Metodología del uso del HPLC (Cromatografía de líquidos de alta resolución).

Materiales:

 Viales (La utilización de viales color ámbar en el caso de compuestos

fenólicos para evitar degradación de compuestos dentro de la muestra,
utilizar viales 1 a 1.5 mL).
 Filtros de membrana de jeringa 0.45 micras
 Muestras
 Columna de cromatografía liquida (recomendada C-18)
 Fase móvil (en función de los compuestos que se desee identificar se
recomienda metanol, etanol y agua destilada)
 Frascos de un litro para fase movil
 Filtros milipore (se recomienda que sean de material linol especial para
reactivos)
 Filtro membrana
 Equipo HPLC

Preparación de las muestras:

 Rotular cada uno de los viales en relación a las muestras contenidas.

 Utilizando jeringas sin aguja, de 3 o 5 militros llenar los viales con las
muestras colocando especial cuidado al llenado de cada uno vial evitando
que se filtren partículas de las muestras o extracciones realizadas.

Preparación de la fase móvil:

 Definir los porcentajes a utilizar de cada una de las fases en la mezcla

 Utilizando un milipore filtrar cada una de las fases a utilizar (etanol, metanol,
o agua destilada).
 Colocar en los frascos de un litro y rotular

Nota: se recomienda mezclar las fases en función de los porcentajes definidos

a utilizar en el caso de utilizar 2 fases y filtrar para tener una mejor resolución al
utilizar el HPLC.
Preparación del HPLC:

 Colocar dentro de los rotores las muestras previamente preparadas y

rotuladas
 Crear una carpeta dentro del software del equipo con todos los datos
requeridos de las muestras a utilizar.
 Colocación de la columna a utilizar conectada al detector dependiendo del
compuestos o compuestos a identificar (UV, IR, etc.) nota: cuidar el flujo de
entrada y salida de la columna pues pueden existir fugas en una mala
colocación
 Configuración del software a utilizar en función de los compuestos a
identificar:

Se recomienda:

Utilizar temperaturas entre los 30 y 50 °C

Utilizar velocidad de inyección de 1 a 15 microlitros

Utilizar tiempos estimados hasta de 1 hora por cada muestra

Las configuraciones del detector y el equipo se programan en función de los

compuestos a identificar tomar como referencia artículos de la utilización e
identificación de dicho compuesto y realizar las modificaciones pertinentes.