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• Suspensões bacterianas (Escherichia coli)

Staphylococcus aureus e mista);


Universidade Tecnológica Federal do Paraná • Tubos de meio líquido tioglicolato;
Campus Campo Mourão • Tubos com Agar nutriente inclinado;
Coordenação de Alimentos • Tubos com Agar semi-sólido (SIM);
Disciplina de Microbiologia
• Placas de EMB ou McConkey.
Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini
PROCEDIMENTO
AULA PRÁTICA 9 e 10: Técnicas de Prática
semeaduras de microrganismos A) Técnica de semeadura em meio líquido-
tubos de meio líquido tioglicolato;
INTRODUÇÃO • Flambar a alça de inoculação ao rubro e,
Ao se inocular um microrganismo em um a seguir, deixá-la esfriar perto da chama
meio de cultura adequado para seu crescimento do bico de Bunsen;
in vitro, esse microrganismo inicia o seu • Tomar o tubo a ser inoculado e identificá-
desenvolvimento nesse meio. A inoculação lo;
correta da amostra é um dos passos mais • Tomar o tubo com a cultura bacteriana
importantes na identificação de um patógeno e com a mão esquerda e agitá-lo
pode ser feita por meio de swabs, ou de outras levemente;
fontes, com uso de alças de inoculação • Retirar o tampão de algodão com o dedo
devidamente esterilizadas. Os meios devem ser mínimo da mão direita e flambar a boca
sempre examinados antes da inoculação a fim de do tubo;
que se verifique a presença de contaminantes já • Introduzir a alça até tocar o meio e retirá-
existentes na placa. la após coletar uma gota da suspensão;
Bactérias são semeadas em meios • Flambar novamente a boca do tubo e
líquidos ou em meios sólidos. Após a inoculação, recolocar o tampão de algodão;
a placa ou o tubo, devidamente rotulado, é • Tomar o tubo com o meio esterilizado com
colocado em uma incubadora a 37°C por 24 a 48 a mão esquerda, retirar o tampão de
horas. Quando ocorre o crescimento bacteriano algodão com o dedo mínimo da mão
em um meio sólido, as bactérias são direita e flambar a boca do tubo;
representadas em padrões característicos, • Introduzir a alça carregada de
denominados colônias, grandes grupos de microrganismo no interior do tubo,
células bacterianas. Em meios líquidos, o levando-a, delicadamente, ao interior do
crescimento mostra-se evidente pela existência meio líquido;
de turvação do líquido. As estrias da semeadura • Retirar a alça, flambar novamente a boca
são feitas a fim de que se consiga o isolamento do tubo e recolocar o tampão de algodão;
dos organismos. Como cada espécie possui um • Colocar o tubo na estante, flambar a alça
tipo morfológico colonial diferente, deve ser feita e recolocá-la na estante.
a análise quanto à elevação, à forma, ao
tamanho, às bordas e à pigmentação. Em um B) Técnica de semeadura em meio sólido
meio de cultura, um único tipo de colônia inclinado (esgotamento): tubos com ágar
observado é denominado cultura pura. Se forem nutriente inclinado
observados vários tipos, denomina-se cultura • Flambar a agulha de platina ao rubro e a
mista. seguir, deixá-la esfriar perto da chama do
Há várias técnicas de inoculação de bico de Bunsen;
microrganismos. Algumas são utilizadas para • Tomar o tubo a ser inoculado e identificá-
exames qualitativos e outras, para estudos lo;
quantitativos. • Tomar o tubo com a cultura bacteriana
com a mão esquerda e agitá-lo
OBJETIVOS levemente;
- Realizar inoculação em meios de cultura • Retirar o tampão de algodão com o dedo
líquidos, sólidos em placa e inclinados (semi- mínimo da mão direita e flambar a boca
sólidos), verificando a presença ou ausência de do tubo;
crescimento bacteriano; • Introduzir a agulha até tocar o meio e
- Realizar semeadura em profundidade; retirá-la após coletar uma gota da
- Realizar semeadura em superfície. suspensão;
• Flambar novamente a boca do tubo e
MATERIAIS
recolocar o tampão de algodão;
• Tubos de solução salina estéril (9,9mL) ;
• Tomar o tubo com o meio esterilizado com
a mão esquerda, retirar o tampão de - Não haver um grande número de estrias;
algodão com o dedo mínimo da mão - Não perfurar o meio;
direita e flambar a boca do tubo; - Pegar uma pequena quantidade de
• Introduzir a agulha carregada de material para semear.
microrganismo no interior do tubo,
levando-a, delicadamente, ao interior do
meio inclinado, fazendo estrias na
superfície do Agar com a agulha;
• Retirar a agulha, flambar novamente a
boca do tubo e recolocar o tampão de
algodão;
• Colocar o tubo na estante, flambar a alça
e recolocá-la na estante.

C) Técnica de semeadura em meio semi-


sólido em tubo (repicagem profunda)-
MEIO SIM
• Flambar a agulha de platina ao rubro e, a
seguir, deixá-la esfriar perto da chama do
bico de Bunsen;
• Tomar o tubo com a cultura bacteriana
com a mão esquerda e agitá-lo
levemente;
• Retirar o tampão de algodão com o dedo
mínimo da mão direita e flambar a boca
do tubo;
• Introduzir a agulha até tocar o meio e
retirá-la, após coletar uma gota da
suspensão;
• Flambar novamente a boca do tubo e
recolocar o tampão de algodão;
• Tomar o tubo com o meio esterilizado com
a mão esquerda, retirar o tampão de
algodão com o dedo mínimo da mão Prática
direita e flambar a boca do tubo; E) Técnica de semeadura em placa Pour
• Introduzir a agulha carregada de Plate
microrganismo no interior do tubo, A técnica Pour Plate pode ser realizada com
levando-a, delicadamente, ao interior do o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo
meio semi-sólido; qualitativo), ou de se fazer a contagem de
• Inocular a cultura de bactérias em meio colônias em placa (estudo quantitativo). A seguir,
semi-sólido, utilizando a agulha de platina. será visto o procedimento para a realização do
A inoculação deverá ter a profundidade de estudo quantitativo, determinando o número de
dois terços do meio semi-sólido ao qual se UFC (unidades formadoras de colônia) por
aplicará uma, e apenas uma picada; mililitro.
• Retirar a agulha, flambar novamente a • Agitar a cultura da bactéria e transferir
boca do tubo e recolocar o tampão de 0,1mL para 9,9mL de líquido de diluição
algodão; (1:100);
• Colocar o tubo na estante, flambar a alça • Agitar esse tubo e transferir 0,1mL para
e recolocá-la na estante. outro tubo com 9,9mL (1:10.000);
• A seguir, realizar nova diluição,
D) Técnica de semeadura em meio sólido em transferindo 0,1mL do último tubo para
placa (esgotamento) – usar cultura mista outro com 9,9mL de líquido de diluição
em McConkey (1:1.000.000);
A técnica de esgotamento em placa • Após realizar as diluições, fazer o
consiste em depositar sobre um ponto da plaqueamento ao se agitar e retirar 1mL
superfície do meio uma parte do material e, de cada diluição, transferindo-os para
depois, espalhá-la de maneira a se obter placas estéreis;
quantidades progressivamente menores do • Em seguida, colocar de 15 a 20mL de
material. O objetivo é obter colônias isoladas. Agar fundido em cada uma delas;
O sucesso da semeadura está em: • Submeter as placas a suaves movimentos
rotatórios (em forma de oito), visando à REFERÊNCIAS
perfeita mistura da cultura com o Agar; OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia-
• Esperar solidificar; roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd,
• Inverter as placas e incubar a 37°C por 2008.
48horas.

F) Técnica de semeadura em placa Spread


Plate
• Aproveitar a mesma diluição da
semeadura em placa Pour Plate;
• Fazer o plaqueamento ao agitar, e retirar
0,1mL de cada diluição, transferindo-os
para a placa com o Agar já solidificado;
• Com a alça de Drigalski esterilizada,
espalhar os inóculos para as superfícies
dos meios de cultura, começando do mais
diluído para o menos diluído;
• Incubar a 37°C por 48horas.

EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO

1. Quais são as formas de crescimento


bacteriano? Explique-as.
2. O que se entende por “colônia” de
microrganismo?
3. Como pode ser obtida uma cultura pura
de bactéria?
4. Explique a diferença entre as técnicas de
semeadura em Pour Plate e em Spread
Plate.
5. Como se calcula o número de UFC/ml de
microrganismos inoculados na técnica de
Pour Plate?
6. Como se calcula o número de UFC/ml de
microrganismos inoculados na técnica em
Spread Plate?

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