TEMA 5: MUESTREO: PLANES O PROGRAMAS DE MUESTREO

MICROBIOLÓGICO.

Conceptos.
Una vez que se ha decidido analizar microbiológicamente un producto, se puede analizar en su
totalidad, o bien una muestra del mismo. La opción adecuada es tomar una muestra y
analizarla, ya que en el otro caso nos quedaríamos sin producto que comercializar. En este
punto surgen 2 preguntas: ¿Cuál debe ser el tamaño de la muestra? y ¿Qué conclusiones se
pueden extraer de los resultados? Para responder a estas dos preguntas surgen los planes de
muestreo, que son procedimientos para la elección de un número de muestras adecuado, el
análisis de los mismos y la interpretación adecuada de los resultados. Los resultados obtenidos a
partir de la parte analizada (muestra) se usan para extraer conclusiones acerca de todo el
producto.

• Lote: en condiciones ideales, es una cantidad de producto o de unidades producidas y

manipuladas bajo condiciones uniformes. Es decir, un lote debe componerse de un
producto obtenido con las mínimas variaciones posibles y bajo un mismo proceso (por
ejemplo, el producto total producido en una empresa durante un día).
• Muestra representativa: es una porción tomada de un lote que debe reflejar, tanto como
sea posible, la composición y características de ese lote. Es decir, debe tener las mismas
características físico-químicas del lote completo.
• Unidad de muestra: porción de un lote tomada de forma aleatoria. El conjunto de todas las
unidades de muestra constituye la muestra representativa.
• Unidad analítica: porción de la unidad de muestra que se utiliza en el análisis de
laboratorio. Puede ocurrir que la unidad analítica sea toda la unidad de muestra.
Ejemplo ilustrativo de una conservera: el lote sería el total de latas producidas durante un día.
Cada lata escogida para el análisis sería una unidad de muestra y el conjunto de todas ellas
(pongamos que cogemos 5) sería la muestra representativa. La unidad analítica sería la porción
que tomo del contenido de una lata para su análisis.
La pregunta que surge ahora es: ¿Qué procedimiento debo seguir para tomar una muestra
representativa del lote? Es muy importante evitar los sesgos y obtener un número de unidades de
muestra suficiente para confiar en el resultado final. A este número de unidades de muestra se le
denomina tamaño de la muestra representativa y constituye uno de los mayores problemas en
los análisis microbiológicos. Esto se debe a que, cuanto mayor ser al número de unidades de
muestra, mayor será la confianza en el resultado, pero también aumentará el coste, el tiempo y
la pérdida de producto en el análisis. Por este motivo se ha llegado a un consenso en cuanto al
número de unidades de muestra que se deben tomar:

• Productos que proceden de empresas cuyo control se desconoce: el número de unidades

de muestra se debe corresponder con la raíz cuadrada del número total de unidades que
forman el lote.
• Productos sometidos a un control regular: es suficiente con analizar 5-10 unidades de
muestra de cada lote.

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Muestreo aleatorio.
¿Cómo elegir las muestras dentro de cada lote? El muestreo aleatorio es el método usado
universalmente para evitar subjetividades. Consiste en separar del lote un número de unidades
de muestra empleando los números aleatorios, de manera que cada elemento del lote tenga la
misma probabilidad de ser elegido.
Una vez establecido el número de muestras que debo tomar, se numeran todas las unidades
que componen el lote y se escogen aquellas que llevan el número obtenido a partir de una
tabla de números aleatorios. Dicha tabla está integrada por columnas y filas de dígitos entre 0 y
9. Se han generado dichos dígitos aleatoriamente por cálculos estadísticos, de forma que
cualquier dígito es completamente independiente de los que lo rodean. Se procede de la
siguiente forma: se elige una página de la tabla de números aleatorios y, sin mirar, se marca un
punto en la página con un lápiz. Una vez hemos marcado, cogemos cuantos dígitos sean
necesarios para todo el lote. El dígito más cercano a la señal del lápiz será el primer dígito del
número de la primera muestra elegida para el análisis. Para obtener el número completo de la
muestra se miran los números que siguen al primero, tantos como sea necesario para numerar
todos los envases del lote.
Ejemplo: tenemos un lote con 200 unidades de muestra. Las numeramos, cogemos una página
de la tabla de números aleatorios y hacemos la marca con el lápiz. Así tenemos ya el primer
número de los dígitos con los que está marcada la lata. Ya que el lote tiene un número máximo
de 3 cifras, tenemos que mirar los dos números que siguen al que hemos marcado para
determinar cuál será la primera unidad de muestra. Los números de las demás son los que
aparecen inmediatamente debajo en la tabla de números aleatorios:

Planes o programas de muestreo.

La toma de muestras no es sólo el procedimiento de tomar un número de unidades de muestra
de un lote, sino que su objetivo es suministrar información de las características microbiológicas
de todo el lote con sólo la información de la muestra, lo que nos permitirá aceptar o rechazar el
lote completo. Por este motivo, este tipo de muestreos se denominan muestreos de aceptación.
Es decir, después del análisis de las unidades de muestra se van a obtener una serie de
resultados que se compararán con los que están fijados en los criterios, y en función de esto, se
decide si se acepta o se rechaza el lote completo. Todo este proceso se denomina plan o
programa de muestreo. Es decir, un plan de muestreo establece el procedimiento de muestreo y
el criterio de decisión.

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Los planes de muestreo se clasifican en varios tipos:

• Planes de muestreo por atributos (de dos clases y de tres clases).

• Planes de muestreo por variables.
Ambos tipos pueden ser, a su vez, simples, dobles o múltiples. Los que más se aplican son los
planes de muestreo por atributos.

Planes de muestreo por atributos de dos categorías.

Son los más sencillos. Las muestras se van a clasificar en dos clases: aceptables y rechazables,
dependiendo del resultado del análisis. Este resultado puede ser la presencia o ausencia de un
determinado microorganismo, o bien el número de determinados microorganismos que hay en
la muestra, que puede ser mayor o menor que el especificado en el criterio (si el criterio
especifica que en una muestra no puede haber más de 10 ufc y el análisis da un número
superior, la muestra se rechaza). Un plan de muestreo por atributos de dos categorías se define
por 3 parámetros:

1. n: es el número de unidades de muestra que se requieren para hacer el análisis.

2. c: es el número de aceptación, que es el número máximo permisible de unidades de
muestra que pueden dar resultados insatisfactorios en el análisis, es decir, que sean
rechazables (presencia o ausencia de un determinado microorganismo, o un recuento de
un determinado microorganismo que supere una concentración preestablecida; esta
concentración viene determinada por el tercer parámetro, m).
3. m: es la cifra de recuento, por encima de la cual la muestra se considera insatisfactoria o
deficiente. Este valor sería igual a 0 cuando se hace simplemente una prueba de presencia
o ausencia de un determinado microorganismo.

Ejemplo: n=5, c=2 y m=102. Se toman 5 unidades de muestra del lote para analizar y en los
resultados obtenidos, si en más de 2 muestras obtenemos un resultado insatisfactorio, es decir, si
el recuento de microorganismos es mayor a 102, el lote completo es rechazado.
Ejemplo: n=10, c=1, m=1000. Si tomamos 5 unidades de muestra del lote para analizar y en los
resultados obtenidos, si en más de 1 muestra obtenemos un resultado insatisfactorio, es decir, si el
recuento de microorganismos es mayor a 1000, el lote completo es rechazado.
Ejemplo: n=5, c=0, m=10. Si tomamos 5 unidades de muestra del lote para analizar, ninguna de
las unidades de muestra puede tener un recuento mayor de diez para que podamos aceptar el
lote completo.
Ejemplo: n=5, c=2, m=0. En este caso no permito que existan microorganismos. Presencia-
ausencia.

Curva característica de operación (OC).

La probabilidad de aceptar o rechazar un lote siguiendo un plan de muestreo determinado se
puede calcular aplicando los cálculos de una distribución binomial. Para ello necesitamos
conocer el porcentaje de muestras deficientes reales que contiene el lote. Si lo conocemos, se
puede hacer una representación gráfica, en la que se representan las probabilidades de
aceptar ese lote frente a los porcentajes de muestras defectuosas contenidas en él. A dicha
representación se le denomina curva característica de operación o de funcionamiento y nos
sirve para determinar el riesgo que se asocia a un determinado plan de muestreo. Es decir,

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como no se examina el lote completo, siempre hay el
peligro de rechazar un lote aceptable, o de aceptar uno
que sería rechazable.

En esta gráfica, la línea horizontal representa el

porcentaje de muestras malas que se supone que hay en
un lote. El área bajo la línea representa la probabilidad
de que el lote sea aceptado, mientras que el área sobre
la línea representa la probabilidad de que el lote sea
rechazado.
Los planes de muestreo pueden ser más o menos estrictos
en función de n y de c:

ORIGINAL MÁS SEVEROS MENOS SEVEROS

n=10 y n=15 y c=2 n=5 y c=2
c=2 n=10 y c=1 n=10 y c=3

De esta forma, al aumentar n aumenta la severidad, de la misma forma que si disminuyo c o m:

Riesgos.
- AQL (nivel de calidad aceptable): porcentaje de defectuosos o porcentaje de defectos
más alto del proceso pero que se consideran aceptables.
- RQL (nivel de calidad rechazable): porcentaje de defectuosos o porcentaje de defectos
más alto que el consumidor está dispuesto a tolerar.

En todo plan de muestreo siempre existe la posibilidad de aceptar lotes de mala calidad y
rechazar lotes de buena calidad, por eso se identifican 2 tipos de riesgos:

• Riesgo α: riesgo del productor o proveedor, que se define como la probabilidad de que un
lote de calidad aceptable sea erróneamente rechazado.
Pac (AQL) = 1 − ()
• Riesgo β: riesgo del consumidor o comprador, que es la probabilidad de que
equivocadamente se acepte un lote que en realidad sería rechazable.
Pac (RQL) = ()

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Planes de muestreo por atributos de tres clases.
Estos programas fueron ideados para las situaciones en las que la calidad de un producto puede
dividirse en 3 categorías, dependiendo de la concentración de microorganismos en las unidades
de muestra. Estas clases son: aceptable, dudosamente aceptable y rechazable.
Debido a ellas, en estos planes se usan siempre los recuentos de microorganismos. Un plan de
muestreo de 3 clases viene definido por 4 parámetros:

1. n: número de unidades de muestra que se deben tomar del lote.

2. M: valor de recuento máximo. Si es sobrepasado por cualquiera de las muestras
examinadas, ya se rechaza automáticamente todo el lote completo.
3. m: valor de recuento que separa la calidad buena de la calidad marginal (regular).
4. c: número máximo de muestras examinadas que se pueden clasificar en la categoría de
dudosamente aceptables antes de que el lote sea rechazado.

Ejemplo: n=5, M=5·102, m=50 y c=2. Se analizan 5 unidades de muestra del lote. Si en cualquiera
de ellas sale un recuento superior a 500 microorganismos, se rechaza el lote completo,
permitiendo que como mucho 2 de ellas tengan un recuento de entre 50 y 500
microorganismos.
(0, m) = Aceptable; (m, M) =Dudoso; (M,∞) = Rechazo.
Ejemplo: n=10, m=1; M=10; c=3. Si en una sola de las 10 analizada me sale hasta 10, rechazo.
Pero permito que hasta 3 e salgan.
Si c=0 no tolero los dudosos.
Curva de operación de un plan de muestreo por
atributos de 3 categorías.
Nos permite calcular la probabilidad de aceptar
un lote conociendo el porcentaje de muestras
deficientes y el porcentaje de muestras
dudosamente deficientes. En este caso, los datos
siguen una distribución trinomial.

Comparación de los programas de dos y tres clases.

Los programas de dos clases no distinguen los valores que se encuentran entre M y m de
aquellos que son superiores a M. Si el número de muestras con valores superiores a m no es
mayor que c, el lote se acepta, sin tener en cuenta cuánto mayor que m es el recuento en las
muestras deficientes. Sin embargo, los programas de tres clases incluyen una subdivisión
adicional (M), lo que permite rechazar lotes directamente cuando el valor del recuento supera a
M.

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Ejemplo: n=5, c=2, m=100.
Algunos de los resultados son 10, 20, 10 4, 50 y 100. Si aceptaríamos el lote, ya que solo hay una
que sobrepasa el 100 y rechazamos cuando como máximo hay dos. Si añadiésemos M=1000 no
aceptaríamos el lote, porque nos permite discriminar lotes con una carga microbiológica
elevada (3º), por lo que el programa de tres categorías sería más exigente que uno de dos
categorías, cuando hay alguna unidad de muestra en el lote que se presenta muy
sobrecargada.
Ejemplo: n=5, c=2, m=10.

• Recuento en las unidades de muestra del lote 1: 10, 106, 200, 1, 0. El lote es rechazado, ya
que el valor del recuento es mayor o igual a 10 en tres de las muestras.
• Recuento en las unidades de muestra del lote 2: 9, 106, 200, 1, 0. El lote es aceptado, ya
que el valor del recuento sólo es mayor que 10 en dos de las muestras.

Si a estos mismos datos de recuento les aplicamos un plan de muestreo de 3 categorías en el

que n=5, c=2, m=10 y M=103, ambos lotes serían rechazados inmediatamente, ya que una de las
unidades de muestra presenta un recuento superior a 103 en ambos casos. De esta forma, los
planes de muestreo con tres categorías son más estrictos que los planes de muestreo con dos
categorías.
Elección del programa de muestreo en función de los objetivos.
La severidad de aplicación de un plan viene determinada principalmente por dos condiciones:

1. El tipo y la calidad de riesgo que conllevan las especies de microorganismos que pueden
estar presentes en el producto.
2. Las condiciones previsibles de manejo y consumo que se haga del producto.

En función de estos dos parámetros, se establecen 15 categorías de riesgo de los programas de

muestreo, del menos severo al más severo:

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Determinación de los valores de m y M.
• m es la cantidad aceptable y esperable que un microorganismo puede alcanzar en un
producto. Si el microorganismo analizado es un patógeno, m puede ser 0 o un valor de
recuento muy bajo que corresponda al límite de detección que tengamos.
• M es el nivel de contaminación de riesgo o inaceptable, alcanzado debido al uso de unas
prácticas higiénicas totalmente deficientes o condiciones inadecuadas de
almacenamiento.

Elección de n y c.
Estos dos parámetros son los principales que nos permiten determinar la rigurosidad del plan. En
las categorías más rigurosas, n es alto y c es bajo, mientras que en las más suaves sucede todo lo
contrario.

Normas generales para el muestreo.

Como la finalidad del muestreo en microbiología es obtener una muestra que sea representativa
de las condiciones higiénicas originales de todo el lote, es necesario que las muestras tomadas
reúnan las mismas condiciones que tenía el lote en el momento de ser muestreado (debe, por lo
tanto, reunir tanto las características de calidad y cantidad de microorganismos originales del
lote), de ahí que sean necesarias unas pautas para tomar la muestra de forma correcta,
evitando cualquier tipo de contaminación posterior a la toma de muestras.

Material de muestreo.
• Envases para la toma de muestras: tienen que estar perfectamente limpios, secos, estériles
y sin fugas. Su tamaño tiene que guardar relación con la muestra que se vaya a tomar y
deben ser herméticos e inaccesibles a cualquier contaminación posterior a su esterilización.
Se pueden utilizar envases de vidrio de boca ancha, envases de plástico esterilizable,
bolsas de plástico esterilizable o envases metálicos.
• Instrumentos para la apertura de envases: tijeras, pinzas, cuchillos, sondas, taladros,
cucharas, sierras y otros. Siempre deben estar estériles.
• Etiquetas y material para marcar: etiquetas de cartulina, etiquetas adhesivas de papel,
lápiz graso, rotuladores y bolígrafo.

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 • Equipo de esterilización: autoclave pequeño, horno y mechero.
• Refrigeración: Es muy importante. Toda muestra que se haya tomado, debe ser mantenida
en refrigeración hasta que sea realizado el análisis para que el microorganismo no crezca
pero que tampoco muera. Podemos usar neveras portátiles, cajas de plástico aislantes
(para muestras refrigeradas y congeladas) y congelador portátil.
• Líquidos desinfectantes: alcohol etílico al 70%, disolución de hipoclorito sódico a 1g/l (lejía)
y algodón hidrófilo.
• Bombas para muestreo: bombas peristálticas de pequeño caudal, bombas centrífugas con
motor de gasolina, bombas de pistón accionado por aire y bombas eléctricas sumergibles
(sirven para, por ejemplo, muestrear pozos).
• Control de temperatura: termómetro. • Cualquier otro material estéril.
Por tanto, el objetivo del muestreo en microbiología es evitar la contaminación cuantitativa y
cualitativa de una muestra.

Condiciones para el muestreo.

• La persona destinada a hacer el muestreo debe conocer perfectamente su finalidad e
importancia, sobre todo en microbiología (ella misma lleva microorganismos, por lo que
debe de tener mucho cuidado y realizar bien el muestreo).
• A ser posible, las unidades de muestra se tomarán en sus envases originales.
• En ocasiones, las muestras que se recogen son únicas (productos sospechosos de
toxoinfecciones), por lo que hay que expresar las precauciones para no estropear la
muestra.
• El muestreo debe realizarse siguiendo la técnica de muestreo aleatorio, incluido el caso de
las cajas y paquetes.
• Cuando los envases son muy grandes y difíciles de transportar, se toman muestras
representativas de forma aséptica y se pasan a envases estériles más pequeños.
• Los productos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas con material
estéril y pasándolas asépticamente a envases estériles.
• Si son productos líquidos, se agitarán en su envase y se pasarán asépticamente a envases
estériles.
• Se la toma es de agua de un grifo, se desinfecta el mismo (con calor, alcohol, lejía, etc.), se
abre y se desecha la primera porción (o sea, se deja correr y luego se toma la muestra).
• Pozos y depósitos: si se dispone de bomba de captación, se procede como en el caso del
agua canalizada. En caso contrario, se introduce el frasco invertido y se gira hacia arriba. Si
la toma se realiza a gran profundidad se pueden emplear aparatos especiales lastrados.
• Cuando la muestra procede de un agua tratada con desinfectantes clorados o bromados,
hay que eliminar dichos agentes. Para ello, los envases con los que se realiza la toma de
muestras llevan una cantidad de 100mg/l de tiosulfato sódico, que neutraliza su efecto
desinfectante. El objetivo es que estos agentes no sigan actuando en el frasco de
muestreo, de forma que el contenido en microorganismos sea un reflejo fiel de los que hay
cuando el agua es obtenida.
• Si el producto es sólido, se tomarán las muestras en varias zonas y se introducirán en
recipientes estériles.
• Es conveniente anotar la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su
propia temperatura.

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Preparación de la muestra para su envío al laboratorio.
Una vez tomadas las muestras, se empaquetan de forma adecuada y se marcan inmediata y
correctamente. La etiqueta debe llevar una referencia que se corresponda con el informe de
muestreo que la persona debe hacer. En ese informe deben figurar:

• Nombre y dirección de la persona que ha tomado las muestras.

• Nombre y dirección de la persona, empresa, etc. en la que se han tomado las muestras.
• Fecha, lugar y hora en las que se han tomado las muestras.
• Clase de productos.
• Nombre del fabricante, importador, vendedor, etc.
• Razón por la que se realiza el muestreo.
• Número, tamaño y marca de las unidades que forman el lote.
• Forma de transporte. Punto de origen y lugar de destino.
• Fecha de embarque y llegada del lote.
• Método de muestreo realizado.
• Temperatura del producto en el momento del muestreo.
• Temperatura ambiental de almacenamiento.
• Forma de transporte y condiciones de envío de las muestras al laboratorio.

Transporte y conservación de las muestras.

El espacio de tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el comienzo del análisis en el
laboratorio debe ser lo más corto posible, para que en los resultados de los análisis quede
reflejada, cualitativa y cuantitativamente, la calidad del producto en el momento de ser
muestreado. Si las muestras no se pueden procesar en la hora siguiente, se guardarán en una
nevera, pero nunca se congelarán, y así se realizará el transporte al laboratorio.

• Si el producto está enlatado o seco, las unidades de muestra pueden transportarse tal
cual, evitando temperaturas de más de 40°C.
• Si el producto está descongelado y es perecedero, se debe enfriar rápidamente hasta 0°C
y mantenerse a esa temperatura durante el transporte. No se debe volver a congelar la
muestra.
• Si la muestra está originalmente congelada, hay que mantener dicho estado hasta el
momento del análisis. En el momento de la analítica se deja descongelar bajo
refrigeración, porque si lo dejásemos a temperatura ambiente, los microorganismos podrían
crecer.

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