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IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

Importância:
- Diagnóstico de microrganismos patogênicos
- Estudos ecológicos
- Desenvolvimento de produtos biotecnológicos.

Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Assim, a identificação


requer a observação de um conjunto complexo de características:

1. Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e


mobilidade.
2. Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes meios (meio
em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.
3. Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade, hospedeiros,
resistência.
4. Genética: seqüência de genes específicos, variações transitórias e permanentes.
5. Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento.

As informações devem ser associadas umas às outras e comparadas com as informações do


Manual de Bergey – obra referência oficial da taxonomia de bactérias.

Procedimentos para observar expressões fenotípicas:

1. Meio líquido: observar o aspecto das culturas antes de utilizar nas demais inoculações.
2. Preparar lâmina a fresco: observar motilidade.
3. Preparar lâmina corada: observar reação de Gram, forma, arranjos e estruturas.
4. Inocular placas com ágar-nutriente em estrias cruzadas: observar morfologia das colônias
5. Inocular meio com ágar-amido: observar a hidrólise do amido com algumas gotas de
solução de iodo
6. Inocular meio inclinado em linha reta: observar formas de crescimento
7. Inocular meio com gelatina: verificar atividade proteolítica

Preencher a ficha da página 67 do livro Microbiologia Manual de Aulas Práticas


Culture Reaction Description Culture Reaction Description

Esta bactéria
Esta bactéria forma forma colônias
colônias de tamanho ligeiramente
Klebsiella
Escherichia coli médio com margens úmidas e viscosas,
pneumoniae
regulares e elevação circulares.
convexa convexas, com
margens lisas.

Colônias são Colônias


Serratia vermelhar e Pseudomonas circulares,
marcescens circulares coom fluorescens convexas e com
margem inteira margens lisas.

Colônias
Colônias circulares, puntiformes,
convexas com convexas com
Chromobacterium Micrococcus
margem inteira, e margens lisas,
violaceum luteus
apresentam-se roxas com cor
na maioria dos meios amarelada na
maioria dos meios.

Colônias Colônias
puntiformes, puntiformes,
convexas, com convexas, com
margens lisas. O margens lisas. . O
tamanho muito tamanho reduzido
Enterococcus reduzido é devido ao Lactobacillus é devido ao
faecalis metabolismo plantarum metabolismo
ineficiente dessa ineficiente, que
bactéria. Ela pode pode levar 3-4
levar 3-4 dias para dias para atingir
alcançar um um tamanho
tamanho apreciável. apreciável.

Colônias são largas,


porém menos que as Colônias, largas,
de B. cereus. As irregulares e
Bacillus subtilis margens são Bacillus cereus achatadas com
onduladas, com margens
forma circular e uma onduladas.
elevação achatada.

Colônias, largas,
Colônias largas,
irregulares e
irregulares e Staphyloccocus
Bacillus polymyxa achatadas com
achatadas com epidermidis
margens
margens onduladas.
onduladas.

Exemplos de vários tipos de morfologia das colônias


Descrições das diferentes formas das colônias em placas

- Uma das placas ou tubos poderá ser utilizada para fazer a reação da catalase.

Culture Reaction Description Culture Reaction Description

Observe a Observe a
formação de Klebsiella formação de
Escherichia coli
bolhas. pneumoniae bolhas.
Catalase positiva Catalase positiva

Observe a Observe a
Serratia formação de Pseudomonas formação de
marcescens bolhas. fluorescens bolhas.
Catalase positiva Catalase positiva

Observe a Observe a
Chromobacterium formação de Micrococcus formação de
violaceum bolhas. luteus bolhas.
Catalase positiva Catalase positiva
Observe a ausência Observe a ausência
de bolhas. Esta de bolhas. Esta
bactéria usa bactéria usa
Enterococcus Lactobacillus
peroxidase para peroxidase para
faecalis plantarum
eliminar H2O2, uma eliminar H2O2, uma
enzima que não enzima que não
libera oxigênio. libera oxigênio.

Observe a Observe a
formação de formação de
Bacillus subtilis Bacillus cereus
bolhas. bolhas.
Catalase positiva Catalase positiva

Observe a Observe a
formação de Staphylococcus formação de
Bacillus polymxya
bolhas. epidermidis bolhas.
Catalase positiva Catalase positiva

Teste para presença de catalase

Características fisiológicas – Provas bioquímicas

Os microrganismos realizam variadas atividades bioquímicas utilizando nutrientes do ambiente que


os rodeia Essas reações que ocorrem dentro ou fora das células são catalisadas por enzimas.
Geralmente, o metabolismo origina produtos finais cuja detecção pode auxiliar na identificação.

Utilização de fontes de carbono:

Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.)

Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que
depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gás (que pode ser detectado pela presença
de bolhas no tubo de Durham) e ácidos orgânicos (que pode ser detectado pela mudança de cor do
indicador).
Mesmo com uma reação negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de
cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no máximo 24 h, pois podem
ocorrer reações alcalinas sobre outros substratos.
Utilizam-se meios básicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para ácidos.

VM (Vermelho de Metila)

Teste que avalia se as bactérias fermentam a glicose pela via ácida mista, com a produção de
vários ácidos (ácido fórmico, lático, acético), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que é
o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactérias fermentem glicose, alguns
microrganismos, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos
como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH é o
vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo. Adicionar 4 gotas
e rolar gentilmente entre a palma das mãos.

VP (Voges Proskauer)

Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica. Fermentam a glicose produzindo acetil-


metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos. Quando KOH (4 gotas
do Barrit II) é adicionado, e na presença de O 2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. A adição
de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo,
após 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao
oxigênio.
Hidrólise do amido

O amido é um polissacarídeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da
célula e ser utilizado, é necessário, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A
habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases. A
quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma
solução de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul
escuro. As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor.

Citrato

Este teste determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de
carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons,
contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte
de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de
amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos
com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do
citrato. O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.

Malonato (teste FM)

Essa prova determina a capacidade de uma bactéria de utilizar malonato como única fonte de
carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente à desidrogenase succínica,
impedindo sua ação catalítica sobre o ácido succínico com interrupção do Ciclo de Krebs, tirando da
bactéria sua principal fonte de energia e impedindo a formação de outros intermediários
necessários ao metabolismo.
Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.

(-) (+)

Utilização de fontes de nitrogênio:

Fenilalanina - desaminação (teste FM)

Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio,
originando o ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio,
formando uma cor verde.
Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, é necessário acidificar o meio com HCl, que
passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto férrico.

Lisina - descarboxilação

Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos
aminoácidos, com formação de aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO 2. A reação
ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas, mas inicialmente ocorre a
utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.
O meio contém o indicador bromocresol púrpura. Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se
amarelo devido à fermentação da glicose. Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor
púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para
agilizar o processo.

Indol

O indol é produzido pela ação da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura,
ocorrendo, também, a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela
formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição de p-
dimetilaminobenzaldeído (reativo de Erlich).

Produção de H2S (meio SIM)

Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de
sódio e a cisteína das peptonas), através da tiossulfato redutase, produzindo H 2S que é incolor.
Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta
reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.
Uréia

Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia
presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia
que alcaliniza o meio. O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a
coloração magenta. Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.

Redução de Nitratos

Muitas bactérias são capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em
condições anaeróbias (condição em que o nitrato substitui o oxigênio como aceptor final de
elétrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito é evidenciado
através da formação de um composto avermelhado.

Motilidade

A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-
sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade
é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento só será
observado na zona da picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma
folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.

Esta bactéria não é


Esta bactéria é altamente
móvel e formará somente
Escherichia coli móvel e provocará turbidez Klebsiella pneumoniae
uma linha de
no meio.
crescimento.

Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato)

Esta série de quatro provas já vistas anteriormente permite diferenciar os principais grupos de
Enterobacteriaceae:

Grupo I: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella


Grupo II: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia
Grupo III: Proteus
Grupo IV: Yersinia