Técnicas de PCR en el

diagnóstico clínico

Ana María López Parra

Lab. Genética Forense y Genética de Poblaciones
Departamento de Toxicología y Legislación Sanitaria. Facultad de Medicina. UCM
 Definición

PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Es un método in vitro para la síntesis
enzimática de secuencias específicas de
ADN de cualquier origen.

Se basa en la amplificación exponencial de

una secuencia de ADN (Mullis y Faloona,
1987)
 Historia

Técnicas previas a la PCR

Técnica de Southern blotting
 Historia

Descubrimiento de la PCR
Inventada por Kary Mullis en 1983.
Premio Nobel de Química en 1993.
 Principios

Principios de la técnica
1. Desnaturalización Renaturalización.

2. Hibridación.

3. Replicación.
 Principios

Desnaturalización
Ácidos Nucleicos se desnaturalizan por agentes químicos o físicos.

¾Rotura de las puentes de hidrógeno

entre pares de bases.
¾Interacciones hidrofóbicas entre las
bases.

¾Perdida de estructura 2ª.

¾No se altera la estructura 1ª al no romperse los
enlaces covalentes.
 Principios

Hibridación
¾ La hibridación está basada en el
proceso de renaturalización de 2
cadenas sencillas.
¾ El apareamiento se basa en la
complementariedad entre las
bases.
 Principios

Replicación
¾A partir de una molécula parental
se sintetizan 2 moléculas de ADN
por una polimerasa
 Componentes

Componentes de la mezcla de
reacción
 Componentes

Componentes de la
mezcla de reacción

• ADN molde
• Cebadores
• Solución Tampón o Buffer de la reacción
• Cl2Mg
• Mezcla de los 4 dNTPs (A, T, C, G)
• Taq polimerasa (Taq pol)
• Agua
 Componentes

ADN molde

• La concentración de ADN depende de las características

de la región a amplificar.
• Puede ser ssADN o dsADN.
• Se puede amplificar a partir de 1 molécula de ADN.
 Componentes

Tampón de reacción

• Otros agentes:
– Dimetilsulfóxido (DMSO) 10% y Detergentes como el
tween 20, laureth 12 (0.1%): agentes
desnaturalizantes.
– Gelatina o Tritón X-100: agentes estabilizantes de la
enzima.
– Seroalbúmina bovina (BSA): aumenta la
especificidad al incrementar la fuerza iónica.
 Componentes

Cl2Mg
• Los iones magnesio actúan como cofactor
de la enzima Taq polimerasa.

Bajo Uniones no
rendimiento especificas

Estabiliza
doble hélice
 Componentes

Cebadores
• Secuencia complementaria a los extremos 3’ de
la región diana, uno en cada hebra.
• Longitud: 18-25 nt.
• Es el factor mas importante para la eficiencia y
la especificidad del proceso
• Deben estar presentes en exceso respecto a
ADN molde (107 veces).

C C G T A G C A
5’-OH 3’-OH
 Componentes

Diseño de Cebadores
•Cebadores no deben tener valores de Tm
(Temperatura de melting) de + de 5°C uno del otro.
•A más contenido GC, mayor Tm.
-Tm = 4(G + C) + 2(A + T).
 Componentes

Diseño de Cebadores
C C G T A G C A
5’-OH 3’-OH

•Mínima Mínima
complementariedad dentro complementariedad entre
del cebador. la pareja de cebadores.

5’-NNNNNNNNNNNGCATGC3’

5’-NNNNNNNNNNNGCA
CGT3’
 Componentes

dNTPs
• dATP, dGTP, dCTP y dTTP.
• Concentraciones iguales.
• Se añaden en exceso (20 y los 200 µM).
 Componentes

DNA polimerasa termoestable

•La enzima fue aislada a partir de
Thermus aquaticus por primera vez
1976.
•Esta bacteria vive en zonas de altas
temperaturas.
•DNA polimerasa termoestable.
Máxima actividad catalítica sobre 75-
80 ºC. (Taq polimerasa sólo 10% activ.
a 37 ºC)

• Carece de actividad
exonucleasa 3´Î5´ (actividad
autocorrectora): 1 error cada
104 nucleótidos
 Componentes

Agua
• Agua libre de nucleasas:
DNAsas y RNAsas.
• Deionizada
• Agua mili-Q grado molecular.
• Estéril.
 Etapas

Etapas del proceso

 Etapas

Desnaturalización
• Calentamiento para la separación de las 2 hebras.
• Temperatura: 85ºC-97ºC.
• Temperatura depende de:
– Composición de bases.
• Duración: 30-120 segundos
 Etapas
Hibridación de cebadores
• Unión de los cebadores a las dos cadenas de ADN
monocatenario
• Temperatura: 37ºC-65ºC
• Duración: 10-120 segundos
• Depende de:
– Composición de bases del cebador.
– La longitud del cebador.
 Etapas
Elongación
• Incorporación de los dNTP por medio de la Taq
Polimerasa a partir del extremo 3’ de cada cebador.
• Temperatura depende de la ADN polimerasa
utilizada: 72ºC-75ºC.
• Duración: 1-3 minutos.
 Etapas

Etapas extra
• Etapa previa.
Elevada temperatura:
– Inactivar proteasas y nucleasas.
– Asegurar la desnaturalización completa.

• Etapa final.
Prolongación de la última elongación para
permitir que se completen todos los
amplificados
 ADN en la célula
Etapas extraDNA mitocondrial
Mitocondrias
Cromosoma

DNA nuclear

Región blanco para PCR

Nucleótidos
sencillos
 Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
5’ 3’
5’ 3’
ADN Molde

3’ 5’
3’ 5’

Separación de
las cadenas
(desnaturaliza
ción)

Forward primer

5’ 3’ 5’ 3’

Extensión de los
Unión
cebadores
3’ 5’
3’ 5’ cebadores
(annealing) Reverse primer
 La PCR copia ADN de forma
exponencial tras diversos ciclos

Región original de ADN “diana”

Ciclo
Thermal
térmico
Térmico
cycle

En
En32
32ciclos
cicloscon
conuna
unaeficiencia
eficienciadel
del100%
100%sese
crean
crean1.07
1.07billones
billonesde
decopias
copiasdedela
laregión
regióndiana
diana
de
deADN
ADN
 Características

Grado de amplificación
Nº de ciclos Nº total Nº de copias Nº de copias Dianas/total
realizados de copias “largas” diana
1 2 2 0 0
2 4 4 0 0
3 8 6 2 25%
4 16 8 8 50%
5 32 10 22 69%
10 1.024 20 1.004 98%
20 ~10 6 40 ~10 6 99,996%
40 ~10 12 80 ~ 1012 100%
X 2X 2X 2X – 2X

Sólo a partir del 3er ciclo aparecen

copias exactas de la diana
 Características

Características del proceso

* Rendimiento.
No es
completo

N = N0*(1+R)X

N Número de copias obtenidas

N0 Número de moléculas iniciales
R rendimiento de cada ciclo expresado en tanto por uno
X número de ciclos
 Características

Características del proceso

* Duración de cada etapa y número de
ciclos.
94 oC 94 oC 94 oC 94 oC
Temperatura

72 oC 72 oC 72 oC

60 oC 60 oC 60 oC
1 Ciclo

Tiempo

Duración de cada etapa Número de ciclos

 Características

Características del proceso

* Especificidad.
Depende de los cebadores y las condiciones
de la hibridación.

Kb
0
2000 1857
500
1000 1058
929 1000
500
383 2000
0
Ladder Amplificaciones Kb

Uniones inespecíficas
 Características

Características del proceso

•Capacidad de detección.

Puede detectar una única molécula de ADN

en casi cualquier tipo de muestra

Peligro de
contaminación
 Características

Características del proceso

•Fidelidad.

Depende de si la enzima posee

actividad 3’ exonucleasa.

Nombre 3'->5‘ Exo Origen Propiedades

Thermus aquaticus Vida media a 95º C 100 min. Alta

Taq No tasa de error (10-4 a 2.10-5 por
pb)

Pyrococcus furiosus Baja tasa de error. 1-2.10-6 por

Pfu Sí pb)

Thermococcus litoralis Vida media a 95º C aprox. 7 horas

Vent (Tli) Sí
 Termociclador

Automatización de la PCR
 Aplicaciones

Aplicaciones de la técnica
• Clonación acelular de fragmentos de ADN
• Detección de secuencias sin purificación previa
• Secuenciación de ácidos nucleicos
• Establecimiento de polimorfismos de secuencia
• Rastreo de mutaciones
• Tipado de ADN para trasplantes
• Diagnostico de enfermedades genéticas
• Resolución de problemas forenses, arqueológicos, estudios
evolutivos
• Producción de sondas
• Producción de frag de ssDNA por PCR asimétrica
• Reconstrucción y amplificación de DNA a partir de muestras
especialmente degradadas
 Ventajas

Ventajas de la técnica

• Puede utilizarse cantidades mínimas de ADN

procedentes de hasta una única célula.
• Puede usarse como templates efectivos ADN
degradado hasta fragmentos de unos pocos cientos
de pares de bases.
• Puede amplificarse grandes cantidades de copias
específicas de manera simultánea mediante PCR
multiplex.
• El DNA contaminante, de origen fúngico o
bacteriano, no amplifica con primers específicos
humanos.
• Existen kits comerciales para PCR muy optimizados.
 Limitaciones

Limitaciones de la técnica
• Alta tasa de errores en la incorporación de
dNTPsÎ0.25% fallos tras 30 ciclos (menos fiable
que la clonación para análisis de secuencia)
• Si se necesitan cantidades aún mayores o se va a
manipular posteriormente es más rentable recurrir a
la clonación (necesario fosforilar el producto de PCR)
• Contaminación.
 Variantes

Variantes de la técnica
 Hot start

Hot start PCR

DNA polimerasa termoestable:

máxima actividad catalítica sobre 75-80 ºC.
 Variantes
Variantes de la PCR
• “Hot start” PCR.
• PCR larga.
• PCR anidada.
• PCR inversa.
• PCR con adaptadores.
• PCR asimétrica.
• PCR transcriptasa inversa.
• Multiplex PCR
• ARMS
• Real Time.
 PCR larga

Long PCR (L-PCR) o Longer

and Accurate PCR (LA-PCR)
• PCR más larga y más exacta
• Regiones diana: 5-40 Kb
• Factor limitante: ausencia de actividad correctora
de la polimerasa Taq.
• Solución: añadir enzima con actividad correctora
(por ejemplo Pfu).
Nombre 3'->5‘ Exo Origen Propiedades

Taq No Thermus aquaticus Vida media a 95º C 100 min.

Alta tasa de error (10-4 a
2.10-5 por pb)
Pfu Sí Pyrococcus furiosus Baja tasa de error. 1-2.10-6
por pb)

Vent (Tli) Sí Thermococcus litoralis Vida media a 95º C aprox. 7

horas
 PCR anidada

PCR anidada o Nested-PCR

• Para incrementar la especificidad.

• Se utiliza un segundo par de cebadores que
hibriden dentro de la región ya amplificada.
• Resultado: Productos de PCR más cortos y más
específicos.
• No amplifican los productos no especificos de la
primera ronda ya que no presentaran la
secuencia de los cebadores de la segunda ronda
 PCR anidada

Nested PCR
Cebadores externos
ADN
1ª PCR

Productos inespecificos

2ª PCR
Cebadores internos

ADN específico
 PCR Inversa

PCR inversa
• Para clonar regiones desconocidas de un ADN en
posición vecinal a secuencias diana conocidas.
• Amplificación de la región externa que flanquea a
los cebadores.
PCR Convencional PCR Inversa
5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’
 PCR Inversa
PCR inversa
Diana restricción Diana restricción
Secuencia conocida

5’ AAGCTT Diana 1 AAGCTT 3’

3’ TTCGAA Diana 2 TTCGAA 5’

A AGCTT 3’
5’ Restricción
3’ TTCGA A 5’

5’ AGCTT Diana 1 A 3’
3’ A Diana 2 TTCGA 5’
 Secuencia conocida PCR Inversa

5’ AGCTT Diana 1 A 3’
Ci
rc 3’ A Diana 2 TTCGA 5’
ula
lig cio
ad n
o y
Diana 1
Cebador 1

Diana 1

Cebador 2
Diana 2
Diana 2
Desnaturalización 1
+Templado 1
3’
5’
AAG C TT
T T CGAA Elongación 1
5’ 3’
Cebador 1

Cebador 2
La elongación continuara igual
que en una PCR convencional
 PCR con adaptadore

PCR con adaptadores

• Para amplificar una región de ADN de secuencia
desconocida.
• Se ligan a sus fragmentos de restricción unos
adaptadores.
PCR Convencional PCR con adaptadores
5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’
 PCR con adaptadore

PCR con adaptadores

Secuencia desconocida

5’ AGCTT A 3’
3’ A TTCGA 5’

Unión de
adaptadores

ADAPTADOR 1 ADAPTADOR 2

5’ GTCCACTGCA AGCTT AAGCTTCTTAGTCAC 3’

3’ CAGGTGACGTTCGA A TTCGA AGAATCAGTG 5’
 PCR con adaptadore

PCR con adaptadores

PCR

Secuencia desconocida

5’ GTCCACTGCA AGCTT AAGCTTCTTAGTCAC 3’

TCAGTG 5’

5’ GTCCAC
3’ CAGGTGACGTTCGA A TTCGA AGAATCAGTG 5’
 PCR asimétrica

PCR asimétrica
• Para generar copias de hebra sencilla.
• Se añaden cantidades muy diferentes de ambos
cebadores.
• Tras los primeros ciclos de PCR un cebador se
agota y con ya suficientes copias del ADN diana,
sólo una de las hebras amplifica.
 RT-PCR

PCR con transcriptasa inversa

• PCR con transcriptasa inversa o reverse
transcriptase.
• Para amplificar RNA a través de la síntesis previa
de su cDNA.
• Es especialmente útil cuando solo se dispone de
pequeñas cantidades de RNA
 RT-PCR
PCR con transcriptasa inversa
mRNA
Transcripción Transcriptasa inversa
inversa dNTPs SÍNTESIS PREVIA
DE cDNA
mRNA
cDNA
Desnaturalización
1

mRNA
+
cDNA
Templado
1
1er CICLO DE
5’ Cebador 1 PCR
cDNA
Elongación
1

5’ Cebador 1
cDNA
 RT-PCR
PCR con transcriptasa inversa
Desnaturalización
2

cDNA 2º CICLO DE
+ PCR
cDNA
Templado
2

cDNA
Cebador 2

Cebador 1
cDNA
Elongación
2

cDNA

mRNA No
amplificada
 Multiplex-PCR

Multiplex PCR
• PCR con multiples pares
de primers lo que da una
serie de productos.
• Estos productos se
pueden diferenciar por
tamaño y/o sondas
fluorescentes.
• Ahorra templado, tiempo
y gastos.
• Requiere una cuidadosa
optimización.
 ARMS
ARMS (amplification
refractory mutation system)
A Primer específico al Alelo 1
A Alelo 1
C Alelo 2 C Primer específico al Alelo 2

Cebador 2 Primer en región conservada

A
Cebador 2 C
Cebador 2

A
T
G
A
C
T
G
C
ALELO 1 ALELO 2
 Real Time PCR

Real Time PCR

• Técnica cuantitativa.
• Detección en los primeros ciclos de amplificación,
cuando se alcanza un umbral de detección.
• Especifica
• Existen diferentes tipos de químicas:
– Sybr Green™
– TaqMan™
– Scorpion™
– Hybridization Probes
– Simple Probes
– Molecular Beacons
 Real Time PCR

Diseño cebadores/sonda Fabricación de un stock de

concentración conocida

Programa Primer express

(Applied Biosystems)

Amplificación con juego

Cuantificación cebadores específicos
muestras problema
Clonación
Cuantificación (en gel,
espectrofluorimetría)
Construcción curva /
recta patrón

Diluciones (0-109 copias)

Optimización concentraciones
Real Time PCR de las diluciones primers/sonda
 Real Time PCR

Forward primer
R Sonda
Q
Sonda TaqMan
Reverse primer
R
Forward primer Q

Reverse primer

R
Forward primer Q

Reverse primer
R Q
Forward primer

Reverse primer
 Real Time PCR
Estima del número de copias

ΔRn=(Rn+)-(Rn-)

Rn+ = en presencia de
Template

Rn- =En ausencia de Template

/ durante 1os ciclos PCR

Referencia pasiva = Normaliza señal reporter durante recogida datos

Rn= Intensidad de emisión del “Reporter”

Intensidad de emisión de la Referencia Pasiva

CT (Threshold Cycle)=Ciclo en el que tiene lugar un incremento en la

Intensidad de señal
 Real Time PCR

Cinética de amplificación
109 – 104 copias
150bp HVRI mtDNA

109 108 107 106105 104

Recta patrón y
cuantificación
de muestras de
104 aDNA
105
106
107
108
109
Ejemplo en diagnótico clínico
Hemocromatosis
 Hemocromatosis
Gen HFE:
Residuo
7 exones
10,000 pb de ADN 282
mARN 2700 bp
Proteína: 348-aa

Cadenas beta 2
microglobulina