a) senhor (a) tenha livre interesse em participar do estudo, não poderá utilizar
qualquer tipo de produto cosmético no antebraço 24 horas antes do experimento. Nos dias dos
testes de hidratação, terá que permanecer em uma sala climatizada (20 ± 2ºC e 55 ± 5%
Umidade Relativa) por um período inicial de 30 minutos, antes da aplicação das formulações.
Para os experimentos de hidratação terá que permanecer na sala durante seis horas para
avaliações em intervalos de 1, 2, 3, 4 e 5 horas após a aplicação das formulações. Será aplicada
uma pequena quantidade do produto atrás da orelha ou na porção anterior do cotovelo para
verificar se o Sr. (a) apresenta sensibilidade a algum componente da formulação.
Não há desconforto algum para o Sr (a), pois as medidas serão realizadas na superfície
da pele sem causar nenhuma dor.
Em qualquer fase da pesquisa, o (a) senhor (a) terá acesso aos profissionais responsáveis
para esclarecimento e eventuais dúvidas (Prof. Dr. Márcio Ferrari, Pesquisador principal –
33249812 ou 999246707 e/ou Farmacêutica Stella Maria Andrade Gomes Barreto – 99406-
6479).
É garantida a liberdade da retirada de consentimento a qualquer momento do estudo,
sem qualquer prejuízo.
As informações obtidas serão analisadas em conjunto com outros voluntários do estudo,
não sendo divulgada a identificação de nenhum voluntário.
O (a) senhor (a) terá o direito de ser mantido (a) atualizado (a) sobre os resultados das
pesquisas.
Não haverá despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo. Não
haverá compensação financeira relacionada à sua participação.
Em caso de algum dano pessoal, diretamente causado pelo produto, o (a) senhor (a) terá
direito a tratamento médico na Instituição, bem como às indenizações legalmente estabelecidas.
116

Os dados e resultados obtidos serão utilizados apenas para esta pesquisa, podendo os
mesmos ser divulgados, mantendo a identidade, em meios científicos.

Declaração do Participante

Eu, Senhor (a) _______________________________________________declaro ter sido


suficientemente informado a respeito das informações que li ou que foram lidas para mim,
descrevendo o estudo: “Utilização do subproduto do beneficiamento do sisal (Agave sisalana
Perrine): desenvolvimento de nanoemulsões cosméticas e avaliação da segurança e eficácia”.
Discuti com o Dr. Márcio Ferrari ou com a farmacêutica Stella Maria Andrade Gomes Barreto
e sua equipe sobre a minha decisão em participar nesse estudo. Ficaram claros para mim quais
são os propósitos do estudo, os procedimentos a serem realizados, seus desconfortos e riscos,
as garantias de confidencialidade e de esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que
minha participação é isenta de despesas e que tenho garantia de acesso a tratamento hospitalar,
caso ocorrer dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos ou tratamentos propostos
neste estudo (nexo causal comprovado). Concordo voluntariamente em participar deste estudo
e poderei retirar o meu consentimento a qualquer momento, antes ou durante o mesmo, sem
penalidades ou prejuízo ou perda de qualquer benefício que eu possa ter adquirido, ou no meu
atendimento neste Serviço.

______________________________________________Data:_______________
Assinatura do participante/representante legal

______________________________________________ Data:_______________
Assinatura da testemunha

Somente para o responsável do projeto


Declaro que obtive de forma apropriada e voluntária o Consentimento Livre e Esclarecido deste
paciente ou representante legal para a participação do estudo.

_______________________________________________Data:________________
Assinatura do responsável

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