CATEDRA: VIROLOGIA

TEMA:EXTRACCION DE ADN Y PCR

CONTENIDO
Generalidades sobre el ADN Muestras para extracción del ADN

Condiciones sobre la remisión de muestras.

Métodos de extracción del ADN
EL MATERIAL GENÉTICO
CROMOSOMAS
46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES
UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE
EL MATERIAL GENÉTICO
Es el responsable de transmitir caracteres heredados de una generación a otra. los

Está conformado por millones de unidades de nucleótidos

Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo
fosfato
EL MATERIAL GENETICO
BASES NITROGENADAS
BN BN BN ADENINA GUANINA P
A

BN

BN

CITOSINA
TIMINA P

BN

BN

A
MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN

Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN


PROTECCION DEL PERSONAL

Prevenir contacto directo Condiciones de asepsia Vacunación

MATERIAL
HUMANO.

PROTECCION DE LA MUESTR A CONTAMINACION POR

BIOLOGICO
CAUSADA POR

MICROORGANISMOS

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA

LA TEMPERATURA LA HUMEDAD
Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN
 CONTAMINACIÒN QUÌMICA
TECNICA PRODUCTOS QUIMICOS QUE PUEDEN ALTERAL LA DEL PCR

 TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS

PUEDE OCUSACIONAR LA PERDIDA DE LA MUESTRA FENÓMENOS

 DEGRADACION DE LAS MUESTRAS

INSECTOS

METEOROLÓGICOS

HUMEDAD AMBIENTAL ACCIÓN DE

 Detección de mutaciones

Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual)

Secuenciación de ADNs fósiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría
están dañadas o degradadas)

Diagnóstico de enfermedades genéticas

Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o

determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de
fecundación in vitro

Identificación de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más
barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciación de genomas

Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc...

(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a

partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)
Obtención de vacunas recombinantes
Extracción del ADN del virus

(aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

ADN plásmido bacteriano

Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levadura

La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico

Inyección de proteínas víricas en un chimpancé

Diagnóstico de enfermedades de origen genético
ADN sano ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo

Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje

fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo

ADN complementario del ADN enfermo

DIAGNÓSTICO

Biochip Microarray DNAchip

Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalía

¿Hibridación? Renaturalización ¿No hibridación? del ADN con la sonda fluorescente
Desnatura lización del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar
EXTRACCION DE ADN
• • • • • ORGANICA CHELEX PAPEL FTA SALTING OUT Pueden depender en
– Protocolos de LAB – Tipo de muestra
Preparación de Muestra
• Extracción de ADN Orgánica

• Extracción por Chelex

• Extracción de ADN utilizando papel FTA
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
• PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)
– PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR – CONSUME MUCHO TIEMPO – QUIMICOS PELIGROSOS –
MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)
EXTRACCION ORGANICA DE ADN
• COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO • AÑADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
– ROMPE LAS CELULAS (SDS) – ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

• AÑADA FCI => Fenol “ disuelve” proteínas y lípidos

– Particiona macromoléculas basado en propiedades hidrofóbicas e hidrofílicas –
Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol – Alcohol Isoamyl disminuye la
espuma

– ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA

FENOL CLOROFORMO
• •
• • VENTAJAS Técnica Orgánica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad.
Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza
digestión con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser
lavado. DESVENTAJAS: Reactivos altamente tóxicos Perdidas significativas de ADN y
mucho mas si esta degradado.

-
EXTRACCION POR CHELEX
• RESINA QUELANTE

• REMUEVE MAGNESIO
• (INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)

• ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA

CELULA • UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)
EXTRACCION POR CHELEX
• AÑADA MUESTRA AL TUBO • AÑADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX • 100°C PARA ROMPER
CELULAS
– DESTRUIR PROTEINAS

• ADN ES DESNATURALIZADO A CADENAS SENCILLAS • UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN

PCR
CHELEX
VENTAJAS • Técnica inorgánica • Previene la degradación del ADN por quelación de
los iones metálicos durante la ebullición al 5%. • Tiene copolimeros de estireno
dibenzeno- inones iminodiacetato. • los reactivos no son tóxicos y no se pierde
ADN. DESVENTAJAS: • El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no
en RFLPS.
Podemos obtener diferentes muestras de ADN humano para su extracción, aislamiento y
purificación, con el objetivo de ser empleado en diferentes estudios de carácter
genético, biológico. y/o bioquímico.
EXTRACCION CON PAPEL FTA™
 PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA  CONTIENE QUIMICOS
 PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

 ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AÑOS  UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE
VICTIMAS O SOSPECHOSOS
Tecnología FTA®
 Rompe células y membranas de organelos
-Físicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)

 Preserva y Proteje Acidos Nucleicos

-Previene Daño por radicales libres/UV -Previene Daño Enzimático -Inhibe
crecimiento de hongos y bacterias

 Provee Seguridad al Usuario

-Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos
CARACTERISTICAS Y VENTAJAS
EXTRACCIÓN DE PAPEL FTA™
 CUANTIFICACIÓN NO es necesaria
 Cantidad de muestra consistente  Resultados consistentes

 Posible AUTOMATIZACIÓN
SALTING-OUT
• Técnica de tipo inorgánica • Utiliza reactivos bajos en toxicidad • Permite
visualizar la malla del ADN.
Toma de muestra • Colectar 0,5 mL de sangre periférica en un tubo de 1,5 mL estéril
conteniendo 20 μl de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversión fuerte para garantizar
homogenización. • Conservar en refrigeración hasta su procesamiento, el cual deberá
realizarse en un plazo no mayor de 48 horas después de haberse realizado la toma de
muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las células
nucleadas.
SALTING OUT
1. Lisis Celular 2. Extracción 3. Precipitación 4. Resuspensión
LISIS CELULAR
• • Buffer de lisis I: (lisis glóbulos rojos). Sucrosa MgCl2 1M Triton x 100 Buffer
de lisis II: (lisis glóbulos blancos) EDTA de Na NaCL.
EXTRACCION
• Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas • Perclorato de sodio
5M • NaCl 6M
PRECIPITACION
• Isopropanol

• Etanol al 70% lava el exceso de sales.

RESUSPENSION
• Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o también se puede realizar en agua.
CONCLUSIONES
• El ADN es el material genético a través del cual se transmite la información
contenida en los genes de generación en generación. • El ADN esta presente en los
indicios biológicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. • Es muy
importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. • El
Salting-out es uno de los métodos de extracción de ADN mas utilizados por su fácil
implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.
TIPOS DE PCR
TIPOS DE PCR

Anidada

In situ

Transcriptasa inversa

Tiempo real

Multiplex
PCR anidada
• Comprende dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o
primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de detección. •
Primero se realiza una reacción con los iniciadores externos para amplificar una
región de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana. Después, con este
producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos
para amplificar la región específica. • Este tipo de PCR tiene la ventaja de
brindar alta sensibilidad y especificidad. La desventaja de ésta técnica es que no
nos permite cuantificar la muestra.
PCR in situ
• para la PCR in situ incluyen la fijación y la permeabilización durante la
preparación de la muestra, un mecanismo para ciclación y el material celular en la
solución o en laminillas de cristal • Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las
células o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar
la morfología y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias
intracelulares que se quieren amplificar. • La amplificación de PCR de las
secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos
microEppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del
tejido fino en laminillas de cristal
RT-PCR
• Es un método sensible para la detección de los niveles de expresión del ARNm. •
Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reacción de RT y la amplificación por
PCR.
ARN es la primera transcripción inversa en cDNA utilizando una transcriptasa
inversa El cDNA resultante se usa como plantillas para su posterior amplificación
por PCR utilizando primers específicos para uno o más genes.
• Es una variante de (PCR) utilizada para amplificar y cuantificar el producto de
la amplificación de ADN. • Para ello emplea, del mismo modo que la PCR
convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un
tampón de reacción adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se
le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que
albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo, permita
medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.

PCR en tiempo real

Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que
también se le denomina PCR en tiempo real.
PCR multiplex
• PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea
dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar
simultáneamente múltiples segmentos de ADN. • Consiste en combinar en una única
reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar
simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades
suficientes.
• Se amplifica mas de una secuencia blanco, que se logra agregando en la reaacion
mas de un par de primers. • Ahorra tiempo y esfuerzo