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Artigo

efeito da resposta cromatográfica


acentuada e induzida pela matriz:
estudo de caso EM tomates
Resumo Maria Helena Wohlers Morelli
Cardoso1, 2*,
Armi W. Nóbrega2 e
A validação de método é um processo para demonstrar se o método de ensaio é capaz de produ- Shirley Abrantes2
zir resultados confiáveis para a finalidade a que se destina. Para alcançar este objetivo é necessária
a verificação de alguns parâmetros de desempenho como, por exemplo, a seletividade. O efeito 1
Doutoranda em Vigilância
da resposta cromatográfica acentuada e induzida pela matriz ou efeito da matriz é um fator avalia- Sanitária pelo programa de
pós-graduação em Vigilância
do de grande magnitude neste parâmetro já que pode afetar acentuadamente as concentrações da
Sanitária do INCQS/FIOCRUZ;
amostra. Este trabalho tem o objetivo de demonstrar a avaliação deste efeito em matriz tomate 2
Laboratório de Alimentos e
para cinco agrotóxicos, γ- HCH, clorotalonil, fenitrotiona, clorpirifós e procimidona. Contaminantes, Departamento
de Química, Instituto Nacional
Palavras-chave: agrotóxicos, tomate, cromatografia em fase gasosa, efeito matriz de Controle de Qualidade em
Saúde / Fundação Oswaldo
Cruz (INCQS/FIOCRUZ)

Summary *
Autora para correspondência:
INCQS/FIOCRUZ -
The validation is a process to demonstrate that the method is able to produce reliable results. Departamento de Química
2
Laboratório de Alimentos e
To reach this objective is necessary to verify some parameters as: selectivity. The matrix-induced
Contaminantes
chromatographic response enhancement or matrix effect is a factor of selectivity and the magni- Av. Brasil, 4365
tude of this effect may affect the sample concentrations. It was presented in this work how the Manguinhos
matrix effect takes action over five pesticides residues γ-HCH, chlorotalonil, fenitrothion, chlo- CEP: 21045-900
rpyrifos and procymidone in tomatoes. Rio de Janeiro. RJ
Fone: (21) 3865-5187
Fax: (21) 2539-6777
Keywords: pesticides, tomato, gas chromatography, matrix effects E-mail: helenawohlers@
hotmail.com

Introdução
Uma das competências de um laboratório para produzir zação. O efeito da matriz pode gerar sérios problemas analíticos,
dados confiáveis é demonstrada pela validação do método de devido a possível super estimação da concentração dos analitos
ensaio (INMETRO, 2007). Desse modo, a extensão do termo (Zrostlìková et al, 2001).
“validação de um método” é bastante ampla e apresentada com O objetivo deste trabalho é apresentar o estudo do efeito da
diversas definições na literatura, além de quais parâmetros de resposta cromatográfica acentuada induzida pela matriz (efeito
desempenho devem ser avaliados (Green, 1996; NATA, 1997; matriz) tomate para cinco agrotóxicos, γ-HCH (organoclorado),
EURACHEM, 1998; Huber, 1998; Wood, 1999; Fajgelj & Am- clorotalonil (isoftalonitrila), procimidona (dicarboximida), fenitro-
brus, 2000; Thompson et al., 2002; INMETRO, 2007). tiona e clorpirifós (organofosforado) utilizando a cromatografia
Um dos parâmetros de desempenho que deve ser avaliado gasosa de alta resolução acoplada a detector por captura de elé-
cuidadosamente se refere ao efeito da matriz ou efeito da respos- trons (CGAR-DCE). Este parâmetro de desempenho foi um dos
ta cromatográfica acentuada induzida pela matriz. Este fenômeno requisitos avaliados no procedimento de validação adotado no
sugere que componentes da matriz presentes na amostra podem estudo para preparação e certificação de um material de refe-
bloquear os sítios ativos no injetor e desse modo prevenir pos- rência a ser usado no controle de agrotóxicos em hortifrutigran-
sível degradação e adsorção de analitos nessa câmara de vapori- jeiros (Cardoso et al., 2005). O protocolo de validação seguido

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não será discutido neste trabalho, devido à sua extensão e será Procedimento analítico multiresíduos
apresentado detalhadamente em outro trabalho.
A extração dos agrotóxicos da polpa de tomate seguiu o mé-
Material e Métodos todo multiresíduos apresentado no fluxograma da Figura 1 (Lee
et al. 1991; General Inspectorate For Health Protection, 1996;
Amostras United States Department of Agriculture – USDA, 2004).

As amostras de tomate, da variedade ‘Styllus’, provenientes Efeito da resposta cromatográfica


da região serrana do Estado do Rio de Janeiro, foram adquiridas acentuada e induzida pela matriz
de uma produção orgânica certificada com o selo de qualidade
ABIO – Associação de Agricultores Biológicos do Estado do Rio O ‘efeito da resposta cromatográfica acentuada e induzida pela
de Janeiro (ABIO, 2006). matriz’ ou ‘efeito matriz’ observado pode causar um aumento ou
Os tomates foram cortados e processados em blender (li- diminuição da resposta do detector de um analito presente no
quidificador com copo de aço inox) de acordo com indicação extrato da amostra comparado ao mesmo analito em solvente
do Codex Alimentarius (2000). Em seguida, a polpa foi mantida em orgânico (Hajšlová et al., 1998; EURACHEM, 1998; Bruce et al.,
recipientes de vidro até o momento da análise. 1998; Zrostlíková et al, 2001, Thompson et al., 2002; SANCO,
2006; INMETRO, 2007).
Padrões e reagentes Zrostlíkova et al. �������������������������������������������
(2001) realizaram a avaliação do efeito ma-
triz por comparação da resposta do detector (áreas medidas) das
Foram utilizados padrões de agrotóxicos, com certificado de soluções padrão dos agrotóxicos em solvente (isooctano) com
análise e grau de pureza superior a 95% (Dr. Ehrenstorfer – Au- aquelas preparadas com o extrato branco da polpa de tomate em
gsburg, Alemanha). Solventes de alta pureza e grau resíduos de isooctano, em todos níveis de concentração estudados. Quando
pesticidas (Merck e Tedia). a média das respostas das soluções preparada na matriz for ≥
Soluções estoque foram preparadas individualmente na con- ou ≤ 20% das médias das respostas das soluções preparadas em
centração nominal de 100 µg/mL e soluções intermediárias de solvente, este efeito pode ser considerado significante nos resul-
trabalho contendo a mistura com os 5 agrotóxicos estudados nas tados analíticos quantitativos da amostra.
faixas de 0,003 a 0,4 µg/mL foram preparadas em isooctano a par- Thompson et al. (2002) indicam a necessidade de avaliar se os
tir das soluções estoque preparadas previamente. Estas concen- coeficientes angulares das curvas analíticas obtidas para o solvente
trações das soluções de trabalho foram utilizadas para constru- e para matriz são significativamente diferentes através do teste t
ção das curvas analíticas em solvente e na matriz (extrato branco (Student). Para esse caso indica-se avaliar primeiramente se as va-
da polpa de tomate em isooctano). Para preparação da curva na riâncias residuais das duas curvas são significativamente diferentes,
matriz, 1 mL do extrato orgânico do branco da polpa de tomate através do teste F para em seguida aplicar o teste t mais apropriado
foi evaporado sob atmosfera de N2 e após secura dissolvido em (Snedecor & Cochran, 1989; Bruce et al., 1998; INMETRO, 2007).
1 mL da mistura de agrotóxico em solvente com concentração A estatística utilizada para avaliar esse efeito através da comparação
correspondente ao ponto da curva analítica. Esse procedimento dos coeficientes angulares das duas curvas analíticas é apresentada
foi realizado para cada ponto da curva em questão. na Tabela 1. Se o valor de F calculado for menor que o valor de
F tabelado (Equação 1), pode se considerar que não há diferença
Condições cromatográficas significativa entre as variâncias residuais e que as mesmas são iguais.
Neste caso, a matriz não tem efeito sobre a precisão do método
Cromatógrafo a gás HP 6890 (Agilent), equipado com detec- na faixa de estudo avaliada. O teste t (Equação 2) será aplicado
tor por captura de elétrons (Ni63), sistema de injeção automático após cálculo do desvio padrão agrupado (Equação 3). O valor de t
e estação de trabalho - ChemStation. Temperatura do injetor e calculado menor que o valor de t tabelado indica que a matriz não
detector de 210ºC e 300ºC, respectivamente. Coluna 5% fenil afeta o ensaio. Entretanto, se o valor de F calculado for maior que o
metil siloxano - HP 5MS de 30m de comprimento; 0,25 mm de valor de F tabelado (Equação 1) as variâncias não serão considera-
diâmetro interno e 0,25µm de espessura de filme. Programação das iguais demonstrando que a matriz tem efeito sobre a precisão
de temperatura do forno de 80ºC (0 min) @30ºC/min 180ºC (8 min) do método e uma abordagem diferente é considerada. O valor de
@2ºC/min
200ºC (5 min) @6ºC/min 280ºC (5 min). Fluxo de gás carrea- t calculado segue a Equação 4, utilizando os valores das estimativas
dor (Helio) = 1,2 mL/min, fluxo da purga do septo = 2,8 mL/min, dos erros padrão dos coeficientes angulares obtidos através das
fluxo total = 64,1 mL/min, fluxo do gás “make-up” (Nitrogênio) Equações 5 e 6. Se o valor de t calculado for maior que o valor de
= 60 mL/min, modo de injeção “splitless” = 0,75 min, volume t’ (Equação 7), a diferença é significativa demonstrando que o efeito
injetado = 1,0 µL. matriz afeta o ensaio.

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Tabela 1. estatística para avaliação do efeito da resposta cromatográfica acentuada e induzida pela matriz

Avaliação Estatística

s res1 2
*teste F, F = (Equação 1)
s res 2 2
2
Variância residual Onde s res1 = estimativa do desvio padrão residual da curva 1;
2
s res 2 = estimativa do desvio padrão residual da curva 2.
Fcal < Ftab não há diferença significativa, variâncias semelhantes
Fcal > Ftab há diferença significativa, variâncias diferentes

b11 - b1 2
Se Fcal < Ftab ⇒ t cal = ; (Equação 2)
1
S res a
åΣ (x 1 - x1 )2 åΣ (x2 - x2 )2
b =
Onde 11 coeficiente angular da curva 1 (curva em solvente);
b1 2 =
coeficiente angular da curva 1 (curva na matriz);
x1 = x2 =
áreas da curva em solvente e áreas da curva na matriz;
x1 = x =
média dos valores de x1 e 2 média dos valores de x2;
S res a =
estimativa do desvio padrão residual agregado das duas curvas.

(n1 - 2)Sres 2
+ (n2 - 2 )S res2 2 (Equação 3)
S resa = 1

n1 + n2 - 4
S res1 =
Onde estimativa do desvio padrão residual da curva 1;
S res2 =
estimativa do desvio padrão residual da curva 2;
n1 = número de medidas da curva 1 e n2 = número de medidas da curva 2.

** Se tcal > ttab o efeito matriz significativo

b11 - b12
Se Fcal > Ftab ⇒ t cal = (Equação 4)
2 2
sb1 + sb1
1 2

b =
Onde b11 = coeficiente angular da curva 1 e 112 coeficiente angular da curva 2;
1

sb1 = estimativa do erro padrão do coeficiente angular da curva 1;


Comparação 1

dos coeficientes angulares sb12 = estimativa do erro padrão do coeficiente angular da curva 2.

2 (Sres )2 (Equação 5) e Sb1 2


=
(Sres )2
2 (Equação 6)
Sb1 = 1

(x ) å (x )
2 2
åΣ Σ
1 2
1 - x1 2 - x2
Sb1 Sb1
1 2
Onde e são as estimativas dos erros padrão dos coeficientes angulares das curvas 1 e 2,
respectivamente.
Se tcal > t’ o efeito matriz significativo
2 2
t1 Sb1 + t 2 Sb1
t' = 1
2
2
2
(Equação 7)
Sb1 + Sb1
1 2

Onde ***t1 = valor teórico de t para curva 1 e *** t2 = valor teórico de t para curva 2.

* teste F, bilateral, para 95% de confiança (P=0,05) e (n1-1) e (n2-1) graus de liberdade para o numerador e o denominador.
** teste t, bilateral, para 95% de confiança (P=0,05) e (n1 + n2 - 4).
***teste t, bilateral, para 95% de confiança (P=0,05) e (n1 – 2) e (n2 – 2) graus de liberdade para o numerador e o denominador.

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Com a finalidade de se avaliar corretamente a significân- Efeito da resposta cromatográfica acentuada e


cia entre as curvas, optou-se por realizar as duas indicações induzida pela matriz
citadas anteriormente.
Na Tabela 2 são apresentados os efeitos na matriz obser-
Resultados e Discussão vado, de acordo com a indicação de Thompson et al. (2002) na
comparação dos coeficientes angulares das duas curvas analíticas
A amostra de tomate orgânico apresentou-se adequada para e Zrostlíkova et al (2001) na variação de 20% entre as áreas me-
avaliação do efeito matriz, já que não continha os cinco agrotó- didas das mesmas curvas.
xicos estudados. O efeito da matriz, avaliado por ambos modelos propostos,

Método Multiresíduos para análise de resíduos de agrotóxicos em polpa de tomate

15g de polpa de tomate (adição de 1mL do “surrogate” clorpirifós metil)

Adicionar 30 mL de acetona, agitar por 30 s (ultra turraz)

Adicionar 60 mL de diclorometano:éter de petróleo (1:1, v:v), agitar por 30 s (ultra turraz) e centrifugar

Filtrar fase orgânica sob Na2SO4 anidro

Volume final recolhido ~ 80mL

Substâncias analisadas por CG/DCE – 1000 µL

Evaporar e dissolver em 1mL de isooctano

1µL no CG-DCE

Figura 1. Fluxograma do método multiresíduos adotado no estudo

Tabela 2. Resultado do efeito da resposta cromatográfica acentuada e induzida pela matriz

Agrotóxicos Variação ≥ 20% da resposta (áreas medidas) *estatística Conclusão obtidas pelas duas avaliações

Teste F; Fcal < Ftab


γ-HCH Curva solvente ≅ curva matriz efeito da matriz não é significativo.
Teste t; tcal < ttab
Teste F; Fcal < Ftab
Clorotalonil Curva solvente ≅ curva matriz efeito da matriz não é significativo.
Teste t; tcal < ttab
Teste F; Fcal > Ftab
Fenitrotiona Curva solvente < curva matriz efeito da matriz significativo.
Teste t; tcal > t’
Teste F; Fcal > Ftab
Clorpirifós Curva solvente < curva matriz efeito da matriz significativo.
Teste t; tcal > t’
Teste F; Fcal < Ftab
Procimidona Curva solvente ≅ curva matriz efeito da matriz não é significativo.
Teste t; tcal < ttab

* n1 e n2 = 14, número de observações medidas.

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foi observado apenas para a fenitrotiona e para o clorpirifós, Conclusões


fato este previamente conhecido já que este efeito é mais
acentuado em agrotóxicos da classe dos organofosforados. As estatísticas empregadas para verificação do efeito da ma-
Entretanto, vale salientar que a curva analítica elaborada na triz demonstraram que este efeito foi significativo apenas para
matriz tem a vantagem de incorporar uma correção de recu- os agrotóxicos da classe dos organofosforados, o clorpirifós e a
peração nos resultados obtidos e assim demonstrar um valor fenitrotiona. Nesse caso, a utilização da curva analítica construída
mais próximo do real. As curvas analíticas em solvente e na no extrato orgânico da polpa de tomate torna-se de grande valia
matriz para os cinco agrotóxicos são apresentadas grafica- para minimizar erros decorrentes de interferentes desta matriz
mente na Figura 2. Para o γ-HCH, clorotalonil e procimidona, sobre os resultados obtidos. Entretanto, para os demais agrotó-
não há diferença significativa e as curvas praticamente se so- xicos estudados este mesmo efeito não foi significativo. O ana-
brepõem. O mesmo não acontece para o clorpirifós e a fe- lista neste caso deve considerar a realização deste ensaio com o
nitrotiona que apresentam uma variação maior, com o efeito emprego de curvas analíticas de naturezas distintas ou assumir o
da matriz significativo. efeito da matriz para todos as substâncias avaliadas.

(IHLWRGDUHVSRVWDFURPDWRJUiILFDLQGX]LGDSHOD
PDWUL]WRPDWHSDUDR&ORUSLULIyV

\ [
 
5  

FXUYDHPVROYHQWH



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5  
FXUYDQDPDWUL]

         
FRQFHQWUDomRXJP/
 
(IHLWRGDUHVSRVWDFURPDWRJUiILFDLQGX]LGD (IHLWRGDUHVSRVWDFURPDWRJUiILFDLQGX]LGDSHODPDWUL]WRPDWHSDUDD
SHODPDWUL]WRPDWHSDUDD3URFLPLGRQD )HQLWURWLRQD
 
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Figura 2. Representação gráfica das curvas analíticas em solvente e na matriz para o
clorpirifós, γ-HCH, procimidona, fenitrotiona e clorotalonil

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