TÉCNICAS DE BIOLOGÍA

MOLECULAR

Mauricio Bernal Morales

Biotecnología para no Biotecnólogos.
Agenda

 Historia
 Electroforesis.
 Replicación-PCR
 Hibridación de ácidos nucleícos.
 Secuenciación.
 Técnicas modernas.
Nacimiento de la genética
Un monje austríaco, Gregor Mendel,
desarrolló los principios fundamentales de que
hoy es la moderna ciencia de la genética.
Mendel demostró que las características
heredables son llevadas en unidades discretas
que se heredan por separado en cada
generación. Estas unidades discretas, que
Mendel llamó elemente, se conocen hoy como
genes.
Mendel probó las 34 variedades de arvejas disponibles a través de los
vendedores de semillas. Mendel buscó caracteres con rasgos bien definidos y
alternativos constantes, que constituyeran razas puras. Las arvejas de jardín
fueron plantadas y estudiadas durante ocho años a fin de comprobar que el
rasgo observado se mantenía constante a lo largo de varias generaciones. Así,
Mendel aisló 7 pares de caracteres que eran razas puras: cada carácter
estudiado se presentaba en dos variantes, tales como: altura de la planta
(alta o baja), superficie de la semilla (lisa o rugosa), forma de la vaina
(inflada o contraída), forma de la vaina y otras (ver esquema a continuación).
En sus experimentos Mendel uso unas 28.000 plantas de arvejas.
Fragmentación del ADN
 Físicos: Sonicación Consiste en pasar la muestra de
ADN por una fuente de ultrasonido, para fragmentar el
ADN. (fragmentos muy cortos)

 Enzimaticos. Enzimas de restricción

EcoRI :
Sitio de reconocimiento Resultado del corte
5'GAATTC 5'---G A ATTC---3‘
3'CTTAAG 3'---CTTA A G---5'
HindIII:
Sitio de reconocimiento Resultado del corte
5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'
ELECTROFORESIS
Análisis de la Muestra
• La posterior visualización se puede realizar con
bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de
plata, fluorescencia, radioactividad
Ladder: pesos conocidos
1: Fragmento a 1857 pb
2 y 4: Fragmento a 800 pb
3: No hay producto
5: Multiples bandas (primers
inespecíficos se pegan a
varios sitios)
Electroforesis en condiciones denaturantes (gel de poliacrilamida al 12%), de extractos provenientes de la
fase exponencial de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158 B. Proteínas (15 µl) extraídas con ultrasonido (en
buffer fosfato con Pefabloc 10 mM) y con buffer de lisis (buffer RIPA). Precipitadas con el método Metanol-
Cloroformo. Tinción con azul de comassie.
 Reacción en Cadena de la Polimerasa

¿Qué proceso esta implícito?

Reacción en Cadena de la Polimerasa

 Fue diseñada en el año de

1986.

 Utilizó el PCR para

amplificación del gen de -
hemoglobina humana, y el
diagnóstico prenatal de
anemia falciforme.

Objetivo principal: Obtener un gran número de

copias de un fragmento de ADN particular
 GENERALIDADES PCR

Método de síntesis in vitro de múltiples copias de

una porción de ADN: Amplificación.
Cada ciclo

Aumento exponencial de ADN blanco

Molde para la síntesis de nuevo ADN

 QUE REQUIERE LA
REACCIÓN PCR?
BUFFER Y MAGNESIO
B

ADN MOLDE A C dNTPs

REACTIVOS

Taq ADN E D INICIADORES

polimerasa
Comprende múltiples ciclos de un proceso de tres pasos,
cada uno realizado a diferente temperatura.

DESNATURALIZACIÓN
95°-100°C
HIBRIDIZACION CADA
40°- 60°C
CICLO
EXTENSIÓN
68° - 72°C

1 copia de ADN se 30 ciclos: más de un

incrementa billón de copias a
2X copias después de x partir de una copia de
número de ciclos. ADN en menos de tres
horas!
 El proceso de “PCR” incluye 3 pasos
básicos que se repiten 25 veces o más:
 1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de
DNA y convertirla en hebra sencilla.
-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40
segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-
2. Apareamiento o “anneling”:
 Los cebadores “primers” previamente diseñados,
reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se
pegan en lugares específicos por
complementariedad de bases. Para esto, se baja la
temperatura.
3. Polimerización o Extensión.
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el
espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca
dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el
DNA de 3’a 5’. De esta forma sintetiza la secuencia
complementaria de las hebras de DNA molde.
Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos.

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificación exponencial
Ventajas del “PCR”

 A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener

una cantidad considerable para el estudio que se vaya a
realizar.
 El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y
análisis.
 Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o
muerto.
 Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense,
diagnósticos, análisis prenatales, etc.
 Desventajas del “PCR”

 Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde

se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40
pb.
 La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
 Puede contaminarse con otro ADN.
Aplicaciones
Criminalística
 Ejemplo de un caso de
criminalística resuelto
utilizando electroforesis en
gel vertical de acrilamida.

 Si se observan los patrones

bandas podrá comprobarse
como los perfiles obtenidos
en las manchas de sangre
encontradas en el sombrero
y pantalón del sospechoso
(S) coinciden con el perfil
genético de la víctima (V)
Utilidad del PCR
Secuenciación
La secuenciación de ADN es un conjunto
de métodos y técnicas bioquímicas cuya
finalidad es la determinación del orden de
los nucleótidos (A, C, G y T) en un
oligonucleótido de ADN.

Química.
Enzimática.
Método enzimático de Sanger

Este método de secuenciación de ADN

fue diseñado por Sanger, Nicklen y
Coulson en 1977 y se conoce como
método de los terminadores de cadena o
dideoxi.

Para este método resulta esencial

disponer de un ADN de cadena simple
(molde) y un iniciador, cebador o "primer"
complementario de una región del ADN
molde anterior a donde va a iniciarse la
secuencia. Este cebador se utiliza como
sustrato de la enzima ADN polimerasa I
que va a extender la cadena copiando de
forma complementaria el molde de ADN.
 Secuenciación de DNA
 Polimerización interrumpida de ADN.
 Se lleva a cabo la polimerización de
ADN en presencia de derivados
dideoxi que detienen la polimerización
en diferente momento, obteniéndose
fragmentos de diferente tamaño.
 Se examinan en electroforesis, se “lee”
la secuencia directamente del gel.
Método dideoxi de Sanger
Método dideoxi de Sanger
Método dideoxi de Sanger
Método secuenciación automática
Electroferograma de la secuenciación automática
Geles de secuencia

Secuencia automática Secuencia Manual

 Microplatos

Dispensadores
Automaticos
de muestras

Robotica
50 000–100 000
Muestras por día
Genoma Humano posee mil millones de pares de bases
Toda la secuencia tardaría 240 días
 Modelos biológicos.

Dictyostelium Caenorhabditis elegan

Drosophila Pez Cebra

melanogaster

Arabidopsis thaliana
Genómica
Transcriptomica
Proteómica
GRACIAS
¿¿??