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Bioquímica de Proteínas
2017
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Reacción no catalizada
• La reacción no catalizada consiste en un ataque nucleofílico por el
átomo de O del H2O sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico
formando un intermediario tetraédrico.
1) Función digestiva.
a) Extracelular.
b) Intracelular.
2) Turnover proteico.
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Endopeptidasas: clasificación por el tipo
de reacción catalizada
• Pueden ser denominadas en base a la preferencia
por un determinado residuo en P1 o en P1´ (por
ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidil-lisil
endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual
especificidad, hay que distinguirlas (glutamil
endopeptidasas I y II).
Asn proteasas
Asp/Asn
Glu proteasas
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Al 4/5/2017: 5 clanes A, 10 C, 2 G, 15 M, 5 N, 5 P y 12 S. 16 familias A, 71 C,
2 G, 72 M, 7 N, 44 P (incluyen 4 familias T), 36 S y desconocidas 10. 11
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA.
1.SUSTRATOS PROTEICOS.
4) Proteínas específicas.
a)Colágenos para colagenasas.
b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de
su mRNA), para las proteinasas del péptido señal.
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos (125I en Tyr).
Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante.
b) Ensayos de ELISA
Determinación de colagenasa. Ab anti-colágeno, revelado con Ab
contra la IgG usada conteniendo un cromóforo adecuado.
2. SUSTRATOS SINTETICOS:
a) 4-nitroanilidas (NH-Nan):
Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A400 nm difiere en
aprox.10.000 M-1cm-1 entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina
a pH 8.0.
Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas.
b) 2-naftilamidas (NH-Nap):
La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere
de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M-1cm-1. Esto depende del
pH: por debajo de 5.5 no hay diferencia.
Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina
libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con
una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto
insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución).
c) Amidas y ésteres:
La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo
la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad.
Ensayos fluorimétricos:
a) 2-naftilamidas:
3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación.
Sensible al pH. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm.
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Estructura de la quimotripsina (D. Blow, 1967)
Mecanismo de reacción
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Uniones que intervienen en la estabilización del intermediario
tetraédrico.
Especificidad de sustrato: el subsitio S1
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Subtilisina:
una proteasa bacteriana
• No apparent evolutionary relationship
to mammalian chymotrypsin/trypsin
family (no primary structure or tertiary
structural resemblance)
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Activación del tripsinógeno
• A variety of digestive proteases are synthesized in the pancreas as inactive
proenzymes, so that they don’t start to attack the cells that make them. Digestive
proenzymes are stored in the pancreatic cells as secretory granules, and empty
into the duodenum via the pancreatic duct.
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La tripsina es el activador común de las
proenzimas pancreáticas
K I
R I
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Inhibidores de emergencia
• Trauma to the internal organs that damages the pancreas can cause pancreatitis,
an unpleasant and painful condition in which traces of trypsin leak out and attack
cells, activating their stored zymogen granules. The result is an escalating
tendency of the pancreas to digest itself and surrounding organs.
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SERPINAS
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• En muchos casos se forma un complejo tetraédrico con el
inhibidor, que es clivado por la proteinasa y se forman
complejos covalentes. Las serpinas clivadas tienen
estructuras conformacionalmente mas estables que las
nativas. El clivaje induce un cambio conformacional mayor, y
los dos residuos que formaban la unión reactiva quedan en
sitios opuestos de la molécula. 34
Serpinas asociadas con enfermedades
en humanos
• La Alfa 1-antitripsina protege a los tejidos de las
proteasas presentes principalmente en las células
inflamatorias, en especial la elastasa. La deficiencia
de alfa-1 antitripsina (trastorno hereditario) lleva a
una degradación tisular durante la inflamación. Esto
causa enfisema pulmonar y lleva a la cirrosis
hepática en casos severos.
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