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A506 / fracción
Elución agua Elución acético
Muestra O1 O2 A1 A2 A3 A4 A5 A6 B1 B2 B3 B4 B5 B6
Glu 0.024 0.013 0.021 0.016 0.017 0.016 0.019 0.016 0.017 0.583 1.912 0.312 0.070 0.026
Gln 0.034 0.164 0.940 0.987 0.297 0.086 0.040 0.023 0.022 0.019 0.033 0.016 0.017 0.020
Mez 0.032 0.194 0.435 0.459 0.109 0.033 0.036 0.024 0.026 0.086 1.042 0.216 0.050 0.031
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 3 5 7 9 11 13 15
Como podemos observar en la línea de la mezcla (línea amarilla) posee dos picos, uno a 0.459
y otro a 1.042.
El segundo de ellos corresponde a la fracción B3, debido a que el glutamato permanece más
tiempo en la resina debido a que al adicionar el ácido acético, el pH disminuye y el aminoácido
posee una carga más positiva que el anterior, por lo que se queda retenido más tiempo en la
resina aniónica.
Observando la gráfica, podemos deducir que el primer pico corresponde a la glutamina y
el segundo al glutamato, ya que comparando con ambos aminoácidos aislados los picos
aparecen en la misma posición.
CUESTIONES
2) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si las muestras se hubiesen aplicado a
pH=1? ¿Y a pH=10?
A pH=10 ambos aminoácidos poseen carga negativa por lo que al introducirse en la resina,
quedan retenidos en la resina, al variar el pH con la adición de acético el glutamato posee
una carga más negativa quedándose retenido a la resina más fuertemente por lo que la
glutamina saldría antes.
3) ¿Se habrían obtenido los mismos resultados si se hubiese utilizado una columna de
intercambio catiónico?
FRACCIÓN
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A409 0.008 0.005 0.016 0.020 0.639 1.970 2.617 1.610 0.522 0.280
A700 0.003 0.006 0.005 0.004 0.016 0.019 0.049 0.045 0.065 0.100
11 12 13 14 15 16 17
A409 0.143 0.071 0.053 0.026 0.013 0.011 0.008
A700 0.147 0.184 0.200 0.111 0.071 0.030 0.014
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
0
A-409 A-700
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Para una longitud de onda de 409 nm obtenemos los resultados obtenidos para el
Citocromo C, con un máximo de absorbancia en la fracción nº7, a 2,617.
A-700
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Para una longitud de onda de 700 nm obtenemos los resultados obtenidos para el
CuSO4·5H2O, con un máximo de absorbancia en la fracción nº13, a 0,2.
Como era de esperar, el CuSO4·5H2O ha salido más tarde de la columna que el citocromo
C ya que al tener un peso molecular inferior al intervalo de fraccionamiento que teníamos
(1000 a 5000) entra en los poros del gel, retrasando su salida al pasar por los poros del
gel (volumen interno), retrasándose en su salida.
Se habrían obtenido los mismos resultados para el CuSO4 · 5 H2O (PM=250), ya que
entrarían por los poros del gel como ha pasado en el Sefadex G-25.
Sí, como hemos comprobado en la separación del sulfato de cobre (de pequeño tamaño) y
el Citocromo C (de alto peso molecular), se separa fácilmente con esta columna.
Habría que tomar un rango en el cual se eluyera el compuesto de una columna. En el caso
estudiado, para una columna donde separar moléculas con gran peso molecular, estas se
recogerán en un rango de volumen entre 1500 y 2000 μL (utilizando una fracción de 250
μL) y entre 3000 y 3500 μL para moléculas de pequeño tamaño.
Vt = 250 μL × 13 = 3250 μL
El espectro de absorción
observado en la imagen se trata
de la forma oxidada.
Reactivo Blanco 1 2 3 4
NPP 1.5 mM 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
(mL)
Fosfatasa 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Alcalina (mL)
Incubación a 0 5 10 15 20
30 ºC (min)
K2HPO4 1 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
A410 (nm) 0 0.400 0.792 1.190 1.519
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
Por tanto:
∆𝐴 𝑉′ 3.6
Actividad (U) = x = 0.0766 x = 0.017235 U
∆𝑡 16 16
Actividad (U) 0.017235 U
Actividad (U/mL) = = = 0.17235 U/mL
V (mL) 0.1 mL
Reactivo Blanco 1 2 3 4
NPP 1.5 mM 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
(mL)
Tampón de 0.4 0.3 0.2 0.1 0
trabajo (mL)
Fosfatasa 0 0.1 0.2 0.3 0.4
alcalina (mL)
Incubar 5 min
a 30 ºC
K2HPO4 1 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
A410 (nm) 0 0.513 0.970 1.325 1.640
Blanco 1 2 3 4
Actividad (U) 0.0 0.002500875 0.0472875 0.06459375 0.07995
0.09
0.08
0.07
0.06
Actividad (U)
0.05
0.04
0.03
0.02
y = 0.1995x + 0.0035
0.01
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
Enzima (mL)
0.8
0.7
0.6
0.5
A 595 (nm)
0.4
0.3
0.2
y = 0.0742x + 0.0202
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
Proteina (µg)
Reactivo B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6
A410 nm 0 0,915 0 0,671 0 0,367 0 0,204 0 0,132 0 0,11
0.014
0.012
0.01
Velocidad
0.008
0.006
0.004
0.002
0
0 20 40 60 80 100 120 140
[Sustrato]
700
600
500
1/Velocidad
400
300
200
100
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
1/[Sustrato]
CON INHIBIDOR
B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5 B6 6
Reactivo
A410 nm 0 0,432 0 0,300 0 0,180 0 0,109 0 0,082 0 0,005
y = 14747x + 92.106
1400
1200
1000
1/Velocidad
800
600
400
200
0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
1/[Concentración]
1400
y = 14747x + 92.106
1200
1000
800
1/Velocidad
y = 7329.1x + 54.744
600
400
200
0
-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
-200
1/[Concentración]
En las gráficas se puede observar como se trata de una inhibición no competitiva
en la cual se disminuye la velocidad máxima a medida que aumenta la concentración
de inhibidor, es decir la gráfica roja (sin inhibidor) tiene un V max mayor que la
gráfica azul (con inhibidor).
Ki=234,5µM
%In=57,6%
B1 1 B2 2 B3 3 B4 4
Reactivo
A410 nm 0 0,687 0 0,851 0 1,111 0 1,162
10 min a 20 20 30 30 40 40 50 50
estos ºC
Reactivo B5 5 B6 6 B7 7
A410 nm 0 0,922 0 0,415 0 0,156
10 min a 60 60 70 70 80 80
estos ºC
1 2 3 4 5 6 7
actividad 0.0155 0.0191 0.0250 0.0261 0.0207 0.0093 0.0035
temperatura 20 30 40 50 60 70 80
Ln actividad -4.167 -3.958 -3,689 -3,646 -3.878 -4,678 -5,655
1/temperatura 0.05 0.033 0.025 0.02 0.0167 0.014 0,0125
0.03
0.025
actividad encima (U)
0.02
0.015
0.01
0.005
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatura (ºC)
-3.7
-3.8
Ln actividad
-3.9
-4
-4.1
-4.2
-4.3
1/Temperatura (K-1)
𝑬𝒂 𝟏
Ac(u)= Ae-Ea/RTLn Ac(u)=lnA = ·𝑻
𝑹
Ea=150,69 J/mol