Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
JABOTICABAL - SP – BRASIL
2008
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
Elysio Garcia
Ao Prof. Matias Pablo Juan Szabó, pela co-orientação, amizade e por acreditar em
mim;
Aos Professores Marcelo Bahia Labruna, Marcio Botelho de Castro, Ely Nahas e
Luis Garrigós Leite, pela participação na banca examinadora e sugestões;
Aos amigos da Microbiologia Dinalva Alves Mochi, Lucas Detogni Simi, Ana
Carolina Ribeiro Machado e Carime Moraes;
Aos amigos do Labix Uberlândia: Maria Marlene e família, Suzana Akemi, William
Mendes Carvalho e Beatriz, pela extrema colaboração para a realização deste
trabalho;
Aos meus queridos irmãos, Nice, Julia, Cristina, Paulo, Horacio, Gilson, cunhados,
cunhadas e sobrinhos;
Aos Professores Dr. Alvimar José da Costa e Dr. Gilson Pereira de Oliveira, pela
oportunidade concedida, apoio e amizade;
Aos amigos do CPPAR Danilo da Matta, Alexandre Fortunato, Ana Lúcia, Ariadne,
Danieli, Edimilson, Matheus, Gabriel (Azeitona), João (Vacilão), Fernando (Reco-
reco), Talita (Horacio), Luiza e Daniel (Sasa);
Aos amigos de casa, Adriano, Meire, Patrícia, Tricia, Eliete, Joãozinho, Mateus,
Alex, Paula, Karina, Nancy, Stael, Maria Banzatto, Elaine Roveri e Carlinhos,
Marlei, Alexandre, Cacá, Jaiminho, Lais, Geórgia, Sofia, Moema Ogasawara e
Lucia Padilha;
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS .................................................................................. ii
LISTA DE TABELAS ................................................................................. iii
RESUMO ................................................................................................... iv
ABSTRACT ............................................................................................... vi
1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 1
2. OBJETIVO ............................................................................................ 3
3. REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 3
3. 1 O carrapato Boophilus microplus................................................. 3
3. 2 O ambiente da pastagem............................................................. 5
3. 3 O fungo Metarhizium anisopliae................................................... 6
3. 4 Controle biológico........................................................................ 8
4. MATERIAL E MÉTODOS 12
4. 1 Local de desenvolvimento do projeto........................................... 12
4. 2 Pastagem, parasito e hospedeiro................................................ 14
4. 3 O fungo Metarhizium anisopliae.................................................. 15
4. 4 Preparo da suspensão conidial................................................... 16
4. 5 Aplicação da suspensão.............................................................. 19
4. 6 Avaliação dos hospedeiros.......................................................... 21
4. 7 Avaliação da infestação de larvas na pastagem..........................
21
4. 8 Avaliação da ocorrência do fungo na gramínea e no solo...........
21
4. 9 Atividade do fungo “in vitro”.........................................................
23
4.10 Análise estatística dos dados......................................................
23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 24
5. 1 Bioensaios para a recuperação da virulência do fungo................ 24
5.2 Aplicação da suspensão do fungo na pastagem de B.
decumbens..................................................................................... 24
5.3 Aplicação da suspensão do fungo em teleóginas de B. microplus
em laboratório................................................................................ 32
6. CONCLUSÕES................................................................................... 34
7..REFERÊNCIAS.................................................................................. 35
ii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1. Umidades relativas médias ocorridas no município de
Uberlândia no período em que a pastagem foi
pulverizada............................................................................ 13
Figura 2. Temperaturas médias ocorridas no município de
Uberlândia no período em que a pastagem foi pulverizada.. 13
Figura 3. Precipitações médias ocorridas no município de Uberlândia
no período em que a pastagem foi pulverizada.................... 14
Figura 4. Remoção dos conídios de Metarhizium anisopliae do arroz
e desagregação das cadeias de conídios para formar uma
suspensão a ser aplicada na pastagem................................ 17
Figura 5. Coagem da suspensão conidial de Metarhizium anisopliae
em tecido de algodão............................................................ 18
Figura 6. Acondicionamento da suspensão de Metarhizium
anisopliae até o momento da pulverização........................... 18
Figura 7. Aplicação da suspensão conidial de Metarhizium anisopliae
na pastagem de Brachiaria decumbens com pulverizador
de barra................................................................................. 20
Figura 8. Ocorrência de Metarhizium anisopliae na haste de
Brachiaria decumbens em avaliações realizadas no 1o, 7o e
14o após cada pulverização com o fungo. No 1o dia após a
10a pulverização a avaliação não foi efetuada em
conseqüência de forte chuva................................................. 25
Figura 9. Ocorrência de Metarhizium anisopliae no solo da pastagem
em avaliações realizadas no 1o, 7o e 14o após cada
pulverização com o fungo. Após a 8a e 9a pulverizações
não se encontrou este isolado no solo.................................. 27
iii
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1. Número de fêmeas ingurgitadas de Boophilus microplus
obtido no procedimento de randomização dos bovinos
naturalmente infestados na pastagem de Brachiaria
decumbens.......................................................................... 15
Tabela 2. Seqüência e data das pulverizações, intervalo entre
pulverizações e concentrações das suspensões conidiais
de Metarhizium anisopliae aplicadas na pastagem de
Brachiaria decumbens......................................................... 19
Tabela 3. Mortalidade de teleóginas de Boophilus microplus obtida
nos bioensaios realizados para recuperação da virulência
do isolado E9 de Metarhizium anisopliae............................ 24
Tabela 4. Densidade populacional do isolado selvagem de
Metarhizium sp. encontrado no solo da pastagem durante
o período experimental........................................................ 27
Tabela 5. Larvas do carrapato Boophilus microplus encontradas por
metro quadrado de gramínea após doze pulverizações da
pastagem de Brachiaria decumbens com Metarhizium
anisopliae............................................................................. 29
Tabela 6. Fêmeas do carrapato Boophilus microplus encontradas
nos bovinos após doze pulverizações da pastagem de
Brachiaria decumbens com Metarhizium anisopliae............ 31
iv
1. INTRODUÇÃO
2. OBJETIVO
O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da aplicação de M.
anisopliae em pastagem de B. decumbens naturalmente infestada, submetida ao
pastejo com bovinos, visando o controle do carrapato B. microplus.
3. REVISÃO DE LITERATURA
4 MATERIAL E MÉTODOS
100
90
Umidade Relativa (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª
Jul/06 Ago/06 Ago/06 Set/06 Out/06 Nov/06 Nov/06 Dez/06 Jan/07 Fev/07 Mar/07 Mar/07
Pulverização
U.R.
30
25
Temperatura (°C)
20
15
10
0
1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª
Jul/06 Ago/06 Ago/06 Set/06 Out/06 Nov/06 Nov/06 Dez/06 Jan/07 Fev/07 Mar/07 Mar/07
Pulverização
Temperatura
160
140
120
Precipitação (mm)
100
80
60
40
20
0
1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª
Jul/06 Ago/06 Ago/06 Set/06 Out/06 Nov/06 Nov/06 Dez/06 Jan/07 Fev/07 Mar/07 Mar/07
Pulverização
Precipitação
produção em massa, segundo metodologia descrita por LEITE et al. (2003). Sacos
contendo 1 kg de arroz seco com o fungo crescido, recebidos da empresa, foram
mantidos a –20 ºC até o momento do uso.
Durante o período em que ocorreram as pulverizações foram feitas duas
produções massais. A primeira em junho/julho de 2006, utilizada até a 5a
pulverização, e a segunda em outubro/06, usada da 6a até a 12a pulverização.
Figura 6. Acondicionamento da
suspensão de Metarhizium anisopliae
até o momento da pulverização.
9
11 pulverizações, quantidade de conídios que variaram entre 1,06 a 1,47 x 10
conídios viáveis por metro quadrado de pasto, e apenas na 6a pulverização esta
quantidade foi de 0, 91 x 108 conídios por metro quadrado do pasto
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1 dia após
-1
25000 7 dias após
14 dias após
U.F.C. por haste de gramínea
20000 Controle
15000
10000
5000
0
1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª
Pulverização
1 dia após
-1 8000 7 dias após
14 dias após
U.F.C. por grama de solo
7000
Controle
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
1ª 2ª 3ª 4ª 5ª 6ª 7ª 8ª 9ª 10ª 11ª 12ª
Pulverização
maioria das vezes, com intervalos de cerca de vinte e um dias, havia a expectativa
de se obter um possível efeito cumulativo aumentando a população do fungo na
gramínea e, conseqüentemente, reduzindo no número de larvas infestantes na
pastagem. No entanto, tal fato não ocorreu como mostra o resultado expresso na
Tabela 5, pois as análises de variância não demonstram diferenças significativas
entre o número de larvas infestantes encontrado no pasto tratado com o fungo e
no pasto controle.
Segundo GARCIA et al. (2003), M. anisopliae iniciou o processo de
penetração e colonização da larva de R. sanguineus em até 2 dias após sua
adesão ao tegumento. Desse modo, a pequena sobrevivência do fungo na
pastagem, seja pelo efeito da radiação UV ou pela remoção de conídios ou efeito
deletério provocado pelas chuvas, parece ter sido o fato que mais contribuiu para
o resultado. Além disso, a concentração (107 con. viáveis mL-1) e o volume de
suspensão aplicado (66,67 mL m-2) podem não terem sidos adequados para
deixar sobre a gramínea quantidade suficiente de conídios para promover a
infecção das larvas.
CASTRO et al. (1999) não encontraram diferença no número de larvas
recuperadas em canteiros de B. decumbens tratados com suspensões entre 105 a
1010 con. mL de M. anisopliae, mas concluíram que uma única pulverização não foi
suficiente para eliminar as larvas do carrapato. Avaliando a ação de M. anisopliae
aplicado em pastagem de B. decumbens infestada com larvas de B. microplus,
BITTENCOURT et al. (2003) verificaram redução de 17,9 e 17,4% no número de
larvas presentes na gramínea com a aplicação respectiva de 107 e 109 con. mL-1
no primeiro ensaio, de 22,53 e 52,26% no segundo, e de 37,84 e 53,78% no
terceiro ensaio. BASSO et al. (2005) obtiveram uma redução respectiva de 87 e
94% no número de larvas infestantes em pastagens de B. brizantha e do híbrido
Tifton 85, artificialmente infestadas com téleoginas de B. microplus. Entretanto, foi
efetuada apenas uma aplicação do fungo em canteiro de 1 m2, usando 200 mL de
suspensão
29
Tabela 5. Larvas do carrapato Boophilus microplus encontradas por metro quadrado de gramínea, após doze pulverizações da pastagem de Brachiaria
Tratamento Pulverização
Controle 32,1667A 24,8167 A 122,7167 A 181,7500 A 30,5667 A 0,0000 A 31,0667 A 5,1500 A 6,3167 A 0,7167 A 1,5167 A 55,1500 A
M. anisopliae 5,3000 A 25,0000 A 74,1833 A 89,6000 A 35,0333 A 0,5833 A 5,1333 A 12,600 A 5,5167 A 7,8500 A 13,4000 A 59,8000 A
Teste F 0,54 NS 0,20 NS 5,90 * 2,58 NS 1,06 NS 1,00 NS 0,73 NS 1,30 NS 0,20 NS 2,33 NS 0,66 NS 0,54 NS
dms (%) 0,3734 0,4142 0,6825 0,8263 0,3657 0,7020 0,3630 0,3286 0,2415 0,2117 0,2486 0,5768
5 1,2250 A 29,5250 A 137,9500 A 119,4250 A 58,1250 A 0,8750 A 2,0500 A - 9,2750 A 2,2250 A 0,6000 A 40,1000 A
12 43,3250 A 13,6250 A 27,1750 A 181,3000 A 59,7250 A 0,0000 A 8,6000 A 14,5250 A 0,5750 A 2,2250 A 0,7000 A 91,2500 A
19 11,6500 A 31,5750 A 130,2250 A 106,3000 A 0,5500 A 0,0000 A 43,6500 A 3,2250 A 7,9000 A 8,3750 A 21,0750 A 41,0750 A
NS NS NS NS NS NS NS NS NS
Teste F 2,04 0,05 2,55 0,83 2,98 1,00 2,05 0,35 0,94 0,38 NS 3,52 * 2,64 NS
dms (%) 0,4671 0,5719 0,8935 0,8871 0,5830 0,1015 0,4698 0,3700 0,3500 0,3007 0,3087 0,6786
Teste F para P x S 1,64 NS 2,09 NS 0,40 NS 0,32 NS 0,25 NS 1,00 NS 0,14 NS 0,31 NS 2,41 NS 0,01 NS 0,52 NS 1,52 NS
C.V. (%) para parcelas 52,63 53,65 66,11 70,75 50,28 11,67 50,68 38,96 36,23 32,59 37,43 67,94
C.V. (%) para subparcelas 45,52 51,21 59,84 52,51 55,42 11,67 45,35 43,86 36,31 32,01 32,14 55,26
Médias em valores originais, mas análise estatística realizada com dados transformados em Ln de (x+5).
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. NS: não significativo; * e **: significativo a 5% e 1% de probabilidade,
respectivamente. P: parcela principal = pastagem; S: parcela secundária = tempo. C.V.: coeficiente de variação.
30
com concentração de 108 con. mL-1, e não havia bovinos para permitir a
continuidade do ciclo do carrapato.
O resultado obtido neste trabalho está congruente com o encontrado por
CASTRO et al. (1999) mas diverge bastante do obtido por BITTENCOURT et al.
(2003) e BASSO et al. (2005). Contudo existem diferenças substanciais quanto ao
tipo, dimensões e metodologias empregadas nos trabalhos que dificultam
sobremaneira as comparações. Os trabalhos realizados por esses autores foram
feitos em canteiros experimentais com pequenas areas, poucas aplicações do
fungo (de uma a três no máximo), as avaliações foram feitas por curto período de
tempo (dois a três meses no máximo) e sem a presença do hospedeiro do ácaro,
o que impossibilitou o desenvolvimento de seu ciclo biológico tornando-o,
possivelmente, mais suscetível a ação do fungo. Nestes aspectos, as condições
deste trabalho foram mais próximas do que efetivamente ocorre no campo, e a
presença do hospedeiro, permitindo o desenvolvimento do ciclo biológico do
carrapato por algumas gerações, pode ter influenciado substancialmente o
resultado.
De acordo com CORDOVÉS (1997), é necessário controlar a infestação
da pastagem, pois 95% dos carrapatos (fase não parasitária) estão no ambiente e
apenas 5% estão presentes no hospedeiro, sendo que a população de larvas
infestantes pode viver por até 82 dias na pastagem (GAUSS & FOURLONG,
2002). Como 12 pulverizações com o fungo não promoveram a redução da
população de larvas na pastagem, este fato pode explicar que não tenham sido
encontradas diferenças significativa entre as contagens de fêmeas ingurgitadas
realizadas nos bovinos do pasto controle e do pasto tratado (Tabela 6), apesar de
terem sido feitas contagens em dias pré-determinados de acordo com o ciclo
biológico natural do carrapato.
Neste experimento, conduzido por nove meses, as variações encontradas
nas populações de larvas na gramínea e fêmeas nos bovinos, tanto no pasto
tratado como no controle, e ainda, de um em relação ao outro, podem ser
atribuídas ao ciclo biológico do carrapato, pois houve tempo e condições
suficientes para que o ciclo se completasse por pelo menos duas ou três vezes
(CORDOVÉS, 1997). O fungo foi encontrado na haste da gramínea e também no
solo, onde as fêmeas ingurgitadas
31
Tabela 6. Fêmeas do carrapato Boophilus microplus encontradas nos bovinos após doze pulverizações da pastagem de Brachiaria decumbens com
Metarhizium anisopliae .
Tratamento Pulverização
a a a a a a a a a a a a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Controle 41,55 A 25,37 A 44,60 A 75,40 A 75,17 A 25,80 A 55,53 A 81,78 A 34,2 B 112,48 A 89,90 A 168,15 A
M. anisopliae 42,13 A 18,33 A 56,80 A 79,53 A 59,13 A 34,50 A 53,93 A 67,80 A 64,90 A 111,07 A 92,00 A 153,83 A
Teste F 0,00 NS 2,15 NS 0,58 NS 0,00 NS 1,78 NS 1,16 NS 0,00 NS 1,72 NS 8,36** 0,72 NS 0,05 NS 0,67 NS
dms (5%) 1,30 1,03 1,68 2,29 1,85 1,25 1,84 1,35 1,50 2,09 1,89 2,31
17 58,54 A 21,58 B 39,17 C 61,00 B 77,75 AB 46,08 A 24,50 D 128,08 A 60,13 A 118,50 A 127,75 A 155,63 AB
19 54,00 A 15,08 B 42,33 BC 62,75 B 83,91 A 29,08 BC 40,67 C 111,58 A 71,08 A 103,83 A 67,79 C 187,63 A
21 40,25 B 18,42 B 54,17 AB 89,75 A 69,42 AB 38,33 AB 49,25 C 55,75 B 41,63 B 129,04 A 82,63 BC 156,92 AB
26 34,92 B 23,75 AB 58,17 A 86,58 A 63,00 B 25,83 C 68,58 B 40,58 B 38,75 B 120,13 A 80,71 BC 165,96 AB
33 21,50 C 30,42 A 59,67 A 87,25 A 41,67 C 11,42 D 90,67 A 37,96 B 36,17 B 112,38 A 95,88 B 138,83 B
Teste F 27,82** 3,85** 5,68** 9,02** 14,75** 40,99** 39,02** 33,42** 17,90** 1,80 NS 12,10** 4,27**
dms (5%) 0,88 1,00 1,12 1,15 1,03 0,78 1,02 1,60 1,02 1,34 1,30 1,30
Teste F para P x S 0,08 NS 4,62** 0,48 NS 3,41* 3,48* 2,44 NS 6,25** 0,15 NS 5,23** 4,09** 3,90** 1,60 NS
C.V. (%) para parcelas 55,12 61,10 65,21 72,45 62,25 63,76 70,27 43,74 59,66 52,7 54,54 49,33
C.V. (%) para subparcelas 17,62 27,91 20,51 17,17 16,31 18,6 18,33 24,48 19,12 15,92 17,65 13,12
Médias em valores originais, mas análise estatística realizada com dados transformados em raiz de (x+1).
Médias seguidas de mesma letra maiúscula na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. NS: não significativo; * e **: significativo a 5% e 1% de probabilidade,
respectivamente. P: parcela principal = pastagem; S: parcela secundária = tempo. C.V.: coeficiente de variação.
32
6. CONCLUSÕES
7. REFERÊNCIAS
BASSO, L.M.; MONTEIRO, A.C.; BELO, M.A. de A.; SOARES, V.E.; GARCIA,
M.V.; MOCHI, D.A.. Controle de larvas de Boophilus microplus por Metarhizium
anisopliae em pastagens infestadas artificialmente. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, Brasília, v.40, n.6, p.595-600, 2005.
BRAGA, G.U.L.; FLINT, S.D.; MILLER, C.D.; ANDERSON, A.J.; ROBERTS, D.W.
Variability in response to UV-B among species and strains of Metarhizium isolated
from sites at latitudes from 61oN to 54oS. Journal of Invertebrate Pathology, San
Diego, v.78, n.2, p.98-108. 2001a.
FARGUES, J.; GOETTEL, M.S.; SMITS, N.; OUEDRAOGO, A.; VIDAL, C.;
LACEY, L.A.; LOMER, C.J.; ROUGIER, M. Variability in susceptibility to simulated
sunlight of conidia among isolates of entomopathogenic hyphomycetes.
Mycopathologia, Amsterdam, v.135, p.171-181, 1996.
GARCIA, M.V. MONTEIRO, A.C.; SZABÓ, M.P.J.; PRETTE, N.; BECHARA, G.H.
Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by
Metarhizium anisopliae as revealed by scanning electron microscopy and
histopathology. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v.36, n.4, p.368-
372, 2005.
GOETTEL, M.S.; INGLIS, G.D.; WRAIGHT, S.P. Fungi. In: Field manual of
techniques in invertebrate pathology. Kluver Academic Publishers. Netherlands.
2000, cap.4, p.255-282, 2000.
GRISI, L.; MASSARD, C.L.; MOYA BORJA, G.E.; PEREIRA, J.B. Impacto
econômico das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A Hora
Veterinária, Porto Alegre, v.21, n.125, p.8-10, 2002.
KAAYA, G.P.; MWANGI, E.N.; OUNA, E.A. Prospects for biological control of
livestock ticks, Rhipicephalus appendiculatus and Amblyomma variegatum using
the entomopathogenous fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.
Journal of Invertebrate Pathology, San Diego, v.67, n.1, p.15-20, 1996.
41
KISSMANN, K.G. Plantas infestantes e nocivas. São Paulo, BASF, 1997. v.2,
825p.
LEITE, J.G.; BATISTA FILHO, A.; ALMEIDA, J.E.M.; ALVES, S.B. Produção de
fungos entomopatogênicos. 1. Ed. Ribeirão Preto: A. S. Pinto, 2003, 92p.
PAIÃO, J.C.V.; MONTEIRO, A.C.; KRONKA, S.N. Susceptibility of the cattle tick of
the Boophilus microplus (Acari:Ixodidae) to isolates of the fungus Beauveria
bassiana. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v.27, n.2, p.245-
251, 2001.
PINTO, A.S.; BARRETO, C.C.; SCCHRANK, A.; ULHOA, C.J.; VAAINSTEIN, M.H.
Purification and characterization of an extracellular chitinase from the
entomopathogen Metarhizium anisopliae. Canadian Journal of Microbiology,
v.43, p.322-327, 1997.
RATH, A.C.; KOEN, T.B.; YIP, H.Y. The influence of abiotic factors on the
distribution and abundance of Metarhizium anisopliae in Tasmanian pasture.
Mycological Research, Cambridge, v.96, n.5, p.378-384, 1992.
SONENSHINE, D.E. Biologia of ticks. New York: Oxford University Press, 1993,
316p.
WALKER, J.B.; KEIRANS, J.E.; HORAK, I.G. The Genus Rhipicephalus (Acari,
Ixodidae) a guide to the brown ticks of the world. Cambridge, Cambridge
University Press, 2000. p.643.