Microscopía: Tipos celulares e identificación macro y microscópica

Santiago Villanueva, Diego Zapata.

Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencia. Universidad Nacional de Colombia.

1. OBJETIVO GENERAL
Conocer las características mecánicas y funcionales de un microscopio óptico y su entendimiento como instrumento
fundamental de la microbiología, los tipos de tinciones y su utilidad para establecer clasificaciones y morfología
bacteriana.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICIFOS

Conocer los sistemas óptico -objetivos, binoculares- y mecánico del microscopio

Realizar una preparación en fresco para observar la viabilidad, tamaños y tipos celulares en los
microorganismos.
 Realizar diferentes tipos de tinción (simple, de Gram, etc) para poder observar con mejor contraste y hacer
una clasificación de los microorganismos.
 Usar el método de tinción de Schaeffer Fulton para observar la formación de esporas, así como también
una tinción negativa para observar cápsulas en las bacterias.
3. INTRODUCCIÓN
En el mundo de la microbiología es de vital importancia el microscopio. Es la herramienta principal usada en los
laboratorios por los microbiólogos, sin él no se podría concebir el estudio de estos seres al menos de una forma exhaustiva
ya que para el ojo humano es imposible detallar a este nivel; pues siempre está la parte macroscópica que también es
importante a la hora de estudiar dichos organismos. Es, por lo tanto, necesario que se sepa utilizar y conocer las
características y limitaciones que este tiene.
A través de la correcta utilización del microscopio y de varias técnicas de tinción, se podrán observar características de los
microorganismos como su morfología, su tamaño, su tipo celular (procariota o eucariota, Gram positiva o Gram negativa))
e incluso se puede observar el núcleo y (al menos percibir la presencia de) los organelos de estos. Es también posible ver
los microorganismos en movimiento, es decir, su viabilidad mediante técnicas de preparación en fresco. Todo lo anterior
y algunas otras consideraciones más fueron los principales objetivos de las prácticas realizadas en el laboratorio.
4. DATOS
Preparación en fresco y tinción simple.
Imagen 1. Resultados de la preparación en fresco.

Imagen 2. Resultados de la tinción simple.

Se observaron distintos microorganismos en la preparación en fresco, entre ellos los enmarcados en la imagen 1 (A y B)
con morfologías y colores diferentes. En la tinción simple se observaron células epiteliales presentes en la mucosa bucal
de un estudiante obtenidas mediante un frotis. Como parte final, se sembró en una caja de Petri una muestra del interior
de los microondas ubicados en el segundo piso del edificio de farmacia, el cultivo obtenido posteriormente se observó en
las siguientes clases.

Tinción diferencial: Tinción de Gram

Como se mencionó, se observó una colonia de las tantas obtenidas en el cultivo anterior, a la cual se le realizo una tinción
diferencial conocida como tinción de gram. Gracias a esta tinción se permite diferenciar dos clases de células, gram
positivas y gram negativas, pero en la discusión se abordará porque este método permite esa diferenciación. Los
resultados grupales obtenidos son los siguientes:
Microscopio 1:
Microscopio 2:
Microscopio 3:
Microscopio 4:
Microscopio 5: Bacilos gram negativos
Microscopio 6:
Microscopio 7 : Bacilos Gram negativos
Microscopio 8:
Microscopio 9: Cocos en tétradas gram – (Estafilococos)
Microscopio 10:
Microscopio 11: Cocos en racimo gram + (Estafilococo)
Microscopio 12:
Microscopio 13: Cocos en racimo gram + (Estafilococo)
Microscopio 14: Cocos gram (+), probable staphylococcus
Microscopio 15:
Microscopio 16: Bacilos Gram positivos con exoesporas
Microscopio 17: Cocos Gram (+) tetrados
Microscopio 18: Bacilos gram positivos con endoesporas terminales
Microscopio 19: Cocos gram (+) agrupados en tétradas
*A todas les ponemos Imagen 3 y se diferenciará cada una con una letra*
*Con respecto a lo que pongan se sigue la discusión*
Tinciones especiales (Schaeffer-Fulton y tinción negativa-tinta china)
Mediante la tinción de Schaeffer-Fulton se encontraron bacilos con muy pocas endoesporas y en la tinta china se logró
ver la cápsula o glicocálix presente en estos bacilos.

Imagen 4. Cápsula de bacilos con contraste.

Morfología de colonias: relación macroscópica y microscópica
Los resultados de la observación macroscópica del cultivo se presentan en la siguiente tabla, en donde se encontraron 6
tipos distintos de colonias:
# Forma Elevación Superficie Borde Pigmentación Tamaño Organolépticas
1 Irregular Plano Rugosa Ondulado Blanco cremoso Grande Putrefacto
2 Circular Convexa Lisa Entero Blanco brillante Mediano Putrefacto
3 Puntiforme Convexa Lisa Entero Crema brillante Pequeño Putrefacto
4 Circular Convexa Lisa Ondulado Amarillo brillante Mediano Putrefacto
5 Circular Pulvinado Lisa Ondulado Borde blanco, centro Mediano Putrefacto
amarillo
6 Circular Convexa Lisa Entero Naranja Pequeño Putrefacto
Tabla 1. Características de las diferentes colonias encontradas en el cultivo realizado con muestra de microorganismos
tomada de hornos microondas.
Imagen 5. Colonias bacterianas en agar nutritivo.
5. DISCUSIÓN
Los microscopios ópticos hacen uso de lentes de vidrio que desvían y enfocan la luz para así poder ver una imagen
magnificada de microorganismos u objetos pequeños. Hay diferentes tipos de microscopios ópticos como el de
fluorescencia, el de contraste de fases, el de campo oscuro y el de campo claro, siendo este último el utilizado en las
prácticas de laboratorio, el cual se denomina de esta forma porque forma una imagen oscura frente a un fondo claro. [1]
El microscopio óptico está compuesto por los siguientes sistemas:
 Sistema mecánico
 Sistema de iluminación
 Sistema óptico
Cada uno de estos sistemas tienen respectivas partes que se muestran en la *imagen* imagen y se describirán a
continuación.
Sistema Mecánico: Está constituido por las piezas que dan soporte y movilidad a los demás componentes, sus
partes son
Estativo: Es la pieza que da soporte a todos los elementos del microscopio. Consta de una base o pie.
Platina: Es la pieza donde se coloca y sujeta la muestra a ser observada en el microscopio, permite su
desplazamiento a voluntad por medio de dos mandos que la mueven anterosuperior y laterales.
Los mandos de enfoque: Hace parte el mecanismo de movimiento de la platina, como el tornillo macrométrico y
el tornillo micrométrico
Sistema de Iluminación: Son piezas del microscopio encargadas de iluminar la muestra para que pueda ser
ampliada por el sistema óptico. Consta de una lámpara y su transformador ubicados en la base del microscopio,
un interruptor y un regulador de la intensidad de la luz para poder controlar la iluminación de la muestra.
Sistema Óptico: Es el encargado de aumentar las imágenes que se observa en la muestra, sus componentes son:
Condensador: Una pieza con un conjunto de lentes los cuales tienen por objetivo concentrar la luz sobre la muestra
observada. Posee un diafragma que mediante una palanca se puede controlar la luz sobre lo observado.
Objetivos: Es la pieza que posee la lente situada sobre el objeto a observar. Esta ubicados en una pieza giratoria
denominada revolver y sirven para aumentar la imagen de la muestra. Los objetivos suelen llevar por medio de
un color la descripción de aumento del lente, existen de 4x, 10x, 25x, 40x… siendo 100x el máximo posible.
 Oculares: Se encuentran próximo a los ojos, en la parte alta del microscopio, estos aumentan por segunda vez la
imagen según el factor grabado alrededor estos y permite detallar la muestra.
Para la preparación en fresco, se utilizó agua de charco ya que suelen haber bastantes microorganismos en estas.
Lo primero que se observó fueron unos microorganismos de gran tamaño, de color amarillo verduzco, con forma ovoide
y unos cilios extremadamente pronunciados, especialmente en la parte más ancha en donde se hacen más largos, y a
través de los cuales se movían muy rápidamente (ver img. 1). Se alcanza a ver hacia su costado más angosto lo que parece
ser su núcleo en color rojo pardo, mismo color de su parte exterior (membrana). Fue uno de los más grandes encontrados.
También se observó gran cantidad de microorganismos a los que no se les pudo determinar la presencia de un núcleo ni
la morfología exacta debido al poco contraste que se tenía ya que la muestra no fue coloreada, pero en aspectos generales
se puede observar su color, una forma presuntamente circular y dos en particular: uno incoloro, con un flagelo bastante
largo, de aproximadamente 6 veces el tamaño de su cuerpo; el otra, bastante grande, con gran cantidad de cilios y
numerosas vacuolas (ver img. 1).
La mayoría de estos microorganismos pertenecen a los cilióforos, que son organismos que tienen cilios, los cuales son
importantes para su movimiento. Más precisamente se puede decir que se encontraron los géneros Halteria, Vorticela y
Oligotrichia, aunque esto es una afirmación bastante a la ligera, ya que puede haber otros organismos bastante parecidos
y es fácil confundirse cuando no se es un microbiólogo.
Además, se pudo observar bastante material vegetal y varias algas de forma cilíndrica y alargadas y con su color verde
natural. Todo lo anterior está dentro de lo que se suele encontrar en agua de charco según la literatura: algas, amebas,
cilióforos, amebas, entre otros [2], aunque no se logró ver ninguna ameba.
Las tinciones en simple proporcionan un contraste para ver y detallar los microorganismos completos, en estas tinciones
se utilizan colorantes como el cristal violeta, la fucsina o el azul de metileno, hay que mencionar que en este tipo de
tinciones no se tiñen los tejidos. Se realizó este tipo de tinción cuando con un hisopo tomamos muestra de la microbiota
presente en la saliva, las mejillas o por debajo de la lengua. En la cavidad bucal encontramos diversidad de microbios esto
debido a que existen diferentes ambientes, pero los géneros más comunes que existen son Gemella, Granulicatella,
Streptococcus y Veillonella [3]. Observamos en el microscopio células epiteliales con su membrana celular y su núcleo bien
definidos debido al cristal violeta usado para teñir estas estructuras, también se puede definir su morfología fácilmente,
lo cual marca una primera diferencia con las preparaciones en fresco, las cuales no ofrecen un buen contraste debido a
que las células son en su mayoría transparentes. Otra diferencia es que en la tinción simple no se puede observar la
viabilidad de las células ya que estas mueren en el proceso de fijación y posterior tinción, esto con el fin de poder
observarlas con mayor detenimiento ya que es muy difícil caracterizarlas cuando están en movimiento.
La tinción de gram como se dijo permite diferencial dos tipos de células presentes en un cultivo microbiológico, Gram (+)
y gram (-), debido a que los reactivos usados permiten diferenciar la pared celular de las bacterias. La pared celular de las
bacterias sirve para dar su tamaño y forma al organismo y prevenir de la lisis osmótica, esta constituida por peptidoglicano
el cual le otorga rigidez a la pared celular además de algo de ácido teicoico. En las bacterias gram (+) esta pared celular
está constituida mayormente por peptidoglicano con valores cercanos al 80% o 90%, por eso mismo, cuando se induce el
complejo de coloración primaria con cristal violeta y lugol resisten la decoloración del alcohol-acetona. Por el contrario,
las gram (-) tienen valores de peptidoglicanos cercanos al 10% o inferior en la composición de su membrana, tienen un
alto contenido lipídico por lo que el complejo de coloración es arrastrado por el alcohol-acetona y terminan tiñéndose al
final de la fuscina para dar contraste y lograr verlas al microscopio.
Particularmente, en nuestra muestra vista al microscopio teníamos bacilos gram (+) con exoexporas y endoesporas, las
cuales no se coloreaban en la tinción por lo cual se identificaban de manera sencilla. Los géneros de bacterias que son
responsables de estas son Bacillus y Clostridium. El proceso de esporulación se da cuando las células se ven sometidas a
condiciones adversas. Este proceso corresponde a una reproducción asexual en donde las células dan lugar a exoesporas
o endoesporas que son más resistentes a las condiciones adversas. Estas esporas no se tiñen con la tinción de Gram, por
lo que es fácil verlas en el microscopio cerca de las bacterias teñidas.
Analizando los resultados de los demás grupos, se tiene que se observaron Bacilos grampositivos y gramnegativos, cocos
en tétradas y racimos tanto grampositivos como gramnegativos, lo cual quiere decir que en todos los medios de cultivo
proliferan casi igual cantidad de microorganismos grampositivos y gramnegativos. Se encontraron Cocos en tétradas, que
son agrupaciones de cuatro y se denominan Micrococcus, cuando se agrupan en cadena se denominas Streptococcus y
cuando se agrupan en racimos se denominan Staphylococcus. No se puede decir que los organismos grampositivos o
gramnegativos se agrupan de una u otra manera ya que para cada caso se encontraron distintas agrupaciones, por lo que
la tinción de Gram sólo nos permite hacer una separación en función de la composición de la pared bacterial entre las que
cuentan con gran proporción de peptidoglicanos y las que no. Pero esta característica hace que los dos grupos cuenten
con propiedades distintas; por ejemplo, las grampositivas son sensibles a la penicilina mientras que las gramnegativas no.
En rasgos generales, las gramnegativas constituyen un grupo celular más complejo que las grampositivas.
La tinción de Schaeffer- Fulton se utiliza para observar las endoesporas que, como ya se mencionó, son estructuras de
resistencia bacteriana que se presenta en los géneros Bacillus, Clostridium y en Sporosarcina y que le otorga resistencia al
calor o a diferentes agentes químicos o radiaciones. Debido a la resistencia de estas esporas, es algo complicado teñirles,
pero mediante la técnica utilizada es posible realizar dicha tinción. El fundamento de esta técnica consiste en aplicar calor
al sistema para que el colorante (verde de malaquita) pueda permear la espora, de lo contrario no podría teñirse.
Posteriormente se lava con agua, lo cual hará que el colorante caiga de toda la bacteria a excepción de la espora, luego se
utiliza fucsina para colorear estas partes de la bacteria y dar un mejor contraste, por lo cual al microscopio la célula se
verá fucsia y la espora verde.
En cuanto a los resultados se tiene que fueron muy pocas las esporas observadas en el microscopio, lo cual no quiere decir
que no haya presencia de estas, hay muy pocas, pero las hay, lo que quiere decir que la tinción sí quedó bien hecha y la
poca presencia de esporas se atribuye a que, como se mencionó antes, estas aparecen cuando hay condiciones adversas
para las células, como la falta de nutrientes, por ejemplo, y el medio del cultivo todavía tenía nutrientes suficientes para
que las células se siguieran reproduciendo de manera habitual. La poca presencia de esporas indica que ya había indicios
de falta de nutrientes, pero no todas las bacterias habían iniciado su proceso de esporulación. Quizá si se tomara la
muestra unas horas más tarde se alcanzaría a observar una mayor cantidad de esporas ya que las condiciones se volverían
más adversas con el paso de las horas.
La tinción con tinta china no es propiamente una tinción: pues ninguna célula o parte de esta es penetrada por la tinta
china, sino que es esta es utilizada para teñir el fondo, de manera que las células al microscopio se verán blancas o
transparentes. Esta técnica es utilizada principalmente para observar la cápsula o glicocálix celular y que este se define
muy bien en estas condiciones. En nuestros resultados observamos bacilos con contraste a los que se les podía ver la
cápsula definida. La función de la capa en este caso es retener agua y nutrientes para evitar procesos de deshidratación
en las condiciones en las que se encontraban, es decir, en el agar con nutrientes ya escasos.
Por el lado de la morfología colonial bacteriana, esta determinación de características sirve para dirigir la identificación de
un grupo de bacterias, pero nunca para establecer una identificación precisa ya que para esto se necesitarán métodos de
identificación microscópicos. Características como los bordes o la forma son muy orientadoras a la hora de dicho trabajo;
por ejemplo, una forma circular corresponde generalmente al género Staphylococcus, mientras que una irregular osa u
ondulada puede corresponder a Bacillus. Los bordes ondulados son característica de las colonias de bacilos largos o lisos
son característica de colonias de Escherichia coli. La pigmentación de las colonias suele ser una característica importante
en la identificación bacteriana; por ejemplo, una pigmentación amarilla puede corresponder a Staphylococcus aureus o
una verde a Pseudomonas aeruginosa. El olor también puede darnos un dato: el olor putrefacto corresponde a
microorganismos anaerobios, contrario al olor frutal que puede encontrarse en otro tipo de microorganismos. Así pues,
se hace importante realizar una caracterización macroscópica como primer paso a la hora de realizar una identificación
bacteriana ya que a partir de esta se puede dirigir la identificación y hacerla más efectiva.

6. CONCLUSIONES

 El conocimiento del funcionamiento y el correcto manejo del microscopio se hace de vital importancia en el
laboratorio de microbiología ya que este será la herramienta que permita realizar todo tipo de análisis, prácticas,
observaciones, etc.
 La preparación en fresco permite observar la viabilidad, pero ofrece un poco contraste por lo cual no es posible
determinar morfologías precisas; por su parte, y contrariamente a la preparación en fresco, la tinción simple
 permite observar morfología bacteriana gracias a que la fucsina permite que haya un mayor contraste en la
muestra.
 La tinción de gram permite discriminar bacterias entre gram positivas y gram negativas y determinar el tipo de
pared celular así como también apreciar morfología celular (coccus, Bacilos, Cocobacilos, etc), además de poder
observar esporas en caso de haberlas presentes en la muestra
 En la tinción de Schaeffer-Fulton se lograron observar pocas esporas por lo que se dice que el proceso de
esporulación apenas estaba iniciando debido a que la falta de nutrientes no había sido tan pronunciada en el
medio de cultivo; por el lado de la tinción con tinta china, que no es propiamente una tinción ya que lo que se tiñe
es el fondo para dar contraste, se pudo observar la cápsula celular, sin embargo los dos métodos permitieron
observar esporas y capsulas.
 La morfología colonial nos puede dar indicios y dirigir una identificación bacteriana ya que características
macroscópicas como la forma, el borde, el color, la superficie, el olor, entre otros nos dan ideas del tipo o género
de bacteria que puede estar conformando dicha colonia.

7. BIBLIOGRAFÍA

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