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INTERACCIÓN DEL

SUPLEMENTO SELECTIVO
E.COLI/COLIFORMES CON
FILTROS DE MEMBRANA

Edurne Gorostiaga

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E.COLI Y COLIFORMES
• La presencia y el nivel de contaminación fecal constituyen un factor
importante en la evaluación de la calidad de una masa de agua y
del riesgo de infección que representa para la salud humana.

• El análisis de muestras de agua para detectar la presencia de


Escherichia coli, que normalmente habita en el tracto intestinal de
hombres y otros animales de sangre caliente, proporciona una
indicación de este tipo de contaminación.

• Los resultados del análisis de bacterias coliformes son más difíciles


de interpretar ya que algunas bacterias coliformes viven en el suelo
y en las aguas dulces superficiales y por lo tanto no tienen siempre
origen intestinal.

• La presencia de bacterias coliformes, aunque no pruebe de forma


concluyente una contaminación de origen fecal, si puede indicar
fallos en el tratamiento o en la distribución del agua.

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E.COLI Y COLIFORMES
• Bacteria coliforme:
– Miembro de la familia Enterobacteriaceae
que expresa el enzima B-D-galactosidasa.

• Escherichia coli:
– Miembro de la familia Enterobacteriaceae
que expresa los enzimas B-D-galactosidasa
y B-D-glucuronidasa.

• anexo A de la ISO 9308, las bacterias coliformes son bacterias Gram


negativas, no formadoras de esporas, oxidasa negativas y con forma de
bastoncillo, que pueden crecer en medio aerobio y anaerobio facultativo
en presencia de sales biliares y que, normalmente, son capaces de
fermentar lactosa con producción de ácido y aldehído en 48 h cuando se
incuban a una temperatura de (36± 2)ºC. Las bacterias E.coli son
bacterias coliformes capaces de producir indol a partir de triptófano, en
(21±3)h a (44±0.5)ºC.

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E.COLI Y COLIFORMES

1)fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas


2)fermentación ácida de la lactosa
3)enzima B-Galactosidasa 4
CHROMOCULT
• El Chromocult es un medio de
cultivo selectivo para la
detección y recuento de
coliformes y de E.coli. Contiene
una combinación de dos
sustratos cromogénicos de
manera que se hace posible la coliforme
detección simultánea de los dos
tipos de bacterias coliformes.

• La enzima característica de los


coliformes, ß-D-Galactosidasa No coliforme
se fija en el sustrato Salmon-
E.coli
GAL y es la causa del color rojo
de los coliformes.

• La enzima característica de los


E.coli, ß-D-Glucuronidasa se
fija en el sustrato X-
Glucuronida y es la
responsable de que las colonias
positivas E.coli presenten un
azul oscuro o violeta.

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Suplemento E.coli/coliformes
• El suplemento E.coli/coliformes es una mezcla de dos inhibidores;
la vancomicina inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas,
mientras que la cefsulodina suprime Pseudomonas spp. y
Aeromonas spp.

• La composición por frasco es de 2.5mg de vancomicina y 2.5mg de


cefsulodina. El liofilizado se resuspende con 2ml de agua destilada
y se agrega a 500ml de medio cultivo estéril (chromocult).

• La cefsulodina es un antibiótico perteneciente al grupo de las


cefalosporinas de tercera generación.

• La vancomicina es un antibiótico perteneciente al grupo de los


glucopéptidos. Posee un espectro restringido fundamentalmente a
bacterias grampositivas. Prácticamente todos los bacilos
gramnegativos y micobacterias son resistentes a vancomicina, así
como ciertos grampositivos.
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FILTRACIÓN MEMBRANA
• Filtrar 100ml de agua
a través de una
membrana de 0.45µm
de poro.
• Tras la filtración se
coloca el filtro en la
placa de medio de
cultivo Chromocult y
se incuba durante 18-
24 horas a 37±1ºC.
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SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes volúmenes de


suplemento. Sobre estos medios ensayamos la recuperación de E.coli
NCTC 9001(vr=53ufc) mediante filtración por membrana.

Ch sin Ch +.3 ml Ch + 2ml Ch + 1ml Ch + 0. 5ml


supl. supl. supl. supl. supl.
5mg/L

ufc 50 9 9 27 37

ufc 51 8 13 18 39

Media 50.5 8.5 11 22.5 38

Recuperación 95% 16% 21% 42% 72%

En el certificado del producto (suplemento E.coli-coliformes) se


especifica que por cada 500ml de medio de cultivo se añade 2ml de
suplemento. A esta concentración de suplemento observamos que la
recuperación obtenida es del 21%. 8
CEFSULODINA
• Decidimos probar la eficacia de estos dos antibióticos por separado
para ver la recuperación de E.coli ya que nos interesa disponer de un
medio de cultivo en el que la mayor parte de flora acompañante sea
inhibida.

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de


cefsulodina. Esta se hidrata de igual manera que el suplemento
E.coli/coliformes. Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli
NCTC 9001.

Ch sin antib. Ch + 3 ml ant. Ch +2ml ant. Ch +1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.

ufc 67 67 69 76 63

ufc 70 67 67 69 67

Media 68.5 67 68 72.5 65

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CEFSULODINA

• De acuerdo con estos resultados se observa que la cefsulodina no afecta a


la recuperación de E.coli

• Se prueba el medio chromocult con cefsulodina en muestras naturales.

– En muestras tratadas, la mayor parte de flora acompañante es inhibida,


creciendo únicamente algunas colonias color crema.

– Las colonias presuntas E.coli y coliformes crecen igualmente en ambos


medios (chromocult con y sin cefsulodina).

– Al utilizar este antibiótico en captaciones (aguas brutas) la mayor parte


de flora acompañante no es inhibida. Crecen muchas colonias cremas y
rosas de todo tipo, lo cual dificulta la posterior confirmación de los
posibles E.coli y coliformes.

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VANCOMICINA

• Preparamos chromocult al que añadimos diferentes cantidades de


vancomicina. Esta se hidrata de igual manera que el suplemento
E.coli/coliformes.

• Sobre estos medios se ensaya la recuperación de E.coli NCTC 9001,


E.coli ATCC 8739 y K.oxytoca ATCC 49131.

E.coli NCTC 9001 Ch sin antib. Ch +2ml ant. Ch + 1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.
ufc 71 27 18 37
ufc 70 10 26 35
Media 70.5 18.5 22 36
Recuperación 26% 31% 51%

E.coli ATCC 8739 TSA Ch sin antib. Ch +2ml Ch + 1ml Ch + 0. 5ml


ant. ant. ant.
ufc 50 57 13 11 28

ufc 68 56 10 24 46
Media 59 56.5 11.5 17..5 37
Recuperación 95.8% 19.5% 29.7% 62.7%

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VANCOMICINA

K.oxytoca ATCC TSA Ch +2ml ant. Ch + 1ml ant. Ch + 0. 5ml ant.


49131

ufc 36 29 29 36
ufc 33 45 25 28
Media 34.5 34.5 27 32
Recuperación 100% 78% 93%

Según añadimos mayor volumen de vancomicina la recuperación de


E.coli va disminuyendo. Aún añadiendo tan sólo 0. 5ml de antibiótico
obtenemos una recuperación baja.

No podemos utilizar este antibiótico en ninguna concentración para la


recuperación de E.coli.

La recuperación de K.oxytoca es en todos los casos superior al 70%.

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MR: E.coli NCTC9001; valor referencia: 53ufc

Chromocult sin Chromocult +2ml antib. Chromocult +1ml antib. Chromocult +0,5ml antib.
antibiótico 5mg/L 2,5mg/L 1,25mg/L
cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplemento cefsulodina vancomicina suplemento
ufc contadas en 67 70 69 27 9 76 18 27 63 37 37
placa 71 70 67 10 13 69 26 18 67 35 39
50 51
Media 63,2 68 18,5 11 72,5 22 22,5 65 36 38
Recuperación % 119,2 128,3 34,9 20,8 136,8 41,5 42,5 122,6 67,9 71,7
Recuperación
respecto al Ch.sin
antibiótico 107,6 29,3 17,4 114,7 34,8 35,6 102,8 57,0 60,1

E.coli ATCC8739; TSA: 45 y 55 valor referencia: 50ufc

Chromocult sin Chromocult +2ml antib. Chromocult +1ml antib. Chromocult +0,5ml antib.
antibiótico 5mg/L 2,5mg/L 1,25mg/L
vancomicina vancomicina vancomicina
ufc contadas en 46 1 1 31
placa 54 0 4 19
Media 50,0 0,5 2,5 25
Recuperación % 100,0 1,0 5,0 50,0

K.oxytoca ATCC49131; TSA: 56 y 54 valor referencia: 55ufc

Chromocult con Chromocult +2ml antib. Chromocult +1ml antib. Chromocult +0,5ml antib.
antibiótico 5mg/L 2,5mg/L 1,25mg/L
vancomicina vancomicina vancomicina
ufc contadas en 33 40 56 51
placa 46 42 51 46
Media 39,5 41 53,5 48,5
Recuperación % 71,8 74,5 97,3 88,2

Edurne G. 17/04/08
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SUPLEMENTO E.COLI/COLIFORMES

• PRIMERAS CONCLUSIONES:
• La vancomicina inhibe a E.coli en la misma
proporción que el suplemento E.coli/coliformes.
Por tanto, la ineficacia del suplemento
selectivo se debe a la vancomicina.

• La recuperación de K.oxytoca es en todos los


casos superior al 70% y su crecimiento no se ve
afectado por ninguno de estos antibióticos.

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FILTROS

• Decidimos probar la recuperación de E.coli


ATCC 8739 y E.coli NCTC 9001 en Chromocult
con y sin suplemento selectivo E.coli/coliformes
por diferentes técnicas:

– en masa
– filtración por membrana:
–Millipore EZHAWG474
–Whatman 10407112
–Schleicher & Schuell ME25/21
–PALL GN-6

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E.coli ATCC 8739

MASA MILLIPORE WHATMAN

SIN CON SIN CON SIN CON


TSA suplemento suplemento suplemento suplemento suplemento suplemento

ufc en 58 57 39 33 16 43 0
placa 55 60 51 41 27 37 2
Media 56,5 58,5 45 37 21,5 40 1
Recuperación 103,5 79,6 65,5 38,1 70,8 1,8

MR: E.coli NCTC 9001; 53ufc

chromocult con suplemento


whatman nitrato S and S ester chromocult sin
celulosa celulosa suplemento
11 12 53
21% 23% 100% 16
FILTROS PALL
E.coli ATCC8739

MASA FILTRACIÓN FILTRACIÓN NMP

Chromocult con suplemento Chromocult sin suplemento COLILERT


TSA Pall GN-6 whatman
87 8 64 74
UFC 78 8 73 83
Media 82,5 8 68,5 78,5
Recuperación 100% 9,7 83,0 95,2

K.oxytoca ATCC49131

MASA FILTRACIÓN FILTRACIÓN NMP

Chromocult con suplemento Chromocult con suplemento COLILERT


TSA Pall GN-6 whatman
UFC 24 37 23 41
33 34 22 38
Media 28,5 35,5 22,5 39,5
Recuperación 100% 124,6 78,9 138,6

E.coli NCTC 13216

FILTRACIÓN

Chromocult con suplemento


VR Pall GN-6
UFC 95 37
28
37
25
Media 31,8 17
Recuperación 100% 33,4
FILTROS
• Observamos que la recuperación de E.coli en masa es buena
(mayor del 70%), y que el suplemento selectivo no inhibe el
crecimiento de esta cepa.

• Cuando utilizamos la técnica de filtración, observamos que la


recuperación de E.coli en Chromocult con suplemento selectivo se
ve afectada;
– Con filtros Millipore la recuperación es de 38.1% ,
– con filtros Whatman de 1.8% (21% dependiendo de la cepa),
– con filtros Pall de 9.7% (34% dependiendo de la cepa).

• La recuperación de E.coli en Chromocult sin suplemento, con todos


los filtros ensayados, es buena.

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EJERCICIO IELAB ABRIL 2012
Filtros Whatman

45
40
35 media laboratorio
30 NMP
25 media laboratorio
Ch.sin suplemento
20
media laboratorio Ch.
15 con supl.
10 VALOR CONSENSO

5
0
E.coli

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E.Coli NCTC 13216
Chromocult con suplemento
Matriz:agua tratada

a b c media

Millipore 60 40 67 58
EZHAWG474

Pall GN-6 29 35 34 33

Whatman 21 26 18 22
80 Microplus

70 Colilert 88 74 74 79

60
50 Millipore
40 Pall
Whatman
30
Colilert
20
10
0
ufc
20
CONCLUSIONES
• Tras todos los ensayos realizados podemos afirmar que la
vancomicina interacciona con algún componente de los filtros
de membrana y hace que se inhiba el crecimiento de E.coli.
Todos los filtros ensayados muestran una mala recuperación
de E.coli. (incluso los recomendados por el fabricante del
suplemento E.coli/coliformes).

• El crecimiento de K.oxytoca no se ve en ningun caso afectado.

• El fabricante del suplemento, tras ponernos en contacto, no da


solución al problema.

• No podemos utilizar la técnica de filtración para el recuento de


E.coli en nuestro laboratorio ya que disponemos de muestras
en la que nos es necesario la utilización de un suplemento que
nos inhiba la flora acompañante.

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