Você está na página 1de 7

Analisis Kromatografi Lapis Tipis Antibiotik Beta-Laktam

Tujuan: Makalah ini menjelaskan beberapa prosedur kromatografi lapis tipis yang memungkinkan
pemisahan dan identifikasi penisilin dan sefalosporin sederhana dan cepat dari campuran kompleks.
Metode: Menggunakan silicagel GF254 sebagai fase diam dan memilih fase gerak yang berbeda, kita
berhasil dalam pemisahan beta-lactamins yang dipelajari. Tujuan kami bukan hanya untuk
mengembangkan metode sederhana, cepat dan efisien untuk pemisahan mereka, tetapi juga
optimalisasi kondisi analitis. Hasil: Tidak ada sistem yang akan memisahkan semua beta-laktam,
namun dapat diidentifikasi saat informasi pelengkap digunakan dari reaksi warna dan / atau dengan
menggunakan sistem kromatografi tambahan. Kesimpulan: Kombinasi yang tepat antara sistem
pelarut dan metode deteksi memungkinkan identifikasi penisilin dan sefalosporin yang diteliti dan
dapat berhasil digunakan dalam analisis awal antibiotik beta-laktam. pengantar
Di antara semua antibiotik, kelompok beta-laktam menempati urutan pertama mengenai jumlah
senyawa di pasaran dan juga dalam hal penggunaannya dalam pengobatan penyakit menular. Beta-
lactams yang paling sering digunakan adalah kelompok penisilin dan sefalosporin
Metode analisis yang paling populer untuk penentuan beta-laktam adalah kromatografi, termasuk
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dan kromatografi lapis tipis (KLT). HPLC menawarkan
sensitivitas dan efisiensi pemisahan yang tinggi, menjadikan dirinya sebagai metode pilihan pertama
untuk analisis beta-lactam; Namun itu mahal dan membutuhkan peralatan canggih. TLC adalah
prosedur kromatografi yang lebih murah dan tidak rumit, yang dapat berhasil digunakan, dalam
penyaringan awal zat farmasi. Dalam analisis modern, KLT biasanya digunakan sebagai metode
pemisahan, yang menetapkan adanya atau tidak adanya antibiotik beta-laktam di atas tingkat
konsentrasi yang ditetapkan.2,3
KLT digunakan dalam edisi ke-7 dari European Pharmacopoeia (Ph.Eur 7) untuk pemisahan antibiotik
beta-laktam tertentu dari kotorannya yang spesifik, namun metode yang dijelaskan hanya mengacu
pada satu antibiotik dan pengotornya yang berkaitan dengan struktur dan kurang cocok untuk
tujuan identifikasi dari campuran kompleks
Sejumlah publikasi mengenai identifikasi dan pemisahan beta-lactam oleh TLC telah muncul dalam
literatur, namun hanya sedikit dari mereka yang membahas pemisahan simultan dari campuran
kompleks turunan struktural. 5-8
Secara struktural, penisilin didasarkan pada kerangka heterosiklik, penam, dibentuk oleh kondensasi
cincin beta-laktam dengan yang thiazolidine. Dalam penelitian ini kami menganalisis empat turunan
penisilin yang paling sering digunakan dengan karakteristik struktural yang berbeda: benzilpenisilin
(PEN) - penisilin alami pertama yang diperkenalkan dalam terapi; ampisilin (AMP) dan amoksisilin
(AMO) - dua aminopenicillin semisintetik; oxacillin (OXA) - izoxazolilpenicillin semisintetik. Penisilin
berbeda satu sama lain dalam substituen R yang menempel pada residu asam 6-aminopenisillanat.
Struktur kimia penisilin yang diteliti disajikan pada Gambar 1.
Kerangka sefalosporin termasuk dalam heterocycle, cefem, dibentuk oleh kondensasi cincin beta-
laktam dengan satu dihydrothiazine. Dalam penelitian ini kami menganalisis enam turunan
sefalosporin yang sering digunakan: cefalexin (CEL), cefadroxil (CFD), sefaclor (CFC) - sefalosporin
oral generasi pertama, sefuroksim (CFR) - sefalosporin parenteral generasi kedua, ceftazidim (CZI),
ceftriaxon (RKPT) - Sefalosporin parenteral generasi ketiga. Pergantian berbagai kelompok R dan R
menghasilkan sefalosporin dengan sifat farmakologis dan farmakokinetik yang berbeda. Struktur
kimia dari sefalosporin yang dipelajari disajikan pada Gambar 2.

Gambar 1. Struktur kimia penisilin yang diteliti4,9


Tujuan kami adalah pemisahan beta-laktam dari campuran kompleks dan juga "pengoptimalan"
proses kromatografi generik, untuk meningkatkan kualitas pemisahan.
Bahan dan metode
Instrumentasi
Sistem TLC terdiri dari sampler Camag Nanomat III otomatis, sampler semi-otomatis Camag Linomat
IV (Camag, Swiss), microform 2-l Hamilton (Hamilton, AS), Camag Normal Development Chamber
dan lampu inspeksi lampu Camag (Camag , Swiss). Sebagai fase stasioner, kami menggunakan pelat
gelas HPF kaca silika GF254 10x20 dan 20x20 cm (Merck, Jerman).

Gambar 2. Struktur kimia dari sefalosporin yang dipelajari4,9


Reagen
Penisilin: amoksisilin trihidrat, ampisilin trihidrat, natrium benzilpenisilin, natrium oxacillin
(Antibiotice Iaşi, Romania). Cephalosporin: cefalexin monohidrat, sefadroksil monohidrat, cefaclor
monohidrat (Sandoz, Romania), natrium cefuroksim (Medochemie, Siprus), ceftazidim pentahidrat,
ceftriaxon sodium (Antibiotice Iaşi, Romania). Semua beta-laktam yang dipelajari adalah kelas
farmasi.
Reagen: aseton, asam asetat, benzena, butanol, etanol, etil asetat, formaldehid, metanol, asam
sulfat (Reactivul Bucureşti, Romania). Semua reagen memiliki nilai analitis.

Sampel
PEN dan OXA, digunakan sebagai garam natrium, oleh karena itu sampel disiapkan dalam
air dengan konsentrasi 0,2%. AMP dan AMO, yang digunakan sebagai trihidrat,
menunjukkan kelarutan yang buruk pada air; akibatnya sampel 0,2% disiapkan dengan
larutan natrium bikarbonat 2%. Sampel Cephalosporin disiapkan dengan melarutkan zat
dalam metanol dan kemudian diencerkan dengan air (1: 1). Jumlah 0,5 l diaplikasikan pada
kromatopilin menggunakan semprit Hamilton.
metode
Ruang kromatografi jenuh dengan fase gerak selama 30 menit. Pelat tersebut dikembangkan di atas
jarak 15 cm di ruang kromatografi berlapis kertas filter, dikeringkan dalam aliran udara panas, dan
diperiksa di bawah radiasi UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Bintik-bintik itu kemudian
divisualisasikan dengan menempatkan piring di ruang kromatografi yang jenuh dengan uap yodium.
Beberapa reaksi warna in situ spesifik digunakan untuk meningkatkan spesifisitas metode ini. Semua
percobaan dilakukan pada suhu kamar. Foto-foto dari chromatoplates diambil dengan kamera Nikon
D-3100, dilengkapi dengan filter UV.
Prosedur pendeteksian kromatografi
Tiga prosedur deteksi digunakan; pertama dengan uap iodin dan kemudian menggunakan reaksi
warna plat situ dengan yodium dan ninhidrin, setelah hidrolisis alkali.
Beberapa kristal yodium ditempatkan di dasar ruang kromatografi rapat rapat, disimpan dalam
lemari es. Setelah beberapa jam selama yodium ungu menguapkan dan mendistribusikan dirinya
secara homogen ke seluruh bagian dalam ruangan, piring kromatografi diperkenalkan di dalam
ruangan. Setelah 30 menit piring disemprotkan dengan larutan pati 1%.
Kromatogram disemprotkan terlebih dahulu dengan larutan natrium hidroksida 1N, untuk
menghidrolisis cincin beta-laktam, dan setelah 15 menit dengan larutan yang mengandung 0,2 g
kalium yodium, 0,4 g iodium dilarutkan dalam 20 ml etanol dan 5 ml asam klorida 10%.
Kromatopat pertama kali disemprotkan dengan larutan natrium hidroksida 1N, untuk menghidrolisis
cincin beta-laktam, dan setelah 15 menit dengan larutan ninhidrin 0,1% dalam etanol, dan
dipanaskan dalam oven pada suhu 120 ° C selama 10 menit.
Hasil dan Diskusi
Tujuan metode (pemisahan simultan dari campuran multikomponen), dan informasi tentang sampel
(struktur, polaritas, kelarutan, stabilitas) penting sebagai petunjuk awal untuk pemilihan sistem
kromatografi, dengan menggunakan aturan segitiga Stahl. 2,10,11
Fase diam yang paling banyak digunakan untuk analisis beta-laktam adalah silicagel, namun jika kita
berkonsultasi dengan literatur, fase terbalik atau pelat selulosa juga telah digunakan. Permukaan
silicagel beruang gugus Si-OH yang mampu mengikat hidrogen dengan zat polar. Fase mobile untuk
pemisahan kedua penisilin dan sefalosporin bersifat polar, biasanya mengandung sejumlah kuantitas
air.5-7,12
Asam (asam asetat) ditambahkan ke fase gerak untuk menghindari dekomposisi cincin beta-laktam
pada silicagel.
Sekitar dua puluh pelarut diuji dan enam fase gerak dipilih (Tabel 1).

Tabel 1. Fase mobile yang dipilih

Gambar 3. Kromatogram yang diperoleh pada pemisahan penisilin menggunakan fasa gerak III (etil
asetat - asam asetat 60:20:20), deteksi pada sinar UV pada 254 nm (A) dan 366 nm (B - AMP, 2 -
AMO, 3 - PEN, 4 - OXA)
Gambar 4. Kromatogram yang diperoleh pada pemisahan sefalosporin dengan menggunakan fase
gerak III (etil asetat - asam asetat 60:20:20), deteksi pada sinar UV pada 254 nm (A) dan 366 nm (1 -
CFD, 2 - CEL, 3 - CFC, 4 - CFR, 5 - CZI, 6 - RKPT)
Nilai Rf, warna dan fluoresensi bintik-bintik disebutkan pada Tabel 2 dan 3 masing-masing.

Kesulitan muncul pada pemisahan dua aminopeniskia (AMP, AMO) dan dari tiga generasi pertama
sefalosporin oral (CEL, CFD, CFC); zat dengan karakteristik struktural dan fisiko-kimia yang serupa.
Hal ini sering menguntungkan dalam TLC untuk dapat memperoleh kesan awal pemisahan zat
dengan mengekspos piring ke reaksi universal dengan harga ekonomis yang dicapai dengan cepat
sebelum beralih ke karakterisasi akhir menggunakan reaksi spesifik kelompok tertentu.23,12 Deteksi
oleh yodium biasanya didasarkan pada konsentrasi fisik molekul yodium di zona kromatogram
lipofilik, tanpa terjadinya reaksi kimia apapun. Yodium lebih kuat diperkaya di zona zat daripada di
lapisan silicagel bebas kutub bebas. Hasilnya adalah munculnya zona kromatogram coklat dengan
latar belakang kuning. Zona kromatogram dapat distabilkan dengan menyemprotnya dengan larutan
pati 1%; ketika klatrat biru yang terkenal terbentuk (senyawa inklusi pati-iodin), yang tetap stabil
selama berbulan-bulan. Kehadiran beta-lactam berbeda ditunjukkan oleh munculnya bintik-bintik
pucat dengan latar belakang biru-ungu.

Ketika deteksi dilakukan dengan menyemprotkan chromatoplate dengan larutan iodine-potassium


iodide, yodium yang terkandung dalam reagen bereaksi secara kimia dengan asam penisilinat,
karena cincin beta-laktam awalnya dibuka dengan hidrolisis basa. Perlakuan selanjutnya dengan
larutan pati yang digunakan setelah perawatan yodium untuk stabilisasi dan peningkatan zona
kromatogram "yodium" tidak dapat digunakan di sini karena lapisan - bahkan setelah penguapan
yodium berlebih - masih mengandung begitu banyak yodium sehingga seluruh latar belakang
berwarna. biru.
Aminopenicillins (AMP, AMO) terbukti lebih sensitif terhadap reaksi ninhidrin setelah hidrolisis alkali
dari PEN atau OXA, yang hampir tidak terlihat. Cephalosporins tidak dapat dideteksi dengan jelas
dengan ninhydrine, karena ninhydrine benar-benar bereaksi dengan produk degradasi penisilin
dalam lingkungan alkalin, D-penicillamine. Secara umum, senyawa terkait asam amino dapat
divisualisasikan dengan menggunakan reagen ninhidrin.
Penisilin juga dapat dideteksi dengan menyemprotkan piring dengan pereaksi formaldehida asam
sulfat (larutan formaldehida 37% dalam asam sulfat 1:10), bintik-bintik kuning gelap terdeteksi untuk
dua aminopenicillin (AMP, AMO), PEN memberi titik coklat sedangkan OXA berwarna kuning. Semua
sefalosporin memberi bintik kuning pucat dengan reagen ini. Pemanasan tidak diperlukan.
Reagen dragendorff (larutan kalium bismut iodida) juga digunakan untuk deteksi, namun beta-
laktam terbukti kurang sensitif terhadap pereaksi kromatografi yang umum digunakan ini, karena
semua penisilin memberikan titik oranye yang sangat pucat.
Meskipun kestabilan antibiotik beta-laktam dalam keadaan padat umumnya memuaskan, beta-
laktam yang dilarutkan dalam air atau pelarut lainnya secara bertahap beralih ke produk degradasi
yang berbeda melalui hidrolisis. Setelah pembubaran setiap antibiotik, larutan sampel dianalisis
dengan menggunakan fase gerak III, beberapa kali dalam durasi seminggu. Tingkat hidrolisis beta-
laktam sangat bergantung pada waktu dan suhu. Beberapa produk degradasi yang terdeteksi
oleh KLT ditemukan pada kasus PEN setelah penyimpanan 48 jam. Degradasi yang mungkin
terjadi pada kromatoplate untuk OXA, CEL, CFD dan CFC setelah sampel disimpan di
lemari es selama seminggu, karena menghasilkan lebih dari satu titik pada pelat KLT. Oleh
karena itu nilai konsentrasi beta-laktam yang ditentukan dalam larutan sampel tertentu hanya
berlaku untuk waktu aplikasi pada kromatoplate, namun tidak memberikan informasi yang
valid tentang jumlah beta-laktam pada saat pengambilan sampel. Sangat disarankan agar
larutan sampel disimpan dalam pendinginan, terutama jika sampel tidak dapat dianalisis
sesaat setelah pembubaran antibiotik. Hal ini sangat penting jika metode TLC diterapkan
untuk penentuan langsung dari sampel biologis.
Dengan sifat antibiotika yang tidak stabil ini, degradasi obat dapat terjadi selama larva run
dan bayangan serta tailing dapat terjadi akibat interaksi antara sampel dan pelarut yang
sedang berkembang; Namun dalam kasus kami, kerugian ini tidak signifikan dengan sistem
kromatografi yang dipilih.
Kesimpulan
Semua turunan beta-laktam yang dipelajari dapat dipisahkan dengan menggunakan silicagel
sebagai fase diam dengan fasa gerak yang sesuai. Penggunaan fasa bergerak, atau kombinasi
dua fase gerak, atau kombinasi fase gerak dan reaksi warna memungkinkan identifikasi bahan
yang dipelajari dari campuran kompleks. Tidak ada sistem yang akan memisahkan semua
beta-laktam, namun dapat diidentifikasi saat informasi tambahan diperoleh dari reaksi warna
dan / atau dengan menggunakan sistem TLC tambahan. Teknik identifikasi ini mudah
dilakukan dan bisa diterapkan dalam skrining analitis pendahuluan.
Dengan beberapa batasan mengenai stabilitas antibiotik beta-laktam, pelarut dan sistem
pendeteksian yang disebutkan di atas memungkinkan pemisahan dan pendeteksian yang cepat
dan mudah dari sejumlah besar penisilin dan sefalosporin dan dapat bermanfaat.
aplikasi dalam kontrol kemurnian dan kestabilan beta-laktam dalam larutan dan bentuk sediaan.

Você também pode gostar