Este documento descreve várias técnicas de semeadura de microrganismos em meios de cultura, incluindo meios líquidos, sólidos inclinados e em placa. As técnicas incluem inoculação em tubos de meio líquido, semeadura em ágar nutritivo inclinado e em meio semi-sólido, e semeadura em placa utilizando as técnicas de esgotamento e Pour Plate e Spread Plate. O objetivo é realizar inoculação corretamente para permitir o crescimento bacteriano
Este documento descreve várias técnicas de semeadura de microrganismos em meios de cultura, incluindo meios líquidos, sólidos inclinados e em placa. As técnicas incluem inoculação em tubos de meio líquido, semeadura em ágar nutritivo inclinado e em meio semi-sólido, e semeadura em placa utilizando as técnicas de esgotamento e Pour Plate e Spread Plate. O objetivo é realizar inoculação corretamente para permitir o crescimento bacteriano
Este documento descreve várias técnicas de semeadura de microrganismos em meios de cultura, incluindo meios líquidos, sólidos inclinados e em placa. As técnicas incluem inoculação em tubos de meio líquido, semeadura em ágar nutritivo inclinado e em meio semi-sólido, e semeadura em placa utilizando as técnicas de esgotamento e Pour Plate e Spread Plate. O objetivo é realizar inoculação corretamente para permitir o crescimento bacteriano
Universidade Tecnológica Federal do Paraná • Tubos de meio líquido tioglicolato; Campus Campo Mourão • Tubos com Agar nutriente inclinado; Coordenação de Alimentos • Tubos com Agar semi-sólido (SIM); Disciplina de Microbiologia • Placas de EMB ou McConkey. Profa. Márcia R. F. G. Perdoncini PROCEDIMENTO AULA PRÁTICA 9 e 10: Técnicas de Prática semeaduras de microrganismos A) Técnica de semeadura em meio líquido- tubos de meio líquido tioglicolato; INTRODUÇÃO • Flambar a alça de inoculação ao rubro e, Ao se inocular um microrganismo em um a seguir, deixá-la esfriar perto da chama meio de cultura adequado para seu crescimento do bico de Bunsen; in vitro, esse microrganismo inicia o seu • Tomar o tubo a ser inoculado e identificá- desenvolvimento nesse meio. A inoculação lo; correta da amostra é um dos passos mais • Tomar o tubo com a cultura bacteriana importantes na identificação de um patógeno e com a mão esquerda e agitá-lo pode ser feita por meio de swabs, ou de outras levemente; fontes, com uso de alças de inoculação • Retirar o tampão de algodão com o dedo devidamente esterilizadas. Os meios devem ser mínimo da mão direita e flambar a boca sempre examinados antes da inoculação a fim de do tubo; que se verifique a presença de contaminantes já • Introduzir a alça até tocar o meio e retirá- existentes na placa. la após coletar uma gota da suspensão; Bactérias são semeadas em meios • Flambar novamente a boca do tubo e líquidos ou em meios sólidos. Após a inoculação, recolocar o tampão de algodão; a placa ou o tubo, devidamente rotulado, é • Tomar o tubo com o meio esterilizado com colocado em uma incubadora a 37°C por 24 a 48 a mão esquerda, retirar o tampão de horas. Quando ocorre o crescimento bacteriano algodão com o dedo mínimo da mão em um meio sólido, as bactérias são direita e flambar a boca do tubo; representadas em padrões característicos, • Introduzir a alça carregada de denominados colônias, grandes grupos de microrganismo no interior do tubo, células bacterianas. Em meios líquidos, o levando-a, delicadamente, ao interior do crescimento mostra-se evidente pela existência meio líquido; de turvação do líquido. As estrias da semeadura • Retirar a alça, flambar novamente a boca são feitas a fim de que se consiga o isolamento do tubo e recolocar o tampão de algodão; dos organismos. Como cada espécie possui um • Colocar o tubo na estante, flambar a alça tipo morfológico colonial diferente, deve ser feita e recolocá-la na estante. a análise quanto à elevação, à forma, ao tamanho, às bordas e à pigmentação. Em um B) Técnica de semeadura em meio sólido meio de cultura, um único tipo de colônia inclinado (esgotamento): tubos com ágar observado é denominado cultura pura. Se forem nutriente inclinado observados vários tipos, denomina-se cultura • Flambar a agulha de platina ao rubro e a mista. seguir, deixá-la esfriar perto da chama do Há várias técnicas de inoculação de bico de Bunsen; microrganismos. Algumas são utilizadas para • Tomar o tubo a ser inoculado e identificá- exames qualitativos e outras, para estudos lo; quantitativos. • Tomar o tubo com a cultura bacteriana com a mão esquerda e agitá-lo OBJETIVOS levemente; - Realizar inoculação em meios de cultura • Retirar o tampão de algodão com o dedo líquidos, sólidos em placa e inclinados (semi- mínimo da mão direita e flambar a boca sólidos), verificando a presença ou ausência de do tubo; crescimento bacteriano; • Introduzir a agulha até tocar o meio e - Realizar semeadura em profundidade; retirá-la após coletar uma gota da - Realizar semeadura em superfície. suspensão; • Flambar novamente a boca do tubo e MATERIAIS recolocar o tampão de algodão; • Tubos de solução salina estéril (9,9mL) ; • Tomar o tubo com o meio esterilizado com a mão esquerda, retirar o tampão de - Não haver um grande número de estrias; algodão com o dedo mínimo da mão - Não perfurar o meio; direita e flambar a boca do tubo; - Pegar uma pequena quantidade de • Introduzir a agulha carregada de material para semear. microrganismo no interior do tubo, levando-a, delicadamente, ao interior do meio inclinado, fazendo estrias na superfície do Agar com a agulha; • Retirar a agulha, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampão de algodão; • Colocar o tubo na estante, flambar a alça e recolocá-la na estante.
C) Técnica de semeadura em meio semi-
sólido em tubo (repicagem profunda)- MEIO SIM • Flambar a agulha de platina ao rubro e, a seguir, deixá-la esfriar perto da chama do bico de Bunsen; • Tomar o tubo com a cultura bacteriana com a mão esquerda e agitá-lo levemente; • Retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo da mão direita e flambar a boca do tubo; • Introduzir a agulha até tocar o meio e retirá-la, após coletar uma gota da suspensão; • Flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampão de algodão; • Tomar o tubo com o meio esterilizado com a mão esquerda, retirar o tampão de algodão com o dedo mínimo da mão Prática direita e flambar a boca do tubo; E) Técnica de semeadura em placa Pour • Introduzir a agulha carregada de Plate microrganismo no interior do tubo, A técnica Pour Plate pode ser realizada com levando-a, delicadamente, ao interior do o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo meio semi-sólido; qualitativo), ou de se fazer a contagem de • Inocular a cultura de bactérias em meio colônias em placa (estudo quantitativo). A seguir, semi-sólido, utilizando a agulha de platina. será visto o procedimento para a realização do A inoculação deverá ter a profundidade de estudo quantitativo, determinando o número de dois terços do meio semi-sólido ao qual se UFC (unidades formadoras de colônia) por aplicará uma, e apenas uma picada; mililitro. • Retirar a agulha, flambar novamente a • Agitar a cultura da bactéria e transferir boca do tubo e recolocar o tampão de 0,1mL para 9,9mL de líquido de diluição algodão; (1:100); • Colocar o tubo na estante, flambar a alça • Agitar esse tubo e transferir 0,1mL para e recolocá-la na estante. outro tubo com 9,9mL (1:10.000); • A seguir, realizar nova diluição, D) Técnica de semeadura em meio sólido em transferindo 0,1mL do último tubo para placa (esgotamento) – usar cultura mista outro com 9,9mL de líquido de diluição em McConkey (1:1.000.000); A técnica de esgotamento em placa • Após realizar as diluições, fazer o consiste em depositar sobre um ponto da plaqueamento ao se agitar e retirar 1mL superfície do meio uma parte do material e, de cada diluição, transferindo-os para depois, espalhá-la de maneira a se obter placas estéreis; quantidades progressivamente menores do • Em seguida, colocar de 15 a 20mL de material. O objetivo é obter colônias isoladas. Agar fundido em cada uma delas; O sucesso da semeadura está em: • Submeter as placas a suaves movimentos rotatórios (em forma de oito), visando à REFERÊNCIAS perfeita mistura da cultura com o Agar; OKURA, M. H. & RENDE, J. C. Microbiologia- • Esperar solidificar; roteiros de aulas práticas. São Paulo: Tecmedd, • Inverter as placas e incubar a 37°C por 2008. 48horas.
F) Técnica de semeadura em placa Spread
Plate • Aproveitar a mesma diluição da semeadura em placa Pour Plate; • Fazer o plaqueamento ao agitar, e retirar 0,1mL de cada diluição, transferindo-os para a placa com o Agar já solidificado; • Com a alça de Drigalski esterilizada, espalhar os inóculos para as superfícies dos meios de cultura, começando do mais diluído para o menos diluído; • Incubar a 37°C por 48horas.
EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO
1. Quais são as formas de crescimento
bacteriano? Explique-as. 2. O que se entende por “colônia” de microrganismo? 3. Como pode ser obtida uma cultura pura de bactéria? 4. Explique a diferença entre as técnicas de semeadura em Pour Plate e em Spread Plate. 5. Como se calcula o número de UFC/ml de microrganismos inoculados na técnica de Pour Plate? 6. Como se calcula o número de UFC/ml de microrganismos inoculados na técnica em Spread Plate?