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PRÁCTICAS BIOQUÍMICA

Separación de glutamina y glutamato en una resina de


intercambio iónico

A506 / fracción
Elución agua Elución acético
Muestra O1 O2 A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6
Glu 0.024 0.013 0.021 0.016 0.017 0.016 0.019 0.016 0.017 0.583 1.912 0.312 0.070 0.026

Gln 0.034 0.164 0.940 0.987 0.297 0.086 0.040 0.023 0.022 0.019 0.033 0.016 0.017 0.020

Mez 0.032 0.194 0.435 0.459 0.109 0.033 0.036 0.024 0.026 0.086 1.042 0.216 0.050 0.031

2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 3 5 7 9 11 13 15

GLUTAMATO GLUTAMINA MEZCLA

Como podemos observar en la línea de la mezcla (línea amarilla) posee dos picos, uno a 0.459
y otro a 1.042.

El primero de ellos corresponde a la fracción A2 ya que la glutamina permanece menos tiempo


en la resina debido a que al variar el pH por acción del ácido acético posee una carga menos
positiva la cual hace que salga de la resina aniónica.

El segundo de ellos corresponde a la fracción B3, debido a que el glutamato permanece más
tiempo en la resina debido a que al adicionar el ácido acético, el pH disminuye y el aminoácido
posee una carga más positiva que el anterior, por lo que se queda retenido más tiempo en la
resina aniónica.
Observando la gráfica, podemos deducir que el primer pico corresponde a la glutamina y
el segundo al glutamato, ya que comparando con ambos aminoácidos aislados los picos
aparecen en la misma posición.

CUESTIONES

1) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si se hubiese utilizado aspartato en


lugar de glutamina?

A diferencia de la glutamina, el aspartato posee un punto isoeléctrico de 2.85, luego a


pH=7 estaría cargado negativamente y se pegaría a la resina sin problemas, al igual que
el glutamato. En cambio, al adicionar acético ambos saldrían de la resina a la vez al poseer
un punto isoeléctrico similar.

2) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si las muestras se hubiesen aplicado a
pH=1? ¿Y a pH=10?

A pH=1 ambos aminoácidos poseen carga positiva, luego al introducirse en la resina de


intercambio aniónico, la cual está cargada también positivamente, saldrían
inmediatamente de la resina debido a la repulsión de cargas.

A pH=10 ambos aminoácidos poseen carga negativa por lo que al introducirse en la resina,
quedan retenidos en la resina, al variar el pH con la adición de acético el glutamato posee
una carga más negativa quedándose retenido a la resina más fuertemente por lo que la
glutamina saldría antes.

3) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si se hubiese utilizado una columna de
intercambio catiónico?

Una columna de intercambio catiódico consiste en una columna cargada negativamente


por lo que atrae a moléculas de carga positiva. Como ambos aminoácidos a pH=7 presentan
carga negativa, no quedarán retenidos en la resina y saldrán inmediatamente de ella, sin
poder llegar a separarlos. Sin embargo, podemos apuntar que la glutamina presentará
carga neutra y el glutamato carga -1, por lo que ésta última debería de salir antes de la
resina.
Separación del citocromo C mediante filtración en gel.

FRACCIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A409 0.008 0.005 0.016 0.020 0.639 1.970 2.617 1.610 0.522 0.280
A700 0.003 0.006 0.005 0.004 0.016 0.019 0.049 0.045 0.065 0.100
11 12 13 14 15 16 17
A409 0.143 0.071 0.053 0.026 0.013 0.011 0.008
A700 0.147 0.184 0.200 0.111 0.071 0.030 0.014

A continuación, se representan los valores tabulados d la absorbancia a distintas


longitudes de onda (409 nm y 700nm) frente a las diferentes fracciones.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
0

A-409 A-700

Analizando ambas gráficas por separado, se obtienen las siguientes gráficas:


A-409
3

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Para una longitud de onda de 409 nm obtenemos los resultados obtenidos para el
Citocromo C, con un máximo de absorbancia en la fracción nº7, a 2,617.

Como era de esperar el Citocromo C ha salido más rápidamente de la columna ya que al


tener un gran peso molecular con respecto al intervalo de fraccionamiento que teníamos
(1000 a 5000) no entra en los poros del gel, pasando por el volumen externo y dejando la
columna más rápidamente que las moléculas más pequeñas.

A-700
0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Para una longitud de onda de 700 nm obtenemos los resultados obtenidos para el
CuSO4·5H2O, con un máximo de absorbancia en la fracción nº13, a 0,2.
Como era de esperar, el CuSO4·5H2O ha salido más tarde de la columna que el citocromo
C ya que al tener un peso molecular inferior al intervalo de fraccionamiento que teníamos
(1000 a 5000) entra en los poros del gel, retrasando su salida al pasar por los poros del
gel (volumen interno), retrasándose en su salida.

a) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados en una columna de Sephadex


G-100 (intervalo de fraccionamiento 4000-150000)?

Se habrían obtenido los mismos resultados para el CuSO4 · 5 H2O (PM=250), ya que
entrarían por los poros del gel como ha pasado en el Sefadex G-25.

Sin embargo, no se habrían obtenidos los mismos resultados para el Citocromo C


(PM=13000) ya que para el Sefadex G-25 no han pasado por los poros, saliendo más
rápidamente del gel que el sulfato de cobre, mientras que el Sefadex G-100 si permitiría
al Citocromo C entrar en los poros, retrasándose las salidas de ambos del gel con menos
separación que anteriormente.

b) ¿En qué buffer o medio habrá eluído el citocromo c? ¿Está a la misma


concentración que se aplicó?

El Citocromo C se ha eluído en medio acuoso, en las sucesivas adiciones de agua.

No, la concentración habrá disminuido al eluirse con el agua.

c) ¿Podría utilizarse este tipo de columnas para dializar extractos, es decir,


separar las sales y otras moléculas de pequeño tamaño de las proteínas y
componentes de alto peso molecular? ¿Qué rango de volumen de elución habría
que tomar?

Sí, como hemos comprobado en la separación del sulfato de cobre (de pequeño tamaño) y
el Citocromo C (de alto peso molecular), se separa fácilmente con esta columna.

Habría que tomar un rango en el cual se eluyera el compuesto de una columna. En el caso
estudiado, para una columna donde separar moléculas con gran peso molecular, estas se
recogerán en un rango de volumen entre 1500 y 2000 μL (utilizando una fracción de 250
μL) y entre 3000 y 3500 μL para moléculas de pequeño tamaño.

d) ¿Cuál será el Vo y Vt de la columna?

El V0 corresponde al volumen de elución obtenido para el Citocromo C. Para éste, se


obtiene el máximo en la fracción 7:

V0= 250 μL · 7 = 1750 μL


El Vt es igual a la suma del VL mas el volumen del gel seco, despreciando el volumen del
gel seco, se puede considerar que el V T=VL, siendo VL el volumen de elución del
CuSO4·5H2O.

Para el CuSO4·5H2O, se obtiene el máximo en la fracción 13:

Vt = 250 μL × 13 = 3250 μL

Espectrocopía UV-VIS del Citocromo C.


El citocromo c es una proteína monomérica, es decir con un solo polipéptido; unido a
esta estructura hay un grupo prostético constituido por un hemo C, es decir, una
protoporfirina IX con un ion de hierro coordinado. Debido a este grupo hemo estas
proteínas tienen una intensa capacidad de absorción de luz visible característica.
El citocromo C funciona como transportador electrónico mitocondrial entre los
complejos respiratorios III y IV.

Los espectros de absorción de las metaloporfirinas se caracterizan por la presencia


de tres bandas, α, β y γ que aparecen de mayores a menores longitudes de onda
respectivamente. La banda γ es con frecuencia denominada banda de Soret.
Representa el estado de energía más alto de la proteína.
En la mitocondria se pueden encontrar tres grupos de citocromos, a, b y c, según las
bandas características de absorción de luz que presenta cada uno en el
espectrofotómetro. Cada tipo de citocromo en su estado reducido, o sea con Fe2+,
tiene tres bandas de absorción en el espectro visible.
En el espectro de absorción, el pico que corresponde a la longitud de onda más larga
está en un valor de aproximadamente 600 nm en los citocromos tipo a, 560 en lo tipo
b, y cerca de los 550 en los tipos c.

Se han obtenido los resultados de la proteína reducida y oxidada:

El espectro de absorción
observado en la imagen se trata
de la forma oxidada.

El pico más alto de absorción se


trata del soret (estado de
energía más alto).

Se encuentra a una longitud de


onda de 408 nm y con una
absorción de 1,741.
El espectro de absorción
observado en la imagen se trata
de la forma reducida.

Podemos observar la señal a 550


nm el citocromo C con una
absorbancia de 0,373.

Sería correcto ya que como se ha


hablado es la banda
característica a la que aparece.

Formación de producto con el tiempo de reacción y con la


cantidad de enzima

Para la aparición de producto variando el tiempo, se obtuvieron los siguientes


resultados:

Reactivo Blanco 1 2 3 4
NPP 1.5 mM 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
(mL)
Fosfatasa 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Alcalina (mL)
Incubación a 0 5 10 15 20
30 ºC (min)
K2HPO4 1 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
A410 (nm) 0 0.400 0.792 1.190 1.519

Al representar los valores de absorbancia obtenidos frente al tiempo de


incubación, se podrá calcular la actividad enzimática, por tanto:
1.8
y = 0.0766x + 0.0146
1.6
1.4
Absorbancia (nm)

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)

Por tanto:
∆𝐴 𝑉′ 3.6
Actividad (U) = x = 0.0766 x = 0.017235 U
∆𝑡 16 16
Actividad (U) 0.017235 U
Actividad (U/mL) = = = 0.17235 U/mL
V (mL) 0.1 mL

Para ver el efecto de la concentración de enzima sobre la velocidad de reacción


(aparición de producto en función de la cantidad de enzima), se obtuvieron los
siguientes resultados:

Reactivo Blanco 1 2 3 4
NPP 1.5 mM 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
(mL)
Tampón de 0.4 0.3 0.2 0.1 0
trabajo (mL)
Fosfatasa 0 0.1 0.2 0.3 0.4
alcalina (mL)
Incubar 5 min
a 30 ºC
K2HPO4 1 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
A410 (nm) 0 0.513 0.970 1.325 1.640

A continuación, representar la actividad enzimática en U frente a la cantidad de


preparación enzimática usada en cada tubo en mL.

Previamente se debe calcular la actividad de cada una de ellas, usando la siguiente


fórmula:
𝐀𝐛𝐬 𝟒𝟏𝟎 𝟏
Actividad (U)= x V’ x
𝟏𝟔 𝐭
En la siguiente gráfica se recogen los datos a representar:

Blanco 1 2 3 4
Actividad (U) 0.0 0.002500875 0.0472875 0.06459375 0.07995

0.09
0.08
0.07
0.06
Actividad (U)

0.05
0.04
0.03
0.02
y = 0.1995x + 0.0035
0.01
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
Enzima (mL)

En este caso, se observa que la pendiente de dicha gráfica coincide con la


actividad enzimática en U/mL.
∆𝐴
Actividad (U/mL) = = 0.1995 U/mL
∆𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎

Determinación de la concentración de proteína


Para poder conocer la cantidad de proteína que posee la muestra a estudiar, se
realizará una recta de calibrado con determinados patrones y se extrapolará el
dato de interés.

Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Muestra


Agua destilada (mL) 0.8 0.78 0.75 0.72 0.7 0.7
BSA 0.1 µg/µl (µL) 0 25 50 75 100 0
Preparación 0 0 0 0 0 100
Enzimática (µL)
Reactivo de 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Bradford (mL)
A595 (nm) 0 0.223 0.400 0.587 0.745 0.231
A continuación, representar la absorbancia de cada patrón (incluyendo el blanco)
frente a los µg de proteína de cada tubo ( 0, 2’5, 5, 7’5 y 10 respectivamente).

0.8

0.7

0.6

0.5
A 595 (nm)

0.4

0.3

0.2
y = 0.0742x + 0.0202
0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Proteina (µg)

Para poder conocer la cantidad de proteína presente en la muestra, se usará la


anterior ecuación de la recta: y= 0.0742x + 0.0202

Conociendo que y= 0.231, tenemos que x= 2.84 µg de proteína en la muestra.

Por tanto, su concentración es:


µ𝐠 𝐝𝐞 𝐩𝐫𝐨𝐭𝐞í𝐧𝐚 𝟐.𝟖𝟒µ𝐠
C (µg/mL) = 𝒎𝑳 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 = = 28.4 µg/𝑚𝐿
𝟎.𝟏 𝒎𝑳

Por último, el coeficiente de extinción (E) para el reactivo de Bradford coincide


con la recta anteriormente propuesta, luego E= 0.0742.

Cálculo de la Km para el nitrofenolfostato y de la Ki para


el fosfato.
SIN INHIBIDOR.

Reactivo B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6
A410 nm 0 0,915 0 0,671 0 0,367 0 0,204 0 0,132 0 0,11

Para calcular la velocidad de la reacción enzimática, se utiliza la siguiente fórmula:


𝐴 1
𝑉 = 16 · 𝑉 ′ · 𝑇; dónde V’ es 3,6 mL y T es 15 min. Los resultados se tabulan en la
siguiente tabla junto a las concentraciones de sustrato y sus inversos:

V(µmoles/min) [Sustrato](µM) 1/V 1/[sustrato]


0,013725 129 72,8597 0,0077519
0,010065 96 99,3542 0,010417
0,005805 64 172,2653 0,015625
0,00386 32 326,7974 0,03125
0,00198 20 505,0505 0,05
0,00165 12 606,0606 0,08333

Pordemos observar en la representación directa de la velocidad frente a la concentración


de sustrato que se trata de una representación logaritmica:

0.014

0.012

0.01
Velocidad

0.008

0.006

0.004

0.002

0
0 20 40 60 80 100 120 140
[Sustrato]

Cuando representamos los inversos de la velocidad frente a la concentración de sustratos


obtenemos una representación lineal donde el corte con el eje x es el inverso de la V max
y el corte con el eje y es la inversa de la Km
y = 7329.1x + 54.744

700

600

500
1/Velocidad

400

300

200

100

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
1/[Sustrato]

Por tanto, desde la ecuación de la recta podemos obtener Vmax y Km:


1
Para x=0, y=𝑉𝑚𝑎𝑥

Y=7329,1 · 0+54,744  y=54,744


1
y= = 54,744  Vmax=0,01827 U/mL =18,27 mU/mL
𝑉𝑚𝑎𝑥
1
Para Y=0, x=𝐾𝑚

0=7329,1 · X+54,744  X=7,4694·10-3


1
X=𝐾𝑚= 7,4694·10-3  Km=134 µM

CON INHIBIDOR

B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6
Reactivo
A410 nm 0 0,432 0 0,300 0 0,180 0 0,109 0 0,082 0 0,005

Se calcula la velocidad como en el caso anterior, obteniendose los siguientes resultados:

V(µmoles/min) [Sustrato](µM) 1/V 1/[sustrato]


0,00648 129 154,3209 0,0077519
0,0045 96 222,222 0,010417
0,0027 64 370,37037 0,015625
0,001635 32 611,62088 0,03125
0,001234 20 810,10101 0,05
0,000764 12 1309,40171 0,08333

y = 14747x + 92.106
1400

1200

1000
1/Velocidad

800

600

400

200

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
1/[Concentración]

Como en el caso anterior, obtenemos Km’ y Vmax’:


1
Para x=0, y=𝑉𝑚𝑎𝑥′

Y=14747 · 0+92,106  y=92,106


1
y= = 92,106  Vmax’=0,01086 U/mL =10,86 mU/mL
𝑉𝑚𝑎𝑥′
1
Para Y=0, x=𝐾𝑚′

0=14747 · X+92,106 X=6,246·10-3


1
X=𝐾𝑚= 7,4694·10-3  Km=158 µM

1400
y = 14747x + 92.106
1200

1000

800
1/Velocidad

y = 7329.1x + 54.744
600

400

200

0
-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
-200
1/[Concentración]
En las gráficas se puede observar como se trata de una inhibición no competitiva
en la cual se disminuye la velocidad máxima a medida que aumenta la concentración
de inhibidor, es decir la gráfica roja (sin inhibidor) tiene un V max mayor que la
gráfica azul (con inhibidor).

 Para calcular Ki, tenemos que despejarla de la ecuación:


𝑉𝑚𝑎𝑥 18,27
Vmax’ = [𝐼] 10,86 = 160
1+ 1+
𝐾𝑖 𝐾𝑖

Ki=234,5µM

 Para calcular el porcentaje de inhibición para una concentración de


sustrato 32 µM, con la concentración de fosfato utilizada:
𝑽−𝑽′
%In= ·100
𝑽
𝟎,𝟎𝟎𝟑𝟖𝟔−𝟎,𝟎𝟎𝟏𝟔𝟑𝟓
%In= · 100
𝟎,𝟎𝟎𝟑𝟖𝟔

%In=57,6%

TEMPERATURA ÓPTIMA Y ESTABILIDAD TÉRMICA DE


LA ENZIMA: CÁLCULO DE LA ENERGÍA DE
ACTIVACIÓN (Ea) Y DEL TIEMPO DE VIDA MEDIO
(t1/2).

B1 1 B2 2 B3 3 B4 4
Reactivo
A410 nm 0 0,687 0 0,851 0 1,111 0 1,162
10 min a 20 20 30 30 40 40 50 50
estos ºC
Reactivo B5 5 B6 6 B7 7
A410 nm 0 0,922 0 0,415 0 0,156
10 min a 60 60 70 70 80 80
estos ºC

Se calcula la actividad de la enzima y se representa frente a la temperatura, y


sus inversos:

1 2 3 4 5 6 7
actividad 0.0155 0.0191 0.0250 0.0261 0.0207 0.0093 0.0035
temperatura 20 30 40 50 60 70 80
Ln actividad -4.167 -3.958 -3,689 -3,646 -3.878 -4,678 -5,655
1/temperatura 0.05 0.033 0.025 0.02 0.0167 0.014 0,0125

0.03

0.025
actividad encima (U)

0.02

0.015

0.01

0.005

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatura (ºC)

Se puede observar gráficamente que la temperatura óptima de la enzima es 50ºC.

Al representar el logaritmo de la actividad frente a la temperatura, se han


eliminado los últimos 3 datos obtenidos por ser poco imprecisos por tener poca
actuación de la enzima.
y = -18.125x - 3.285
-3.5
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
-3.6

-3.7

-3.8
Ln actividad

-3.9

-4

-4.1

-4.2

-4.3
1/Temperatura (K-1)

 Para calcular la energía de activación, se parte de la ecuación de Arrhenius:


𝑉𝑚𝑎𝑥
K=Ae-Ea/RT, y teniendo en cuenta que Kcat= [𝐸𝑇]

𝑬𝒂 𝟏
Ac(u)= Ae-Ea/RTLn Ac(u)=lnA = ·𝑻
𝑹

Como se ha representado el logaritmo de la actividad frente al inverso de la


𝑬𝒂
temperatura tenemos que la pendiente es igual a .
𝑹

Por tanto, despejando obtenemos la energía de activación:


𝑬𝒂
-18,125=  Ea=-18,125k · 8,314 J/k·mol
𝑹

Ea=150,69 J/mol