Jang et al.

Cuidados Intensivos Medicina Experimental ( 2018) 6: 4

Medicina de Cuidados Intensivos
DOI 10.1186 / s40635-018-0169-2
Experimental

INVESTIGACIÓN Acceso abierto

Las alteraciones en las especies de respiración y reactivas de

oxígeno mitocondrial en pacientes intoxicados con monóxido de
carbono se trata con oxígeno hiperbárico

David H. Jang 1 *, Utsha G. Khatri 1, Brenna P. Shortal 2, matthew Kelly 1,4, Kevin Hardy 1,4, David S. Lambert 1,4
y David M. Eckmann 2,3,5,6,7

* Correspondencia:
Abstracto
David.jang@uphs.upenn.edu
1 Departamento de Medicina de Emergencia,
División de Toxicología Médica y la Medicina Fondo: El monóxido de carbono (CO) el envenenamiento es la causa principal de mortalidad y morbilidad en la intoxicación
de la Facultad de Medicina de Perelman de la por el EE.UU.. (COHb) los niveles de carboxihemoglobina no son predictivos de la severidad o pronóstico. En este
Universidad de Pennsylvania, John Morgan
momento, la medición de la respiración mitocondrial puede servir como un biomarcador en el envenenamiento por CO. El
Building, 3620 Hamilton Walk, Philadelphia
19104, PA, EE.UU. Lista completa de objetivo primario de este estudio fue evaluar los cambios en la función mitocondrial que consisten en la respiración y la
información sobre el autor está disponible al generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de
final del artículo
pacientes con envenenamiento por CO.

métodos: PBMCs de pacientes que tienen la exposición CO confirmado tratado con oxígeno hiperbárico o HBO (grupo
CO) y controles sanos (grupo control) se analizaron con alta resolución de respirometría. Las PBMC se colocaron en
una cámara de 2 ml a una concentración final de 3 - 4 × 10 6 células / ml para obtener simultáneamente tanto la
respiración y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) producción. En el grupo de CO, hemos realizado mediciones antes y
después de los pacientes se haya producido la primera tratamiento HBO.

resultados: Se incluyó un total de 17 sujetos, incluyendo 7 sujetos con envenenamiento por CO confirmado y 10
sujetos en el grupo control. El grupo CO incluyó cinco (71,4%) hombres y dos (28,6%) mujeres que tienen una
COHb mediana de 28%. Hubo una disminución significativa en la respiración, medida en pmol O 2 × s - 1 × 10 - 6 PBMCs
en el grupo CO (pre-HBO) en comparación con el grupo control: respiración máxima (18,4 ± 2,4 frente

35,4 ± 2,8, P < 0,001); desacoplado respiración Complejo I (19,8 ± 1,8 frente a 41,1 ± 3,8, P < 0,001); Complejo
desacoplado I + II respiración (32,3 ± 3,2 frente a 58,3 ± 3,1, P < 0.
001); respiración Complejo IV (43,5 ± 2,9 frente a 63,6 ± 6,31, P < 0,05). También hubo diferencias similares medidos
en el grupo CO antes y después del tratamiento HBO con un aumento global en la respiración presente después del
tratamiento. También se determinó la tasa de H 2 O 2 producción simultáneamente con la medición de la respiración.
Hubo un incremento general significativo de la H 2 O 2 producción en el grupo de CO después del tratamiento HBO
cuando se compara con el tratamiento HBO antes y el grupo control.

(Continúa en la siguiente página)

© El Autor (s). 2018 Acceso abierto En este artículo se distribuye bajo los términos de la licencia 4.0 de Creative Commons Reconocimiento Internacional
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conclusiones: En este estudio, PBMCs obtenidas de sujetos con envenenamiento por CO tienen una disminución global
en la respiración (H similares 2 O 2 producción) en comparación con los controles. La inhibición de la respiración Complejo
IV es de CO de unión conduce a una disminución de aguas abajo en la respiración en otros complejos. PBMCs
obtenidas de individuos envenenado CO-inmediatamente después de la terapia inicial HBO muestran un aumento
general en tanto la respiración y H 2 O 2 producción. Los resultados del estudio demuestran que el tratamiento con HBO
resultó en la mejora de la respiración celular, pero un mayor H 2 O 2 producción. No está claro si el aumento de la
producción de H 2 O 2 en HBO tratamiento es perjudicial.

palabras clave: Las mitocondrias, monóxido de carbono, las especies reactivas de oxígeno, oxígeno hiperbárico

Fondo
El monóxido de carbono (CO) es un gas incoloro e inodoro que es una causa importante de mortalidad y morbilidad

envenenamiento en los EE.UU., con aproximadamente 15.000 casos al año intencionales que representa más de dos

tercios de la muerte informado. En concreto, la muerte por envenenamiento por CO se ha informado de que entre 1000 y

2000 en algunos años con más de 50.000 casos de OC que acuden a urgencias en los EE.UU. al año, con

aproximadamente 10 - 15% que requiere hospitalización [1, 2]. Se estima que los resultados de envenenamiento por CO en

más de $ 1 mil millones al año relacionadas con los gastos de hospital y pérdida de ingresos. La complicación más grave

para los sobrevivientes de exposición al CO consecuente se retrasa neurológica o secuela neurocognitiva que se produce

en hasta el 50% de los pacientes que tienen envenenamiento por CO sintomático [3, 4].

El mecanismo para el envenenamiento por CO incluye la peroxidación de lípidos, disminución de la capacidad de

transportar oxígeno, y la inhibición de citocromo do oxidasa o IV Complex (CIV) [5 - 8]. El tratamiento estándar para el

envenenamiento por CO recomendado por la Sociedad Médica del submarino y hiperbárica es la terapia de oxígeno

hiperbárico (HBO) para disminuir la vida media sino también para prevenir la peroxidación lipídica. Hay un ensayo clínico

que era el único ECA para satisfacer los criterios CONSORT se encontró que la eficacia de HBO [9]. A pesar de las

recomendaciones, la eficacia de HBO es ampliamente debatido con una revisión Cochrane concluyó que los ensayos

aleatorios existentes no establecen que la administración de HBO para pacientes con envenenamiento por CO reduce la

incidencia de los resultados neurológicos adversos [10]. Existe una clara necesidad de una mejor comprensión de la

interacción de HBO y la función bioenergética mitocondrial frente a la intoxicación por CO.

En un estudio anterior, hemos explorado la logística de la medición de la respiración mitocondrial que se ajusta en un marco de

tiempo analítico útil para identificar anormalidades clínicas y también encontramos que el envenenamiento clínicamente significativa

CO dio como resultado una disminución de los parámetros clave de la respiración mitocondrial, independientemente de la

carboxihemoglobina (COHb) nivel [8]. En este estudio, hemos utilizado recién células de sangre obtenida para llevar a cabo la

medición simultánea de la respiración mitocondrial y especies reactivas de oxígeno (ROS) de producción (por ejemplo, peróxido de

hidrógeno o H 2 O 2 producción). Se evaluaron muestras de sangre de los sujetos de control, así como sujetos con envenenamiento

por CO clínicamente significativa a la presentación hospital y también inmediatamente después de un tratamiento inicial de HBO. El

objetivo primario de este estudio fue evaluar los cambios en la función mitocondrial que se producen como resultado de

envenenamiento por CO y la posterior terapia de HBO.

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métodos
Diseño del estudio

La Universidad de Pennsylvania Institutional Review Board aprobó este estudio y el consentimiento informado se
obtuvo de todos los sujetos. Este fue un experimento controlado de dos grupos de sujetos envenenado
CO-agudamente sometidos a tratamiento y de control sujetos HBO. La sangre completa se obtuvo de los
participantes consentido 1 h después de servicio de urgencias presentación (ED) e inmediatamente después de
someterse a tratamiento HBO. El primer tratamiento HBO estaba en 2,8 ATA o atmósferas de presión absoluta
(60 pies de presión de agua de mar o 2,8 veces la presión atmosférica) para 120 min como se ve en la figura 1.
También obtuvimos la siguiente información clínica:. Historia, examen físico, de laboratorio estándar valores, los
estudios de imagen, COHb, y los resultados del hospital. Los criterios de exclusión para ambos grupos incluyen
tumores malignos conocidos, embarazo,

Preparación de células sanguíneas humana

Todos los sujetos elegibles con envenenamiento por CO confirmado sometieron a flebotomía como parte del cuidado

estándar dentro de 1 h de presentación ED y dentro de 1 h después del tratamiento inicial HBO. Se tomaron muestras

de los tubos de recogida al mismo tiempo como una flebotomía sangre planificada. Un volumen de 15 ml fue dibujado

en K 2 tubos de EDTA para prohibir la activación plaquetaria. El siguiente protocolo se llevó a cabo para obtener una

población de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs): 15 ml de Ficoll-Paque ™ PLUS se colocó en un ml

50 tubo Leucosep (Greiner Bio-One) que se centrifugó a 1000 gramo durante 1 min. Durante este proceso, 15 ml de la

paciente ' se añadió s sangre a un tubo Falcon de 50 ml seguido por una adición de 15 ml de DPBS para un total de 30

ml en una mezcla 1: 1. El tubo Falcon de 50 ml se invirtió suavemente. Una vez que se completó la centrifugación

Leucosep, los 30 ml de sangre fue cuidadosamente con pipeta y en capas por encima del disco dentro del tubo

Leucosep. El tubo Leucosep se centrifugó a 1000 gramo durante 10 min a habitación

Figura 1 Tabla de Tratamiento 5 para el envenenamiento por CO. El protocolo HBO estándar para pacientes con envenenamiento por CO. Todos los sujetos en el grupo

de CO fueron sometidos a tratamiento HBO en 2,8 ATA (60 pies de presión de agua de mar o 2,8 veces la presión atmosférica) durante 120 min
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temperatura después de lo cual se recogieron aproximadamente 4 ml de la capa leucocitaria que contiene PBMCs. Esta

muestra de capa leucocitaria se colocó en un tubo de 15 ml seguido de la adición de 4 ml de DPBS para una mezcla 1: 1

que después se centrifugó a 1000 gramo durante 7 min. El sobrenadante se descartó y el sedimento de PBMC fue

suavemente re-suspendieron en medio MiR05 para alta resolución respirometría. Un recuento de células con azul de

tripano se realizó con el Cell condesa II (Invitrogen) y la viabilidad celular también se evaluó. Para demostrar que nuestra

metodología de preparación de la muestra produce PBMCs en un alto grado, se realizó citometría de flujo análisis.

Nuestro uso del tubo Leucosep resultó en muestras que tenían más de 95% PBMCs y menos de 5% de eritrocitos y

plaquetas combinados.

-Alta resolución de respirometría

La respiración se midió a una temperatura constante de 37 ° C en una alta resolución Oxygraph (Oxygraph-2k,
oroboros Instruments) en cámaras de vidrio de 2 ml con velocidad de agitación 750 rpm. Los datos fueron
registrados con DatLab software 6 (oroboros Instruments) con la tasa de muestreo se establece en 2 s. Todos los
experimentos se realizaron a una concentración de oxígeno en el intervalo de 210 - 50 μ mes 2 corregido para el flujo
de fondo. Para las mediciones de la respiración en células permeabilizadas, PBMCs fueron suspendidas en un
medio de la respiración mitocondrial (MiR05) que contenía sacarosa 110 mM, HEPES 20 mM, taurina 20 mM,
K-lactobionato 60 mM, MgCl 2 3 mM, KH 2 correos 4 10 mM, EGTA 0,5 mM, y BSA 1 g / l y con pH 7,1 que permite la
medición simultánea de la respiración y H 2 O 2 producción.

Protocolo experimental para el protocolo de referencia para células permeabilizadas

Se realizó un protocolo especializado utilizando PBMCs para evaluar la actividad del complejo específico (CI-CIV) que

requiere la permeabilización controla con digitonina. Esta titulación sustrato-uncouplerinhibitor (SUIT) protocolo se conoce

como protocolo de referencia (RP) diseñado para proporcionar referencia común para la comparación de control

respiratorio en una amplia gama de preparaciones que van desde las mitocondrias aisladas, los tejidos, y diversos tipos de

células incluyendo las células sanguíneas humanos utilizados en este experimento [8, 11]. Con el fin de acceder al sistema

de transporte de electrones con la saturación de sustratos exógenos y los inhibidores, la membrana plasmática se

permeabilizaron con la digitonina detergente. Se realizaron una serie de experimentos para establecer la concentración

óptima de digitonina para inducir la permeabilización máxima de la membrana de plasma sin afectar a la membrana

mitocondrial externa o interna. La Figura 2 ilustra una respiración típica rastreo utilizado para nuestro estudio con la

siguiente secuencia de inyecciones administradas en el RP para establecer las capacidades respiratorias con el flujo de

electrones a través tanto de CI y CII separado, así como de entrada de electrones convergente a través de la Q-unión (CI +

II ). Tanto malato y piruvato (PM) se añadieron antes de la adición de las células. Una vez que se añadieron las células, la

respiración rutina se le permitió ser alcanzado seguido por valoración con digitonina para la permeabilización de la

membrana plasmática de la concentración descrito anteriormente, que proporciona el estado FUGAS vinculado-CI. La

fosforilación oxidativa (OXPHOS) Capacidad de CI, impulsado por nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) sustratos

relacionados, se evaluó mediante la adición de difosfato de adenosina (D). Cianuro de carbonilo hidrazina m-cloro fenilo

(U) se tituló para obtener la capacidad respiratoria máxima o ETS. ETS es la máxima estimulación de la respiración

mitocondrial que se mide después de que el uso de un protonóforo que desacopla la fosforilación oxidativa. ETS es a

menudo considerado
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Figura 2 protocolo de referencia. La figura representa un trazado estándar para obtener diferentes estados de acoplamiento en las células

permeabilizadas. Este protocolo de referencia proporciona una referencia común para la comparación de control respiratorio en una gran variedad de

tejidos y tipos de células. Cada flecha representa un punto de una inyección con el correspondiente compuesto y el estado respiratorio en paréntesis

de la reserva como máximo para la célula para realizar un trabajo bioquímico. Después de U titulación, se añadió
glutamato (G) para obtener la respiración CI desacoplado (ETS CI) que se añadió seguido de succinato de (S) para
dar CI desacoplado y la respiración CII (ETS CI + CII). CI fue inhibida por rotenona (Rot) para evaluar la capacidad
ETS apoyo de succinato a través de CII solamente o desacoplar la respiración CII (ETS CII). Después, se le dio
glicerol 3-fosfato (Gp) para evaluar glicerofosfato mitocondrial complejo deshidrogenasa que alimenta electrones
directamente a la ubiquinona. Finalmente, el flujo de electrones a través de la ETS fue inhibida por adición de
antimicina-A (AMA), la inhibición de CIII, proporcionando el consumo de oxígeno residual (ROX) no relacionado
con el consumo de oxígeno no mitocondrial. ROX se restó de los diferentes parámetros respiratorios en análisis
adicionales. actividad CIV se evaluó luego con la adición tanto de ascorbato y N, N, N ', norte '- dihidrocloruro de
tetrametil-p-fenilendiamina (Tm) seguido de azida de sodio (Azd). Para la corrección del consumo de oxígeno no
CIVrelated, se restó el fondo química restante.

Protocolo experimental para la medición simultánea de peróxido de hidrógeno en las células permeabilizadas

Además de la medición de la respiración mitocondrial en células permeabilizadas, también medimos simultáneamente

la producción de ROS como H 2 O 2. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un O2K-fluorómetro LED2-módulo

conectado al O2K-Core usando dos sensores de fluorescencia verde con la ganancia se establece en 1000 con una

polarización de 400 mV (400 mV era un equilibrio ideal entre la sensibilidad y photobleaching). Los siguientes

inyecciones se realizaron antes de la inyección de las células: (1) Amplex Red (AMR) se añadió seguido por la

adición de peroxidasa de rábano picante que es necesario para la conversión de H 2 O 2 y AMR a resorufina

(fluorescencia). se añadió superóxido dismutasa Siguiente para convertir cualquier superóxido para H 2 O 2. La inyección

final antes de la adición de las células estaba recién preparada H 2 O 2 para poner a prueba el sistema de ensayo AMR

y para permitir la calibración de la O2K-fluorómetro para AMR. Además, hemos realizado experimentos con el uso de

resorufina como un control interno de una manera dependiente de la dosis para la prueba de H 2 O 2 señal y nuestro

trabajo anterior describe esta técnica [12, 13].

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Análisis de los datos

Las estadísticas se calcularon utilizando Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software Inc.). Los datos fueron probados para

la distribución normal con la D ' Agostino y prueba de normalidad ómnibus Pearson. Los datos se presentan como media ±

SEM si no se indica lo contrario. Las diferencias entre el grupo control y el grupo CO (antes y después de la terapia HBO)

se analizaron con ANOVA de medidas repetidas y, cuando significativa, Student pareada ' s t las pruebas se realizaron entre

los estados respiratorios. Los resultados se ajustaron con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. UN PAG valor

de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

resultados

Se incluyó a un total de 17 sujetos, incluyendo siete sujetos con envenenamiento por CO confirmado (grupo CO) y 10

sujetos sanos (grupo control). Las características de los pacientes se presentan en la Tabla 1. Los sujetos en el grupo de

control se inscribieron como una muestra de conveniencia sana para servir como grupo de comparación para la medición de

la respiración mitocondrial y ROS. Los sujetos en el grupo de control eran 50% hombres, con una edad mediana de 40 años

(IQR, 36 a 51 años). características clínicas Asunto incluyeron los siguientes: seis (60%) no tenían problemas médicos, uno

tenía enfermedad pulmonar obstructiva, y tres tenían hipertensión. Todos los sujetos fueron dados de alta del servicio de

urgencias sin visita de vuelta en una revisión de las historias de 30 días. Los sujetos en el grupo CO incluyen cinco hombres

(71%) y dos mujeres (29%). La edad media de los sujetos inscritos CO fue de 67 (IQR, 47 a 68 años). características

clínicas de los pacientes incluyeron los siguientes: cuatro (57,1%) no tenían problemas médicos, uno tenía Parkinson ' enfermedad

s, y dos tenían hipertensión. En cuanto a la fuente de exposición CO, cuatro (57,1%) estaban relacionadas con un

generador de calor defectuoso, dos (28,6%) estaban relacionados con la exposición ocupacional que implica la maquinaria,

y uno (14.3%) se relacionó con un escape de los automóviles.

tabla 1 Características de los sujetos en el grupo de CO y control

características grupo monóxido de carbono ( n = 7) Grupo de control ( n = 10)

Años 67 (47 - 68) 40 (36 - 51)

Sexo (%)

Masculino 71 50

Hembra 29 50

valor de laboratorio

COHb (%) 29 (28 - 32)

Lactato (mmol / L) 2,78 (1,1 - 4.5)

Síntomas clínicos (%)

Neurológico

Dolor de cabeza 57

Incautación 14

Síncope 43

Cardíaco

Dolor de pecho 14

cambios en el ECG 14

Gastrointestinal

Las náuseas y los vómitos 14

Los datos se presentan como mediana (IQR) o como porcentaje

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En el grupo de CO, a la llegada al ED, cuatro (57,1%) síncope experimentado, un (14,3%) tuvieron una

convulsión, dos (28,6%) presentaron cambios dolor de pecho / EKG, y uno (14,3%) presentaron náuseas y vómitos.

Tras la llegada a la ED, seis (85,7%) sujetos fueron colocados en mascarilla sin retorno y una (14,2%) fue intubado

para alteración del estado mental. Como un índice de resultado, un sujeto fue admitido en la UCI, uno fue admitido

en un piso de medicina general para la debilidad residual, y cinco fueron dados de alta de la unidad de observación

después de someterse a tres inmersiones HBO. Todos los siete sujetos CO sobrevivieron a la hospitalización.

Se comparó la función mitocondrial en PBMCs obtenidas de sujetos en el grupo de CO en dos puntos de tiempo

discretos, antes de la terapia de HBO y en 1 h después de someterse al tratamiento inicial HBO como se ve en la

Fig. 3. También se compararon los resultados de la respiración en el grupo CO ( pre- y post-HBO) para el grupo de

control. Todas las unidades de la respiración se midieron en pmol O 2 × s - 1 × 10 - 6 CMSP. Tabla 2 contiene tanto la

respiración mitocondrial y H 2 O 2 la producción en todos los estados respiratorios clave. Los siguientes parámetros

clave de la respiración fue significativamente menor en el grupo CO (pre-HBO) en comparación con el grupo

control, respectivamente: OXPHOS CI, ETS o respiración máxima, ETS CI, ETS CI + CII, y la respiración CIV. No hubo

diferencias en R, FUGAS, ETS CII, Gp, y ROX entre los dos grupos. Hubo un incremento general significativo de la

respiración en el grupo de CO después de que se sometieron a HBO en comparación con pre-HBO tratamiento,

excepto con diferencias en la respiración con R, FUGAS, Gp, y ROX. También de la nota, el grupo control y el

grupo CO (post HBO) fueron similares en todos los estados respiratorios. También se determinó la tasa de H 2 O 2 producción

(así como superóxido convierten a H 2 O 2 con la administración de SOD) simultáneamente con la medición de la

respiración en la Fig. 4. La final H 2 O 2 valores de producción se obtuvieron después de la corrección tanto para la

fluorescencia de fondo y cambios en la sensibilidad a lo largo del tiempo. No hubo diferencias en H 2 O 2 la

producción entre el grupo CO (pre-HBO) versus el grupo de control. Ahí

Fig. 3 La respiración mitocondrial en PBMC. la respiración mitocondrial celulares obtenidos en PBMCs permeabilizadas para el grupo de control, así como
el grupo CO (pre y post-HBO). Los valores se presentan como media ± SEM. * El grupo CO (pre-HBO) significativamente diferente después de su
tratamiento HBO (post-HBO) y el grupo control ( P < 0,001 para ambos). ** El grupo de control significativamente diferentes del grupo CO tanto antes como
después del tratamiento HBO ( P < 0,0001 para ambos grupos)
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Tabla 2 La respiración mitocondrial y H 2 O 2 producción

Grupo de control grupo CO (pre-HBO) grupo CO (post-HBO)

estados respiratorios Media SEM Media SEM Media SEM

La respiración mitocondrial (medida en pmol O 2 × s - 1 × 10 - 6 CMSP)

Rutina 19.56 0.54 13.23 1.42 22.10 1.28

FUGA 13.33 0.97 6.19 0.99 13.54 1.81

la fosforilación oxidativa 20.57 0.87 8.47 1.45 17.51 2.58

ETS 35.66 2.20 18.39 2.42 35.23 3.70

ETS-CI 41.73 2.76 19.81 1.77 38.07 3.61

ETS-CI & II 58.04 2.33 32.27 3.17 60.54 3.32

ETS-CII 20.67 2.11 16.44 1.30 28.07 2.25

gp 55.86 5.96 47.86 6.36 47.15 3.88

ROX 1.17 0.20 0,73 0,19 0,76 0.20

CIV 63.60 6.03 43.52 2.92 76.50 4.30

mitocondrial H 2 O 2 producción (medida en pmol H 2 O 2 × s - 1 × 10 - 6 CMSP)

Rutina 0.06 0.02 0.04 0.02 0.16 0.07

FUGA 0.18 0.05 0.24 0.13 0.92 0.14

la fosforilación oxidativa 0.25 0.05 0.16 0.05 0.93 0.22

ETS 0.22 0.04 0.14 0.02 0.85 0.20

ETS-CI 0.22 0.04 0.13 0.02 0.66 0.21

ETS-CI & II 0.22 0.04 0.17 0.02 1.14 0.32

ETS-CII 0.26 0.06 0.23 0.04 0,71 0.08

ROX 0.57 0.15 0.31 0.06 1.59 0.42

la producción de la respiración y peróxido de hidrógeno mitocondrial celular obtenido en PBMCs permeabilizadas entre el grupo control, el grupo CO (pre-HBO), y el
mismo grupo de CO después de someterse a tratamiento HBO (post-HBO). Los valores se presentan como media ± SEM

Fig. 4 la producción de ROS en PBMCs. Medición de la producción de ROS usando el ensayo Amplex Red. H 2 O 2 niveles se miden en
presencia de superóxido dismutasa para asegurar que toda superóxido se convierte en H 2 O 2.
Los valores se presentan como media ± SEM. * El grupo CO (pre-HBO) es significativamente diferente después de su tratamiento HBO
(post-HBO) y del grupo control ( P < 0,001 para ambos grupos)
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era un aumento significativo de todos los parámetros clave de H 2 O 2 Producción medida en pmol H 2 O 2 × s - 1 × 10 - 6 PBMCs en

el grupo de CO después de que fueron sometidos a tratamiento HBO cuando comparación con el tratamiento pre-HBO con

la excepción de rutina que indica un efecto de la terapia de HBO en H 2 O 2 producción. H 2 O 2 la producción también fue

significativamente mayor en el mismo grupo CO después del tratamiento HBO en comparación con el grupo de control con

la excepción de R.

Discusión
El presente estudio investiga los cambios tanto en la producción de la respiración y peróxido de hidrógeno mitocondrial en

PBMCs obtenidas de sujetos que fueron envenenados por CO sometieron a su primer tratamiento de HBO (2,8 ATA para

120 min). Los resultados de este estudio fueron que PBMCs obtenidas de sujetos con envenenamiento por CO, en

comparación con el grupo de control mostró una disminución global de la respiración mitocondrial. Es importante destacar

que, para los sujetos de CO que se sometieron a la primera tratamiento de HBO, hubo un aumento general en

mitocondrial poste respiración HBO con la excepción de complejo glicerofosfato deshidrogenasa actividad (CGpDH) que

es un complejo del sistema de transferencia de electrones localizado en la cara exterior de el mt-membrana interna. En lo

que respecta a H 2 O 2 producción, hubo un aumento general de H 2 O 2 la producción a lo largo de los principales parámetros

de tratamiento mitocondrial poste respiración HBO para el grupo CO.

Uno de los hallazgos en este estudio fue una disminución de la CIV respiración en el grupo de CO en comparación con

el grupo control. Anteriormente puso de manifiesto una disminución de la respiración CIV en PBMCs obtenidas de un

subgrupo de pacientes con intoxicación por CO severa relacionada con la muerte. Además del efecto de CO sobre la

actividad CIV, también encontramos que la medición de la respiración mitocondrial sirvió como un mejor indicador clínico

de resultado cuando se compara con un nivel de COHb [8]. Estudios anteriores han demostrado también la inhibición CIV

donde un estudio mostró inhibición sostenida [14 - dieciséis]. Sin embargo, hay una serie de cuestiones metodológicas con

estos primeros estudios a considerar. El único estudio que demostró una inhibición sostenida CIV sólo contenía tres

sujetos que también fumaban activamente durante las medidas repetidas de la actividad CIV [14]. Se sabe que los

cigarrillos contienen tanto CO y una pequeña cantidad de cianuro, que es un factor cofundador significativo. Otra limitación

de otro estudio incluyen el uso de un modelo in vitro usando el músculo estriado expuesto artificialmente para CO y

muestras congeladas con resultados retardadas poco probable que afecte la atención clínica la utilización de la utilización

de espectrofotometría [15, 16]. En general, espectrofotometría requiere homogeneización de las muestras con un alto

riesgo de daño mitocondrial y condiciones más artificiales en comparación con HRR.

Uno de los puntos fuertes de la realización de HRR en células permeabilizadas es que permite el examen de una

variedad de estados respiratorios en cada complejo. En este estudio actual, hubo una disminución en la respiración

CIV más probable secundario a la inhibición de CO. Este traje RP ofrece varios estados de acoplamiento y, en

particular, CIV respiración se puede obtener después de la inhibición de la CIII con Ama. CIV está provisto de

compuestos específicos como se describe en nuestro método para obtener la respiración CIV específico. Esta

secuencia específica de las inyecciones asegura que la respiración CIV obtenido no es de la contribución de otros

complejos. En otro estudio se realizó, PBMCs intactas obtenidas de sujetos sanos expuestos al cianuro (inhibidor

CIV) dio como resultado una disminución global de la respiración mitocondrial en todos los principales parámetros

de la respiración medidos en células intactas que incluyen R y ETS [17]. En nuestro estudio, la mejora general
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en la respiración en sujetos que fueron tratados con la terapia de HBO puede haber sido debido a la eliminación mejorada de

CO en CIV restauración de flujo de electrones en sentido ascendente. Aunque se basen en la literatura actual, la inhibición de

CIV resultante de efecto vinculante CO se ralentizará respiración a otro complejo que es la explicación probable para nuestros

hallazgos. También otra consideración importante es que nuestro grupo tenía CO gravedad clínica variable del envenenamiento

por CO que también puede dar cuenta de este hallazgo. Una tercera consideración es que el CO también causa hipoxia donde

CI es sensible a la hipoxia así es más probable de una lesión CI en lugar de dirigir la inhibición CI [18, 19], la disminución de la

actividad CI.

Hemos utilizado una técnica innovadora de forma simultánea medir tanto la respiración celular y H 2 O 2 producción

con el sistema de la RAM. Este método se ha aplicado en un número limitado de estudios, pero proporciona

información importante con respecto a H 2 O 2 la producción en relación con la respiración celular [13, 20]. La medición

de la ROS en tiempo real puede ser técnicamente difícil ya que depende de un número de factores tales como el tipo

de ROS, el tiempo, y la técnica. Por ejemplo, la medición de superóxido es técnicamente más difícil, ya que esta

especie es de corta duración y de inmediato convertido a H 2 O 2 a través de SOD [21]. La medición de H 2 O 2 producción

confiere cierta ventaja como H 2 O 2 es un compuesto más estable y su medición está bien establecida. En nuestro

estudio, hicimos uso de SOD que convierte todos los radicales superóxido a H 2 O 2 por lo que el H 2 O 2 la producción

obtuvimos refleja tanto superóxido y H 2 O 2 producción.

Además de medir la respiración mitocondrial, también medimos simultáneamente H 2 O 2 producción en PBMCs

obtenidas de sujetos envenenados con CO en comparación con el grupo control. Se encontró que no había diferencia

en H 2 O 2 la producción entre el grupo CO (pre-HBO) y el grupo control. Esto es consistente como CI y CIII se consideran

los sitios principales para la producción de ROS mientras que CIV no es generalmente una fuente de la producción de

ROS como se ha visto con nuestros resultados. Sin embargo, hay alguna evidencia de que la inhibición CIV puede

conducir a una mayor reducción de los centros redox en CI o CII con potencial de generación de ROS [22, 23]. Los

resultados de nuestro estudio apoyan hacen que la inhibición CIV con CO sola no da lugar a una producción importante

de ROS. Es importante señalar que el uso de la fuerza redox sustancias activas, tales como el citocromo do son

incompatibles con el ensayo AmR lo que una vez se les dio sustratos CIV para obtener CIV respiración única H 2 O 2

la producción hasta la inyección de Ama es un reflejo fiable de H 2 O 2 producción. Todos los sujetos fueron sometidos a

terapia CO HBO, y mediciones repetidas en PBMCs obtenidas de entre el grupo CO inmediatamente después de HBO

mostró significativo aumento de H 2 O 2 la producción en la mayoría de los parámetros de la respiración. terapia de HBO es

la modalidad de tratamiento establecido para el envenenamiento por CO. Los sujetos que se someten a HBO respiran

100% de O 2 mientras está expuesto a un aumento de la presión atmosférica. La exposición a mayor que 1 atmósfera de

oxígeno da como resultado en un aumento de la producción de ROS, y este aumento de la producción de ROS se utilizan

clínicamente para otras indicaciones de HBO, tales como la cicatrización de heridas. ROS, así como especies reactivas

de nitrógeno incluye una variedad de especies tales como los radicales superóxido y H 2 O 2 que son predominantemente

generado por las mitocondrias, además de otros orgánulos tales como el retículo endoplasmático y los peroxisomas [24].

ROS juegan un papel crítico en la función de las mitocondrias, que participan en la señalización, y participar en

importantes reacciones redox [25]. A pesar de la multitud de funciones biológicas ROS participar en, generación excesiva

de ROS se ha implicado en un número de estados de enfermedad patológicos tales como la enfermedad diabetes y el

corazón pero incluyen enfermedades agudas tales como sepsis y paro cardíaco [26 - 28].
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Nuestros resultados muestran que el tratamiento inicial HBO en el grupo de CO resultó en un aumento significativo en H 2 O

2 producción más probable en relación a HBO con aumento de oxígeno. Cabe señalar que H 2 O 2 la producción es elevado en

prácticamente todos los estados en el grupo de CO después del tratamiento HBO, mucho antes de la adición de Ama lo que

no es el uso de Ama que resulta en un aumento de H 2 O 2 como Ama se utiliza en ambos grupos. Ecuación 1 ilustra la

relación dependiente del tiempo entre la concentración de oxígeno y la formación de superóxido:

re ½
O2
½ ½R • re 1 Þ
dt ¼ k O 2

La producción global de superóxido variará dependiendo del tipo de tejido, el estado respiratorio de la

mitocondria, y la inhibición también mitocondrial. En general, CI y CIII son los sitios primarios de la generación de

ROS, que puede aumentarse aún más con el uso de ciertos inhibidores tales como Rot para CI y Ama para CIII

aunque los resultados han variado dependiendo del tipo de tejido o célula [22].

En nuestro estudio, al comparar CIII (AMA) con IC inhibición (Rot), no hubo diferencia significativa ( P = 0,06). Otro

factor a considerar para la elevada H 2 O 2 en nuestro estudio es el uso de células inmunes para medir H 2 O 2. Ciertas

células del sistema inmune tales como neutrófilos median la eliminación de organismos extraños tales como bacterias

y hongos con el superóxido que se produce por NADPH oxidasas situados en la membrana celular [29]. Otra fuente de

ROS puede ser de activación de células inmunes. Sin embargo, se ha demostrado que los resultados HBO en

disminución de la respuesta inmune a tipos específicos de células tales como monocitos, que es parte de la razón

HBO se utiliza para la curación de heridas [30]. Las implicaciones de aumento de H 2 O 2 la producción en el marco de la

intoxicación por CO y el tratamiento es una cuestión importante, ya que no está claro si esto es patológico o debido al

aumento de la mensajería móvil. Nuestro estudio no aborda el destino de la H 2 O 2 produce ya que puede llegar a

convertirse en H 2 O o un radical hidroxilo, siendo este último un muy potente oxidante. Esto justificar un estudio con

HBO ya que esto puede ayudar a explicar los resultados mixtos de la eficacia de HBO en el tratamiento de la

intoxicación por CO.

El objetivo principal de este estudio fue examinar la medición tanto de la respiración y H 2 O 2 producción, ya que pueden tener

un papel importante en el pronóstico y el tratamiento como una herramienta de cabecera clínica. En nuestro estudio, hemos

sido capaces de obtener tanto la respiración y H 2 O 2

producción en los grupos CO antes de los sujetos sometidos a su tratamiento inicial HBO. Específicamente, somos capaces de

obtener resultados a partir del tiempo de muestra de sangre extraída a los datos en menos de 2 h [31]. No es infrecuente que

el tiempo requerido para que los pacientes se someten a evaluación inicial para el envenenamiento por CO en el ED y luego

ser transportados a las instalaciones para el tratamiento HBO es mayor que este. Nuestro trabajo se describe la medición tanto

de la respiración mitocondrial y H 2 O 2 producción en el envenenamiento por CO. Tiene aplicación potencial como herramienta

de cabecera en la atención aguda y el tratamiento de pacientes que tienen otras formas de disfunción metabólica resultantes

de la intoxicación o sepsis [31].

limitaciones

Hay algunas limitaciones a tener en cuenta con el presente estudio. Una limitación importante es la falta de

inclusión de un grupo control de sujetos sanos que se someten a HBO sin tener ninguna necesidad clínica de dicha

terapia. la terapia de HBO, mientras que con un perfil de seguridad favorable, no está exenta de complicaciones.

Aumenta el riesgo de barotrauma

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incluso a 1,2 ATA y los sujetos pueden experimentar otalgia y barotrauma a otras áreas, como los senos. Otra

complicación es convulsión inducida por oxígeno con un riesgo de hasta 1/100 en 2,8 ATA [32]. En consideración de estas

complicaciones, se optó por no incorporar sujetos voluntarios expuestos a la terapia de HBO. Los estudios futuros podrían

realizar pruebas en pacientes no intoxicados con CO que reciben terapia hiperbárica para una enfermedad no aguda, tales

como la curación de heridas, aunque la profundidad de la inmersión puede ser diferente. Otra limitación es la falta de

sujetos expuestos CO-que no se sometieron terapia de HBO. No está claro cómo tanto la respiración mitocondrial y H 2 O 2 la

producción habría cambiado sin tratamiento HBO. Por razones éticas, la terapia de HBO no haber sido cancelada en

cualquier CO sujeto que se reunió indicaciones para el tratamiento de HBO. Sin embargo, observamos que las medidas

repetidas de la función mitocondrial se podrían realizar en los pacientes que no se sometieron a HBO, ya que muchos

pacientes con envenenamiento por CO no reciben HBO [33]. Una tercera limitación de este estudio es la conexión entre el

uso de células de sangre humana como un marcador de la función mitocondrial en órganos vitales tales como el cerebro y

el corazón que se ven afectados de envenenamiento por CO. Un modelo animal de choque hemorrágico se ha usado para

evaluar las células de sangre como marcador de la función mitocondrial de órganos [34]. La ventaja de usar células de la

sangre como un biomarcador sustituto para evaluar la función mitocondrial órgano es muy atractivo tanto por razones

clínicas y de investigación. Las células sanguíneas son fácilmente accesibles con un riesgo mínimo a través de la punción

venosa, y las muestras se pueden obtener varias veces para evaluar la función mitocondrial en el tiempo y en respuesta al

tratamiento. Finalmente, otra consideración es la novedad de la medición simultánea de la respiración y H 2 O 2 producción.

En este momento, la corriente de ROS que se puede probar fácilmente para es H 2 O 2

y superóxido en cierta medida. Una limitación es que otros ROS tales como especies de base de nitrógeno radicales u

otras hidroxilo no se prueban por lo que puede dar una imagen incompleta que implica ROS.

conclusiones
En este estudio, PBMCs obtenidas de sujetos con envenenamiento por CO confirmado tienen una disminución global en la

respiración pero H similares 2 O 2 la producción en comparación con los controles. En el grupo de CO que todo el tratamiento se

sometieron con HBO, PBMCs obtenidas inmediatamente después del primer tratamiento de HBO mostrado un aumento general

en la respiración y H 2 O 2 producción. Los resultados del estudio demuestran que el tratamiento con HBO resultó en la mejora de

la respiración celular, pero más alta H 2 O 2 producción. No está claro si el aumento de la producción de H 2 O 2 en HBO tratamiento

es perjudicial.

abreviaturas
Ama: antimicina - Complejo inhibidor III; AMR: Amplex roja - fluoróforo extrínseco para la medición de la producción de peróxido de hidrógeno como resorufina; AZD:
Azida - inhibidor de Complejo IV. Para obtener CIV respiración, una vez que se da Tm, esto es seguido por Azd. La diferencia entre los dos proporcionará CIV
respiración; CI-IV: Complejo I-IV; D: difosfato de adenosina (ADP) - sustrato de la sintetasa de ANT y ATP en el sistema de la fosforilación; G: El glutamato - el
apoyo a un estado de control vía ligada a N (Complejo I); GP: glicerofosfato - sustrato para los electrones donación a ubiquinona; HRR: de alta resolución
respirometría (medido con el OROROROS O2K); H 2 O 2: Peróxido de hidrógeno - uno de varios intermedios reactivos de oxígeno; L: respiración FUGA - componente
disipativo de la respiración que no está disponible para realizar trabajo bioquímico; P: capacidad OXPHOS - es la capacidad respiratoria de las mitocondrias en el
estado activado-ADP de la fosforilación oxidativa; PM: piruvato y malato - utilizado para obtener estado FUGAS; R: respiración RUTINA - la demanda de energía
celular, la rotación de la energía y el grado de acoplamiento a la fosforilación a menudo que representa el estado de equilibrio; Rot: rotenona - Complejo I inhibidor;
ROX: consumo de oxígeno residual - respiración debido a reacciones secundarias oxidativas restantes después de la inhibición del sistema de transporte de
electrones (Rot y Ama); RP: protocolo de Referencia - proporciona una línea de base común para la comparación de control respiratorio mitocondrial en una gran
variedad de especies, tejidos y tipos de células (véase la figura 2 por ejemplo de rastreo típico.); S: Succinato - sustrato complejo II; SUIT: titulación
sustrato-desacoplador-inhibidor - secuencia de compuestos dados para obtener diferentes estados de acoplamiento; Tm: Indica la inyección de N, N, N ', norte '- tetrametil-p-fenilendiamina
dihidrocloruro, que es un sustrato artificial
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para la reducción de citocromo do en el ensayo de respirometría para el citocromo do oxidasa actividad (CIV), seguido por el ascorbato que mantiene N, N, N ',
norte '- dihidrocloruro de tetrametil-p-fenilendiamina en un estado reducido; U: hidracina carbonilo cianuro m-clorofenil - un protonóforo (H + ionóforo) y se utiliza
como un desacoplador química potente de la fosforilación oxidativa

Expresiones de gratitud
Gerhard Krumschnabel, PhD de oroboros Instrumentos para la retroalimentación en el H 2 O 2 los datos obtenidos y la Sociedad para Redox Biología y
Medicina (SFRBM) Mini-Fellowship que proporcionó el autor (DJ) fondos para pasar 4 semanas en oroboros Instrumentos para aprender la técnica de la
medición simultánea de la respiración y H 2 O 2 la producción en diversas líneas celulares se reconocen.

Fondos
1. K08HL136858 del Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre (DJ).
2. N000141612100 de la Oficina de Investigación Naval (DME).
3. Colegio Americano de Toxicología Médica (ACMT) -Médico Toxicología Fundación para la Investigación y el Premio de Enseñanza (DHJ y UGK).

autores ' contribuciones

DHJ es el autor principal que lleva a cabo la mayoría de experimento. UGK es responsable de la recopilación de datos clínicos y el procesamiento y preparación de
manuscritos. BPS es responsable por el apoyo estadístico y la revisión del manuscrito. MK, KH, y el DSL son responsables de la inscripción de pacientes y la producción
de manuscritos. DME es el autor principal, que proporcionó orientación crítica para el manuscrito; trabajo estaba en su laboratorio. Todos los autores leyeron y aprobaron
el manuscrito final.

Editor ' s Nota

Springer Naturaleza se mantiene neutral con respecto a las reclamaciones jurisdiccionales en los mapas publicados y afiliaciones institucionales.

datos del autor

1 Departamento de Medicina de Emergencia, División de Toxicología Médica y la Medicina de la Facultad de Medicina de Perelman de la Universidad de

Pennsylvania, John Morgan Building, 3620 Hamilton Walk, Philadelphia 19104, PA, EE.UU..
2 Departamento de Anestesiología y Cuidados Intensivos, Escuela Perelman de Medicina de la Universidad de Pennsylvania, Philadelphia 19104, PA, EE.UU.. 3 Departamento

de Bioingeniería de la Facultad de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Universidad de Pennsylvania, Philadelphia 19104, PA, EE.UU.. 4 Departamento de Medicina de
Emergencia, División de hiperbárico y Undersea Medicina, Escuela de Medicina de Perelman de la Universidad de Pennsylvania, Filadelfia, EE.UU.. 5 Instituto de
Medicina e Ingeniería de la Universidad de Pennsylvania, Filadelfia, EE.UU.. 6 Instituto de Medicina Traslacional y Terapéutica de la Universidad de Pennsylvania,
Filadelfia, EE.UU.. 7 Instituto Cardiovascular de la Universidad de Pennsylvania, Filadelfia, EE.UU..

Recibido: 5 Septiembre 2017 Aceptado: 10 Enero 2018

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