Introducción

Desde los albores de la vida, los organismos han competido unos con otros para

sobrevivir, desarrollando así, estrategias para tener una ventaja con respecto a otro ser

vivo, incluyendo un organismo superior. Llegado a este punto, se nombra virulencia a

la capacidad para dañar o producir una enfermedad, la cual han mejorado y

perfeccionado cada vez algunos organismos. El género Aeromonas ha sido asociado a

infecciones extraintestinales en humanos, además de ser un patógeno principalmente

de animales acuáticos. (Kimball 1982)

1. El Género Aeromonas.
Debido a sus características Bioquímicas, sus integrantes han sido confundidos

con bacterias de la familia Vibrionaceae, pero Taxonómicamente son diferentes,

perteneciendo a la familia Aeromonadaceae, diferencia que pudo observarse al analizar

las secuencias de los genes 16S rRNA y 5S rRNA. El género Aeromonas se caracteriza

por poseer individuos con forma de bacilos cortos, de una medida de 0.3-1 x 1-3.5 m,

Gram-negativos, que poseen un flagelo polar, con excepción de A. salmonicida y A.

media, son organismos aerobios facultativos, dan positivo para las pruebas de oxidasa

y catalasa, reducen nitrato a nitrito y fermentan la D-Glucosa como principal fuente de

energía. Pueden crecer con una concentración máxima de 3% de NaCl, pero no es

necesario el sodio para su crecimiento, producen gas, pueden utilizar el manitol, no

producen pigmento en su mayoría, pero puede presentarse uno de color café, no

[- 1 -]
presentan sensibilidad a vibriosato2, 4-diamino-6,7-diisopropilpteridina.

Generalmente producen enzimas extracelulares, de las cuales muchas están

consideradas factores de virulencia. (Castro, 2002; Brock, 1991)

El género Aeromonas está considerado patógeno oportunista, asociado a la

producción de enterotoxinas, citotoxinas y hemolisinas. Se le ha descrito a este género

con una gran capacidad de adhesión e invasión. Generalmente sus factores de

virulencia están codificados a nivel cromosomal, pero pueden presentar algunos

factores de virulencia diferentes que se encuentran en plásmidos, lo cual puede

aumentar su virulencia. (Longa, 2005) Suelen ser patógenos para animales de sangre

caliente y sangre fría. Se han hallado Aeromonas en aguas residuales, tratadas y hasta

potables, lo cual indica un riesgo para la salud humana, los cuales se pueden contagiar

mediante contacto directo con agua contaminada, ingesta o aspiración. Se ha

encontrado una mayor población de estos organismos cuando las temperaturas son

mayores a 20°C, y son escasos a temperaturas cercanas o inferiores a 5°C. (Ausina,

2006)

Una de las cepas más estudiadas es A. hydrophila debido a que es la especie

más reportada en los casos clínicos. Su tiempo de generación es breve y su pH de

crecimiento varía de 5.5-9. Tiene importancia clínica debido a que puede causar

gastroenteritis leve, diarrea tipo cólera y disentería en el hombre. Produce una

enterotoxina termolábil que se puede neutralizar con la antitoxina del cólera. También

puede verse asociado a bacteremia, osteomielitis, ulceras cutáneas e infecciones para

el tracto urinario. Es un patógeno de anfibios y reptiles. Es resistente a algunos

antibióticos como la ampicilina, y en ciertas ocasiones también para estreptomicina y

[- 2 -]
tetraciclina (Braude, 1984).

Las Aeromonas están consideradas microorganismos ambientales. Aeromonas

trota es un microorganismo que ha sido asociado con meningitis y con gastroenteritis

(Dallagasa, 2018; Reina, 1995). Debido al parentesco que presentan con otros

organismos, es necesario identificar genéticamente también, mediante la copia del

DNA de las subunidades 16S rRNA mediante PCR y posteriormente realizar cortes con

enzimas de restricción para conocer exactamente la especie de cualquier cepa aislada.

(Khan, 1996; Albert, 1996).

2. Identificación fenotípica a nivel de género

Ya se han mencionado antes las pruebas bioquímicas que se deben realizar para

identificar un microorganismo. A partir de las pruebas microbiológicas (tinción de

Gram, morfología colonial y microscópica, pruebas de motilidad…) se tiene la primera

parte de identificación, las pruebas bioquímicas dan el siguiente paso, en el cual se

conoce también el metabolismo del organismo, así como las condiciones a las que

puede sobrevivir como es la prueba de presencia de Oxidasa, presencia de Catalasa,

reducción de Nitratos, concentración optima de NaCl para crecimiento, pH óptimo de

crecimiento (Brock, 1993).

3. Factores de virulencia
Los microorganismos patógenos (que pueden producir enfermedades) que se

encuentran en relación con la enfermedad en determinado organismo, se pueden

[- 3 -]
desarrollar en los tejidos del organismo vivo y dependiendo su grado de patogenicidad,

producir infección. Se tienen dos tipos de organismos patógenos: los circunstanciales

u oportunistas, y los patógenos verdaderos.

Los oportunistas, son aquellos que solo producen enfermedad cuando entran al

tejido del cuerpo, no pueden invadir tejidos de organismos sanos, pero una vez en estos,

pueden producir una infección grave o mortal. En cambio, los patógenos verdaderos

pueden invadir los tejidos de organismos sanos. La virulencia se puede definir como la

relación entre parasito-huésped con producción de lesiones tisulares que llevan a una

enfermedad. Es considerada una medida cuantitativa del grado de patogenicidad,

siendo determinada por factores de invasividad y toxicidad del patógeno. Algunos de

estos factores son la adherencia, la capacidad para introducirse en el huésped, la

capacidad de crecimiento con los nutrientes del medio, o la destrucción de los tejidos

ocasionada por las toxinas. Todo esto se rige por la relación entre el número de

patógenos que entren al cuerpo, la vía de entrada, y el huésped, ya que, un organismo

virulento puede producir enfermedad en algunos individuos, mientras que en otros de

la misma especie puede no producirse la enfermedad. Esto es: la capacidad de invadir

y desarrollarse en los tejidos, y la capacidad de intoxicar los tejidos.

Se tienen identificados diversos factores de virulencia asociados a la

patogenicidad. Uno de estos es la producción de toxinas, estas sustancias se clasifican

en dos categorías: exotoxinas (las cuales se difunden en el medio y se mantienen fuera

de la célula), y las endotoxinas (que se encuentran dentro de la célula, y se liberan al

haber lisis). Otras propiedades asociadas a la capacidad invasora es la reducción de

hemolisinas que llevan a cabo hemolisis o la disolución de hematíes; leucocidinas que

[- 4 -]
destruyen a los leucocitos; factores coagulasa que gelifican el plasma sanguíneo

permitiendo una mayor adherencia; estreptoquinasa que activa una proteasa, con lo

cual se pierde viscosidad en el plasma sanguíneo; hialouronidasas que aumentan la

permeabilidad de la piel a las toxinas y otros materiales; la motilidad debido a que

permite extender la infección. En la mayoría de patógenos, se encuentran que gran

cantidad de factores de virulencia actúan concertadamente para lograr una infección

con éxito.

La virulencia de un patógeno puede ser calculada mediante estudios

experimentales de la LD50. Frecuentemente se observa que los patógenos conservados

en cultivos de laboratorio sin transferirse a otros organismos durante largos periodos

de tiempo, disminuye su virulencia o se pierde por completo, a este fenómeno se le

llama atenuación, la cual se presenta con mayor facilidad cuando las condiciones de

crecimiento no son las óptimas para la especie. (Brock, 1993; Burdon, 1971)

3.1 Gen aer-hem

Codifica para una aerolisina que es una hemolisina. Se ha demostrado que las

Aeromonas producen al menos dos tipos de estas hemolisinas: una α-hemolisina que

no se expresa a temperaturas inferiores a 30°C que produce una hemolisis incompleta,

una α -hemolisina denominada aerolisina debido a que puede lisar completamente los

hematíes, es termolábil. El gen originalmente fue denominado aerA. La aerolisina

activa se une a glucoproteínas de la membrana celular del hospedador provocando la

lisis y muerte celular después (Ausina, 2006).

[- 5 -]
 3.2 Gen alt y gen ast
Codifican para una enterotoxina citotóxica, la cual produce acumulación de

fluidos. Las células expuestas a esta enterotoxina aumentan su producción de

glucocorticoides y se elevan los niveles celulares d AMPc. La diferencia entre estas

citotoxinas es que una es termolábil (alt) y la otra es termoestable (ast), pueden actuar

sinérgicamente para producir una diarrea grave (Ausina, 2006).

3.3 Gen gcat

Codifica para una lipasa que actúa como hidrolasa sobre los lípidos de

membrana, la glicerolfosfolipido-colesterol-aciltransferasa (Ausina, 2006).

3.4 Gen lafA

Codifica para un flagelo lateral, la presencia de estos flagelos le da a la bacteria

una movilidad más rápida que les permite moverse en superficies sólidas y se ha

asociado a la formación de bio-películas. Existen nueve genes que codifican para estos

flagelos en Aeromonas (Ausina, 2006).

4. Ensayos de identificación de genes.

La detección de factores de virulencia se realiza mediante pruebas fenotípicas

y moleculares. Para la identificación de la presencia del gen se utiliza la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), la cual, posterior a una extracción de DNA cromosomal

se realiza con los iniciadores para cada gen en búsqueda. Por otra parte, se realizan

ensayos sobre medios de cultivo de agar sangre para observar la lectura de los genes

[- 6 -]
para hemolisinas, así como la adición de medio de cultivo líquido donde han crecido

Aeromonas, libre de células a cultivos de tejido para comprobar la síntesis de

enterotoxinas citotóxicas y lipasa a diferentes temperaturas.

[- 7 -]
 Antecedentes
Factores de virulencia asociados a la enteropatogenicidad en cepas de

Aeromonas spp. aisladas de niños con diarrea en Mérida, Venezuela. Se estudiaron

las heces de 397 pacientes con diarrea, y se tomaron 121 sin diarrea para conformar el

grupo control, en el estado de Mérida, Venezuela. El estudio fue realizado entre junio

de 1993 y diciembre de 1994. Se identificó el género Aeromonas en el 11.83% de la

población con diarrea, y en el 5.78% del grupo control. Al estudiar la patogenicidad de

las cepas obtenidas, se observó que todas tenían al menos una cualidad patogénica. Se

aislaron 23 A. caviae, 16 A. hydrophila, 2 A. trota y 1 A. veronii. En este estudio se

observa como entre más contacto tienen los organismos con los humanos, más

presentan factores de virulencia, así como que A. trota es una cepa de poco aislamiento,

pero que resulta patogénica como otros organismos del mismo género (Longa 2005)

El género Aeromonas. ¿Un patógeno importante en México? Debido a su

alta presencia en el país, el estudio analiza los factores de virulencia de algunas cepas

de Aeromonas, busca que la población sea consciente del peligro debido a estos

patógenos, y por ello el género Aeromonas sea estudiado con mayor frecuencia por los

científicos y no solo clínicamente como es rutinario. Debido a esto detalla los factores

de virulencia y en su muestra poblacional de Aeromonas aisladas, A. trota representa

el 0.8 %, además de proporcionar todos los medios necesarios para que sea fácil

identificar a los miembros de este género. También se menciona la relación entre los

[- 8 -]
organismos y su ambiente, la importancia tanto para la salud, como la importancia

ecológica de llevar cabo los estudios (Castro 2002)

Un detallado de Aeromonas spp. y Vibrio spp. en aves marinas del sudeste

de Brasil: resultados para la salud pública. El articulo habla de un aislado de

Aeromonas a partir de materia fecal de aves. El estudio muestra la facilidad con la cual

es probable aislar estos organismos, ya sean Aeromonas o Vibrio a partir de estas

fuentes naturales, además que se realiza un análisis genético donde se copian los genes

de virulencia de las cepas de estudio. También analiza el ambiente y el cómo influye

en la dispersión de los patógenos, así como en su resistencia a antimicrobianos en cada

una de las cepas. Por otra parte se observa que de su total de cepas aisladas, A. trota

representa apenas el 2.5% de cepas aisladas en el estudio (Cardoso 2017).

Gastroenteritis causada por A. trota en un niño. Debido al análisis realizado

a la diarrea que presentaba un niño español enfermo, y a la caracterización del

patógeno, se llegó a que fue una A. trota la causante de la diarrea que lo aquejaba.

Conclusión a la que se llega después de analizar mediante pruebas bioquímicas y

pruebas microbiológicas el patógeno causante. Confirmando también, la presencia de

estos organismos en el mediterráneo y declarando así que este género tiene una

distribución mundial, de ahí la importancia de seguirlas estudiando (Reina 1995).

Caracterización de cepas de Aeromonas trota aisladas de fluido

cerebroespinal. Este trabajo fue realizado para encontrar el desarrollo de las cepas de

[- 9 -]
Aeromonas trota en fluido cerebroespinal, para que la inmunidad del paciente no se

vea comprometida en el caso de hallarse las cepas en un paciente con meningitis. Las

cepas se identificaron mediante pruebas bioquímicas y biología molecular, y se

determinó susceptibilidad a la ampicilina, pero resistencia a cefatolina y cefazolina. Se

buscaron factores de virulencia, hallándose aerolisina y flagelos laterales. Es el primer

reporte de A. trota asociada a meningitis (Dallagassa 2018).

Identificación de Aeromonas trota (grupo de hibridación 13) mediante la

amplificación del gen de aerolisina usando la reacción en cadena de la polimerasa.

La detección rápida e identificación de A. trota es importante para el diagnóstico

especifico de las enfermedades infecciosas que causa. La PCR es la técnica con la que

amplificaron la secuencia del gen aerA que posee A. trota. la identificación del

fragmento de 622 pares de bases (bp) fue confirmado por una digestión con la enzima

endonucleasa de restricción BamH1 para producir un fragmento de 557 bp y

fragmentos de 65 bp. Diluyeron una suspensión de bacterias y amplificaron mediante

la PCR resultando en niveles detectables de producto. Debido a la confiabilidad del

método sugieren el uso de la PCR para identificar A. trota de manera clínica, ya que

“es rápido, sencillo y no requiere purificar el DNA” (Khan 1998).

Distribución de 13 genes de virulencia entre Aeromonas spp. Clínicos y

ambientales en Australia Occidental. Se evaluó la patogenicidad de aislamientos de

Aeromonas, de las cuales 98 eran clínicas, y 31 ambientales para detectar la presencia

de 13 genes de virulencia utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Como

[- 10 -]
resultados obtuvieron que el 96% poseía genes de virulencia. También observaron que,

de sus cepas, el 48% era de A. hydrophila y 42% de A. dhakensis. Concluyendo que en

el este de Australia A. hydrophila y A. dhakensis son más virulentas que otras cepas

como A. veronii y A. caviae (Araena 2014)

Identificación y caracterización de cepas de Aeromonas spp. Aisladas de

mariscos. En esta tesis, realizada en el laboratorio de ingeniería genética del

departamento de bioquímica de la escuela nacional de ciencias biológicas del instituto

politécnico nacional, se caracterizaron Aeromonas mediante pruebas bioquímicas,

biología molecular y HPLC, obteniéndose 27 cepas aisladas de mariscos listos para

consumo humano, de las cuales 25 eran Aeromonas trota, una A. dhakensis y una

Aeromonas spp. La alta incidencia de esta especie en las muestras contrasta con los

reportes de la literatura donde es una especie que se aísla con baja frecuencia (Díaz

2017)

[- 11 -]
 Planteamiento del problema

¿Podría Aeromonas trota convertirse en un patógeno importante

para la población debido a su alta incidencia de aislamiento en los últimos
años?

[- 12 -]
 Justificación
Algunas especies del género Aeromonas tienen la capacidad de infectar al

humano, y son considerados como patógenos primarios. Las infecciones

gastrointestinales son las de mayor frecuencia. Se ha determinado que A. hydrophila,

A. caviae y A. veronii son los principales agentes causales de diarrea. El resto de las

especies no juegan un papel definido como patógenos primarios. Por lo tanto, en el

presente trabajo se determinará si las cepas de A. trota representan un riesgo para la

salud de los consumidores al identificar la presencia de genes que codifican para

factores de virulencia.

[- 13 -]
 Objetivo general

Identificar la presencia y lectura de los genes de virulencia a

diferentes temperaturas en cepas de Aeromonas trota aisladas de mariscos

para consumo humano.

[- 14 -]
 Objetivos específicos

 Encontrar la presencia de genes de virulencia aerA/haem, lafA, gcat, alt, y ast,

en las cepas de estudio.

 Realizar los ensayos fenotípicos que demuestren la presencia de genes de

virulencia.

 Estudiar el efecto de la temperatura sobre la expresión de genes de virulencia

en las cepas de Aeromonas trota.

[- 15 -]
 Diseño de investigación
Se estudiarán 25 cepas de Aeromonas, en la cuales se llevará a cabo la búsqueda

de factores de virulencia mediante PCR. Posteriormente se realizarán ensayos

fenotípicos de virulencia y su correlación con los genes encontrados. Así mismo se

estudiará el efecto de la temperatura sobre la expresión genética de los factores de

virulencia

[- 16 -]
 Materiales
Los normales de un laboratorio, además de Termociclador y cubas para

electroforesis

[- 17 -]
 Métodos

1. Crecimiento de las cepas

1. Se toma un inoculo del cepario y se coloca en una caja Petri con medio de

cultivo agar Luria, se realiza una estría cruzada para obtener colonias aisladas y se

incuba a 37°C en una estufa.

2. Se toma un inoculo de una colonia aislada y se coloca en un tubo con 5 ml de

medio de cultivo caldo Luria, se coloca en la estufa a 37°C con una agitación de 200

rpm y se deja incubar hasta obtener la densidad óptica deseada.

2. Extracción de DNA cromosomal

1. Inocular en un tubo con 5ml de caldo Luria con la bacteria e incubar a 37°C con

agitación hasta la densidad óptica deseada

2. Centrifugar durante 2 min. A 16000 rpm y eliminar el sobrenadante,

resuspender en 500µl de regulador Tris 50mM / EDTA 20mM (TE 50/20). Centrifugar

2 min a 16000rpm y eliminar el sobrenadante

3. Resuspender el pellet en 375 µl de TE 50/20 y añadir 1.5µl de RNAsa e incubar

a temperatura ambiente 10 minutos.

4. Añadir 20µ de SDS al 10% y 5µl de proteinasa K (20mg/ml) e incubar la mezcla

a 56°C durante 1-2 horas.

5. Adicionar 45µl de NaCl 5M y mezclar por inversión.

6. Añadir 400µl de fenol saturado con tris pH 7.5, mezclar por inversión y

centrifugar durante 5 min a 16000 rpm.

[- 18 -]
 7. Transferir la fase acuosa a un tubo limpio y añadir 500µl de cloroformo-alcohol

isoamílico (21:1), mezclar por inversión y centrifugar a 16000 rpm durante 2 min.

8. Separar la fase acuosa, transferir a un tubo limpio y añadir 0.6 volúmenes de

isopropanol. Centrifugar a 16000rpm durante 10 min a temperatura ambiente y

decantar.

9. Lavar con 1ml de etanol al 70% y centrifugar nuevamente a 13000 rpm durante

5min.

10. Decantar, dejar secar el botón y disolver con 50µl de agua destilada inyectable.

11. Observar la integridad del DNA mediante una electroforesis en un gel de

agarosa al 0.8%

3. PCR
1. En esterilidad, colocar 12.5µl de Master mix (contiene regulador de fosfatos,

DNTP´s, y enzima Taq polimerasa), 1 µl de DNA molde, 1µl de cada primer (F y R) y

completar con agua hasta llegar a 25 µl.

2. Realizar un quick-spin, y llevarlo al termociclador

3. Programar el termociclador: 95°C T. desnaturalización 30s, 58°C T.

alineamiento 30s, 72°C T. extensión (el tiempo varía según el fragmento que desee

copiarse), 30 ciclos y 95°C T. desnaturalización inicial 5min, 72°C T. extensión final

10 min.

4. Verificar el resultado en un gel de agarosa de 0.8%

[- 19 -]
 Cronograma de trabajo
Actividad Febrero- Agosto- Enero-
Julio 2018 Diciembre 2018 Julio 2019
Revisión
bibliográfica
Diseño de la
investigación
Pruebas de
identificación de los
genes mediante PCR
Pruebas
fenotípicas de
expresión genética a
diferentes
temperaturas
Comprobación
de resultados
Análisis de
resultados
Discusión de
resultados
Entrega de
adelanto de tesis 1
Entrega de
adelanto de tesis 2
Entrega de
adelanto de tesis 3
Entrega de
tesis

[- 20 -]
 Glosario
Bacteremia: Presencia de bacterias en la sangre

Cepa: Población de organismos de una misma especie, que comparten la mayor parte

de sus genes, en el caso de la microbiología, todos son descendientes de una misma

célula.

Citotoxina: Sustancia química producida por organismos vivos que son

específicamente toxicas para las células individuales, pueden estar involucradas en

inmunidad o contenidas en venenos.

Enterotoxina: Producto del metabolismo de ciertos microorganismos, son proteínas

de cadena simple.

Hematíes: Glóbulos rojos

Leucocitos: Glóbulos blancos

Osteomielitis: Síntomas, causas y tratamiento de infecciones óseas crónicas agudas.

Termoestable: Molécula química que debido a su estructura altamente reticulada, son

resistentes a altas cargas mecánicas y físicas (como la temperatura)

Termolábil: Sustancia que se destruye al alcanzar una temperatura mas o menos

elevada.

Tisulares: Que tiene que ver con el tejido

[- 21 -]
 Referencias
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