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2.4.5.

4 – Amostragem, Padronização e Calibração

Amostragem

A amostragem é uma das operações mais importantes em uma análise química. As


análises empregam geralmente apenas uma parte da amostra disponível e fazer com que as
frações analisadas sejam representativas de todo o material é parte essencial da análise. A
amostragem, junto com a padronização e a calibração são etapas essenciais de uma análise e que
envolvem conhecimentos de estatística.
A dimensão de uma amostra é muitas vezes usada como critério de classificação dos
métodos analíticos. Assim, temos macroanálise (amostras superiores a 0,1g), semimicroanálise
-2 -4
(amostras entre 0,01 e 0,1g), microanálise (entre 10 e 10 g) e ultramicroanálise (menor do que
-4
10 g). Um laboratório típico trabalha com diversas escalas. As técnicas usadas para amostras
muito pequenas são geralmente diversas das usadas para macroamostras.
Um problema central na análise de amostras reais é o efeito da matriz da amostra, que
pode conter espécies com propriedades química similares às do analito, reagindo com os mesmos
reagentes que o analito, ou mesmo provocando respostas instrumentais dificilmente distinguíveis
daquela do analito. Estes chamados efeito de matriz devem ser considerados na análise.
Uma distinção de nomenclatura é importante neste ponto: amostras são analisadas e
constituintes e concentrações são determinadas.
Muitas vezes a amostragem, processo de coletar uma fração representativa do todo para
uma análise, é a etapa mais difícil de todo o processo e a que limita a exatidão do procedimento.
Geralmente se diferencia entre amostra bruta e amostra de laboratório. A primeira é tirada da
população total e levada para o laboratório, onde é reduzida para normalmente para uma
quantidade menor que é analisada – a amostra de laboratório.
Estatisticamente, os objetivos do processo de amostragem são obter um valor médio que
seja uma estimativa sem tendência da média da população e obter uma variância que seja uma
estimativa sem vieses da variância da população, para que os limites de confiança válidos sejam
encontrados e os testes de hipótese possam ser formulados. Estes objetivos demandam que a
amostra seja aleatória, ou seja, todas partes da amostra tenham probabilidade igual de serem
incluídos na amostra. Freqüentemente se usam técnicas como o uso de tabelas de números
aleatórios para este propósito.
O desvio padrão global de um processo de análise pode ser determinado por:
2 2 2
sg = sa + sm

Onde g, a e m representam o processo global, o processo de amostragem e o do método


empregado. Esta equação nos mostra que é infrutífero despender esforço e tempo para diminuir a
incerteza de um método se a incerteza da amostragem se mantém. Youden determinou que além
do ponto onde sm<sa/3 não há mais necessidade de esforço pra diminuir a incerteza relacionada ao
método.
A preparação da amostra bruta é um processo que demanda cuidados especiais em cada
caso em que se trabalha: soluções homogêneas de líquidos ou gases, sólidos particulados, metais
e ligas, etc. O número de partículas que irá compor a amostra bruta varia entre poucas partículas
12
até 10 partículas, dependendo da incerteza tolerada e da homogeneidade do material. Uma
equação usada para se ter uma idéia do número de partículas é:
2
N = (1-p)/p

Onde p é a probabilidade de se encontrar uma partícula deseja dentro da população, e  é


o desvio-padrão relativo de se retirar as partículas.
A maioria dos materiais é composta por diversos tipos de partículas, mas é prática
facilitadora dividir o sistema de forma hipotética em dois componentes: o componente de interesse
e os demais agrupados como componentes residuais.
Após retirada a amostra bruta a próxima etapa é a separação da amostra de laboratório. O
ideal é que esta retenha a composição da amostra bruta. O número de amostras que devem ser
tomadas da amostra bruta para serem analisadas pode ser encontrado por:

N = t sa /(xm r)
2 2 2

Onde t depende do número de amostras, de forma que o processo é iterativo. S a é o


desvio-padrão da amostragem, geralmente conhecido de experiência prévia, x m é o valor médio da
análise e r é a incerteza tolerada.
Terminadas as etapas de amostragem e definido o número de amostras e réplicas, a
próxima etapa é o processamento das amostras. Devido a maior velocidade alcançada, maior
confiabilidade e até menores custos, muitas etapas tem sido automatizadas. Os métodos de
automatização são divididos em discretos e contínuos.

Padronização e Calibração
Com exceção de alguns poucos métodos analíticos absolutos, como os métodos
gravimétricos e alguns métodos gravimétricos, todos os métodos analíticos tem nos processos de
calibração e padronização parte importante. A calibração é o procedimento que determina a
relação entre a resposta analítica e a concentração do analito. Geralmente isto é feito com o uso
de padronização – uso de padrões químicos.
A primeira técnica que consideraremos é a comparação com padrões. Esta pode ser
direta ou por procedimento de titulação.
A técnica de comparação direta era feita, por exemplo, nos primeiros colorímetros, onde a
cor produzida como resultado de uma reação direta era comparada com aquela produzida pela
reação dos padrões. Assim como neste caso, outros procedimentos comparam uma propriedade
do analito ou o produto de uma reação com o analito com um padrão, de maneira que a
propriedade que está sendo avaliada se iguale com aquela do padrão. Alguns instrumentos
modernos usam uma variação deste procedimento com o uso de comparadores e níveis de
referência.
Já a titulação está entre os procedimentos analíticos mais usados e exatos. Nestes
procedimentos soluções padrão de concentração conhecidas são usadas para determinar uma
concentração qualquer. A titulação será vista com mais detalhes em outras partes do resumo.
Uma segunda técnica de padronização é a que usa um padrão externo. Um padrão
externo é aquele que é preparado separadamente da amostra. Prepara-se uma série de padrões
contendo o analito em concentrações conhecidas e em seguida se procede a calibração, obtendo-
se o sinal de resposta (absorbância, altura do pico, área do pico) como função da concentração
conhecida. Tendo este resultado como um gráfico, função, etc. pode-se medir o sinal para a
concentração desconhecida e por comparação com o resultado da calibração determinar-se a
concentração. Esta previsão será tanto melhor quanto melhor seja a calibração e quanto mais
dentro da faixa da calibração caia o resultado previsto. Um exemplo típico de uma curva de
calibração com padrão externo é dado na Figura 1.

Figura 1 – Curva de Calibração com padrão externo


Para o ajuste da curva freqüentemente é usado o método dos mínimos quadrados, que
é um método de regressão linear. Neste método usa-se um modelo de regressão linear do tipo:

y = mx + b

A análise linear dos mínimos quadrados fornece a equação para a melhor linha reta entre
os conjuntos de dados x e y, quando os dados de x apresentam uma incerteza desprezível. A
distância entre um ponto e a reta é chamada de resíduo. Os resíduos são somados e este valor
SSres é minimizado.

SSres = 1 [yi – (b+mxi)]


n 2

Em que N é o número de pontos utilizado. Para simplificar os cálculos três quantidades são
calculadas:

Sxx = (xi – xm) = xi – (xi) /N


2 2 2

Syy = (yi – ym) = yi – (yi) /N


2 2 2

Sxy = (xi – xm)(yi – ym) = xiyi - xiyi/N

Onde xm = xi/N e ym = yi/N


Tendo estas quantidades calculamos:

A inclinação da reta, m: m = Sxy/Sxx


O intercepto, b: b = ym - mxm
2
O desvio-padrão da regressão, sr: sr = raiz [(Syy – m Sxx)/(N-2)]
2
O desvio-padrão da inclinação, sm: sm = raiz (sr /Sxx)
2 2
O desvio-padrão do intercepto, sb: sb = sr.raiz [1/(N-(xi) /(yi)
2 2
O desvio-padrão dos resultados obtidos, sc: sc =sr/m . raiz [1/M + 1/N + (ycalculado médio–ym) /m Sxx]

Onde M é o número de réplicas da análise e N o número de pontos. Além dos valores


acima citados, podemos calcular o coeficiente de correlação, que é uma medida de quanto os
dados se encaixam bem no modelo linear.
2
R = 1 – SSres/Syy

Quanto mais próximo de 1 o valor de R, melhor o ajuste.


Alguns modelos podem ser transformados para o modelo linear:

Função Transformação para a linearização Equação resultante


mx
Exponencial: y=be y’ = ln(y) y’ = ln b + mx
m
Potência: y = bx y’ = log y, x’ = log x y’ = logb + mx’
Recíproca: y=b + m(1/x) x’ = 1/x y = b + mx’

Além das técnicas de comparação de padrões existem outras técnicas que ajudam na
minimização de erros analíticos, que serão discutidas a seguir.
Minimização de Erros em Procedimentos Analíticos
O viés em um método analítico é particularmente difícil de ser detectado. Podemos adotar
um ou mais procedimentos para reconhecer e tentar livrar um método analítico do erro sistemático.
A melhor maneira de estimar a tendência de um método analítico é pelo uso de materiais
de referência padrão – MRP, substâncias vendidas pelos órgãos de padrões como o NIST e
certificadas quanto a conterem uma determinada concentração. Com estes materiais pode-se
determinar se um método está com erros sistemáticos, usando os métodos estatísticos já
discutidos. Caso não exista um padrão, outra forma de proceder é usar um segundo método
analítico, independente e confiável. O método independente deve ser o mais diverso possível do
método original, para minimizar a chance de os mesmo efeitos influenciarem os dois métodos.
Outras providências são o uso de branco, solução que contém o solvente e todos os reagentes
usados na análise, com exceção do analito. Quando viável o branco deve conter constituintes que
simulem a matriz da amostra. Outro procedimento importante envolve variar o tamanho da
amostra, o que diminui o efeito dos erros constantes. Para evitar os erros sistemáticos na
calibração os padrões precisam ser preparados de forma exata e seu estado químico precisa ser
idêntico àquele do analito da amostra. Os padrões devem ser estáveis com relação a sua
concentração, pelo menos durante o processo de calibração.
Além dos cuidados com os erros sistemáticos acima destacados, existem diversas
providências que podem ser tomadas para assegurar a exatidão em procedimentos analíticos. A
maioria delas depende da minimização ou correção de erros que podem ocorrer na etapa de
medida. Entretanto a precisão e exatidão globais também dependem de outros fatores, como
amostragem, calibração, etc.
O tratamento da amostra por métodos de separação, como filtração, diálise e
cromatografia, minimiza os erros devido a possíveis interferências da matriz da amostra. Outro
método é o da saturação, que envolve a adição da espécie interferente nas amostras, padrões e
brancos, de forma que o efeito da interferência se torne independente da concentração original da
espécie interferente na amostra. Outra forma é adicionar uma substância que anule os
interferentes, um modificador de matriz ou um mascarante. Ainda é possível se usar o método
de diluição e o método de equiparação de matriz. O primeiro minimiza o efeito dos interferentes
pela diluição de toda a amostra e o segundo é a adição de componentes que tornem o branco e os
padrões parecidos com a matriz da amostra.
Método importante é o de padrão interno. Neste método uma quantidade conhecida da
espécie que atua como referência é adicionada a todas amostras, padrões e brancos. Então o sinal
de resposta não é aquele do próprio analito, mas sim da razão entre o sinal do analito e da espécie
de referência. O método d padrão interno pode compensar certos tipos de erros se estes
influenciam tanto o analito como a espécie de referência na mesma proporção.
Outro método é o método das adições de padrão, no qual uma quantidade conhecida de
solução padrão contendo o analito é adicionada a uma porção de amostra. As respostas antes e
depois da adição são medidas e posteriormente usadas para obter a concentração do analito.
Alternativamente, as múltiplas adições são feitas a diversas porções da amostra. A adição de
padrão considera sempre uma resposta linear, algo que deve sempre ser confirmado.
Figuras de Mérito em Métodos Analíticos
Os procedimentos analíticos são caracterizados por inúmeras figuras de mérito, como
exatidão, precisão e sensibilidade. Já falamos sobre precisão e exatidão em seção anterior.
A palavra sensibilidade é usada muitas vezes de forma indiscriminada e incorreta para se
referir a métodos analíticos. A definição mais freqüentemente usada é de sensibilidade da
calibração, que é a inclinação da curva analítica. Se a curva analítica for linear a sensibilidade será
uma constante, mas se não for variará com a concentração e será diferente em cada ponto da
curva. A sensibilidade da calibração não indica quais as diferenças de concentração podem ser
detectadas, de forma que algumas vezes é usado o termo sensibilidade analítica – razão entre a
inclinação da curva analítica e o desvio padrão do sinal analítico a uma dada concentração.
O Limite de detecção (LD) é a menor concentração que pode ser distinguida com um
certo nível de confiança e existe em toda técnica. É a menor concentração que pode ser detectada,
mas não necessariamente quantificada. Um cálculo para o LD onde existe uma curva analítica é:

LD = ksb/m

Onde k é um fator de confiança para uma dada probabilidade (geralmente 2 ou 3,


correspondendo aos níveis de confiança 92% e 98%), sb é o desvio padrão do branco e m é a
sensibilidade da calibração. Os limites de detecção relatados por fabricantes são geralmente feitos
em condições ideais e servem para comparação de métodos ou instrumentos, não sendo sempre
aplicáveis a amostras reais.
O Limite Inferior de quantificação (LQ) é a menor quantidade de analito que pode ser
medida com precisão razoável, ou seja, quantificado. Geralmente é definido como:

LQ = 10s/m

A faixa dinâmica linear é definida como a faixa de concentração que pode ser
determinada com uma curva de calibração linear. O limite inferior é geralmente o limite de detecção
(embora um questão da PF, mostrada adiante considere como sendo o LQ) e o limite superior é a
concentração acima da qual a resposta desvia-se da resposta linear por algum fator, geralmente
5%. Existe um limite superior, pois os desvios de linearidade são comuns em concentrações
elevadas por conta da resposta não ideal de detectores ou devido a efeitos químicos. Algumas
técnicas como a absorção espectrofotométrica são lineares apenas em uma ou duas ordens de
grandeza. Estes conceitos estão na Figura 2.

Figura 2 – Curva analítica da resposta pela concentração


A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas
e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal.
Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliação da robustez.
Constatando-se a susceptibilidade do método à variações nas condições analíticas, estas deverão
ser controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento.
A especificidade é a habilidade do método analítico de medir e diferenciar o analito de
outros componentes que possam estar presentes na amostra.
Após as análises temos a etapa de validação, antes da liberação dos resultados. Este
processo se inicia com a validação das amostras e dos métodos utilizados. Então os resultados
são apresentados com limites de incerteza válidos, após uma verificação global ter sido realizadas,
com o intuito de eliminarmos erros na amostragem e no manuseio de amostras, na realização das
análises, na identificação das amostras e nos cálculos realizados. A validação muitas vezes é feita
pelo analista, podendo ser também feita por um supervisor.
A apresentação de resultados das análises varia de laboratório para laboratório. Se
apropriado pode-se seguir um livro sobre procedimentos de boas práticas de laboratório.
Geralmente os resultados analíticos devem ser apresentados com um valor médio e o desvio
padrão. Algumas vezes o desvio padrão em relação a média é fornecido no lugar do desvio em
relação ao conjunto de dados. Ambos, porém, são válidos desde que isto esteja claro na
apresentação. O limite de confiança de 95% é geralmente usado, por representar um bom
compromisso entre ser muito restritivo e ser muito permissivo. O IC e o nível de confiança devem
ser especificados. Os algarismos são importantes na apresentação dos resultados, devendo ser
baseados na avaliação estatística dos dados. A apresentação gráfica deve incluir barras de erros
nos pontos, indicando, quando possível as incertezas. A validação e a apresentação dos
resultados não são a parte mais glamorosa de uma análise, mas podem ser consideradas como
sendo das partes mais importantes, por serem a parte visível da análise para muitos, quando na
apresentação dos resultados.
2.4.5.3 – Exercícios Resolvidos
Exercícios de Provas da PF
Prova Perito Área 6 – 2001
Prova Perito Área 6 – 2004 - Nacional
Prova Perito Área 6 – 2004 – Regional
Errado
Com exceção de poucos métodos, como os gravimétricos, todos os demais precisam de
calibração.

Correto
Limite de detecção é a menor concentração que pode ser distinguida com um certo nível de
confiança e existe em toda técnica. Sensibilidade é a inclinação da curva analítica.

Exercícios de Outros Concursos

CESPE – Petrobras – Químico de Petróleo


CESPE – Prefeitura de Boa Vista – Químico

CESPE – IAPEN – Perito em Química

CESPE – INMETRO – Pesquisador em Química


CESGRANRIO – Agência Nacional do Petróleo – Especialista em Química

CESGRANRIO – Petrobras – Químico de Petróleo 2006


Outros exercícios
1 – Um material de recheio de coluna cromatográfica consiste em uma mistura de dois
componentes. Considere que a partícula média do material que está sendo amostrado seja
aproximadamente esférica com raio de 0,5mm. Grosseiramente, 20% das partículas parecem ser
da cor rosa e tem 30% do seu peso formado por uma fase polimérica ligada. As demais partículas
3
tem uma densidade de 0,24 g/cm e contém pouca ou nenhuma fase estacionária polimérica. Para
uma incerteza abaixo de 0,5% a amostra bruta precisa conter pelo menos 5,3g do material.

Correto
Primeiramente calculamos os valores médios para a densidade e para a porcentagem do polímero:
3
d = 0,2x0,48 + 0,8x0,24 = 0,288 g/cm
3 3
P = (0,2x0,48x0,30 gpolímero/cm )/(0,228 gamostra/cm )x100% = 10%

O número de partículas para uma dada incerteza é:


2
N = (1-p)/p

Que se desdobra para o caso de dois tipos de partículas com densidades e probabilidades d a,db,
PA e Pb:

N = p(1-p)(dadb/d ) [(Pa-Pb)/P]
2 2 2
2 2 2 5
N = 0,20(1 – 0,20)(0,48.0,24/0,288 ) ((30-0)/(0,005x10)) = 1,11x10 partículas necessárias
5 3 3 3
Logo o peso da amostra é de 1,11x10 partículas x 4/3(0,05) cm /partícula x 0,288 g/cm ou 5,3g.

2 – A determinação de cobre em uma amostra de água do mar fornece um valor médio de 77,81
g/L e um desvio padrão sa de 1,74 g/L. Para se obter um desvio padrão relativo de 1,7% a um
nível de confiança de 95% precisamos realizar menos de 5 análises.

Errado
Usamos a equação para o cálculo do número de amostras de laboratório. Este processo será
iterativo.

N = t sa /(xm r)
2 2 2

Começando usando um valor de número de graus de liberdade infinito encontramos para 95% de
confiança o valor de t=1,96. r = 0,017 (do enunciado), xm = 77,81 e portanto:
2 2 2 2
N = (1,96) (1,74) /[(0,017) (77,81) ] = 6,65

Se arredondarmos para 7, teremos 6 graus de liberdade e encontraremos o valor de t=2,26 na


Tabela de t. Usando este valor encontramos, em seguida, N= 10,38 e continuando a iteração, 8,84
e por fim um valor próximo de 9. Porém, só a primeira iteração já nos mostraria que são
necessárias mais de 5 análises, contradizendo o enunciado.

3 – Um perito está trabalhando na determinação de um componente em produto falsificado, cuja


concentração é de cerca de 0,05g. Nesta situação ele está trabalhando numa ultramicroanálise.

Errado
Ele está trabalhando numa semimicroanálise (entre 0,01 e 0,1g). Uma ultramicroanálise envolve
-4
amostras abaixo de 10 g.
4 – Um perito precisa determinar um agrotóxico no sangue de trabalhadores encontrados mortos e
com suspeita de envenenamento. Após prévio tratamento da amostra ele procedeu uma curva de
calibração para padrões com concentração conhecida deste agrotóxico. Os valores estão dados a
seguir.

Porcentagem molar Área do pico


2 2
xi yi xi yi xiyi
0,352 1,09 0,12390 1,1881 0,38368
0,803 1,78 0,64481 3,1684 1,42934
1,08 2,60 1,16640 6,7600 2,80800
1,38 3,03 1,90440 9,1809 4,18140
1,75 4,01 3,06250 16,0801 7,01750
____ ____ _______ ______ _______
5,365 12,51 6,9020 36,3775 15,81992

Após fazer esta padronização o perito fez 4 medidas de uma amostra de interesse e encontrou o
valor de pico cromatográfico de 2,65. Sabendo que a concentração letal para o ser humano é de
1,2%, o perito pode concluir que os trabalhadores provavelmente morreram por envenenamento.

Correto
A equação para a inclinação e intercepto no método dos mínimos quadrados é:
m = Sxy/Sxx e b = ym - mxm
Por outro lado,
Sxy = (xi – xm)(yi – ym) = xiyi - xiyi/N = 15,81992 – (5,365x12,51)/5 = 2,39669
Sxx = (xi – xm) = xi – (xi) /N = 6,90201 – (12,51) /5 = 1,14537
2 2 2 2

ym = yi/N = 12,51/5
xm = xi/N = 5,365/5
Logo:
m = 2,39669/1,14537 = 2,0925 ≈ 2,09
b = 12,51/5 – 2,0925x5,365/5 = 0,2567 ≈ 0,26
O valor encontrado para y foi de 2,65, logo:
x = (y-b)/m => x = (2,65-0,2567)/2,0925 = 1,144%
Resta, porém, calcular o desvio dos resultados:
2 2
sc= sr/m . raiz [1/M + 1/N + (ycalculado médio–ym) /m Sxx] =
2 2
0,1442/2,0925.raiz[1/4+1/5+(2,65-12,51/5) /(2,0925 .1,145)] = 0,046%

Portanto o resultado da análise foi 1,144±0,046% e como o valor letal é de 1,2% o perito tem bons
motivos para suspeitar de envenamento.

5 – Um perito que tenha que escolher entre um método com coeficiente de correlação de 0,99 e
outro com 0,85 deve escolher o segundo por ter menor erro residual.

Errado
Deve escolher o primeiro método. Quanto mais próximo de 1 mais próximo o método do modelo
linear e menor o erro residual.

6 – Um método é considerado robusto na medida que resiste as mudanças sem grande perda de
precisão.

Correto
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a pequenas e
deliberadas variações dos parâmetros analíticos.