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nternational Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79 - 97

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Alimentos estragados - interações entre as bactérias de


deterioração de alimentos
Lone Gram um, * , Lars Ravn um , Maria Rasch um , Jesper Bartholin Bruhn um , Allan B.
Christensen b , Michael Givskov b
um Departamento de Pesquisa de Frutos do Mar, Instituto Dinamarquês de Pesquisas Pesqueiras, Søltofts Plads, c / o
Universidade Técnica da Dinamarca Bldg. 221,
DK-2800 Kgs. Lyngby, Dinamarca
b BioCentrum, Seção de Microbiologia Molecular, Universidade Técnica da Dinamarca, Bldg. 301, DK-2800 Kgs. Lyngby,
Dinamarca

Aceito em 26 de maio de 2002

Abstrato

A deterioração de alimentos é um processo complexo e quantidades excessivas de alimentos são perdidas devido à
deterioração microbiana, mesmo com técnicas modernas de preservação. Apesar da heterogeneidade das matérias-primas e as
condições de processamento, a microflora que se desenvolve durante o armazenamento e em estragar os alimentos podem ser
previstos com base no conhecimento da origem dos alimentos, a base substrato e alguns parâmetros de preservação central,
tais como temperatura, atmosfera, um we pH. Com base nesses conhecimentos, análises sensoriais, químicas e microbiológicas
mais detalhadas podem ser realizadas nos produtos individuais para determinar o organismo específico de
deterioração. Enquanto os parâmetros químicos e físicos são os principais fatores determinantes para a seleção de
microorganismos de deterioração, um nível de refinamento pode ser encontrado em alguns produtos em que o comportamento
interativo dos microrganismos pode contribuir para o seu crescimento e / ou atividade de deterioração. Esta revisão dá três
exemplos. Descrevemos a vantagem competitiva de Pseudomonas spp. devido à produção de sideróforos quelantes de ferro ,
a geração de substratos para reações de deterioração por um organismo de outro microrganismo (a chamada metabiose) e
a regulação positivade fenótipos potencialmente envolvidos na deterioração através da comunicação célula-a-célula . Em
particular, relatamos pela primeira vez a ocorrência generalizada de lactonas de N-acil homoserina (AHL) em alimentos
frescos armazenados e deteriorados e discutimos as implicações potenciais para deterioração e preservação de alimentos.
D 2002 Elsevier Science BV Todos os direitos reservados.

Palavras-chave: N-Acyl homoserine lactones; Antagonismo; A deterioração dos alimentos; Metabiose; Quorum
sensing; Sideróforos; Organismos específicos de deterioração
1. Introdução

A preservação de alimentos foi, desde o início da humanidade, necessária para nossa sobrevivência. As
técnicas de preservação usadas nos primeiros dias dependiam - sem qualquer compreensão
da microbiologia - da inativação dos microrganismos estragados através da secagem,

* Autor correspondente. Tel .: + 45-45-25-25-86; fax: + 45-45- 88-47-74.


Endereço de e-mail : gram@dfu.min.dk (L. Gram).
URL: http://www.dfu.min.dk/micro/lg.htm.
salga, aquecimento ou fermentação. Esses métodos ainda são usados hoje, embora usando menos e menos preservação
e combinando vários procedimentos de preservação leve para inibir o crescimento de microorganismos. A deterioração
é caracterizada por qualquer alteração em um produto alimentício que a torne inaceitável para o consumidor do ponto
de vista sensorial. Isso pode ser um dano físico, alterações químicas (oxidação, mudanças de cor) ou aparência de off-
flore e off-odoresresultantes do crescimento e metabolismo microbiano do produto. A deterioração microbiana é, de
longe, a causa mais comum de deterioração e pode se manifestar como um crescimento visível (lodo, colônias),
0168-1605 / 02 / $ - ver front matter D 2002 Elsevier Science BV Todos os direitos reservados. PII: S0 1 6 8 - 1 6 0 5 (0 2) 0
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alterações urais (degradação de polímeros) ou como fora de odores e aromas anormais. Apesar das cadeias de frio,
preservativos químicos e uma compreensão muito melhor da deterioração microbiana dos alimentos, estima-se que
25% de todos os alimentos produzidos globalmente sejam perdidos após a colheita ou após o abate devido à
deterioração microbiana (Anonymous, 1985) .
Esta revisão fornece uma breve introdução ao conceito específico de organismo de deterioração e uma visão geral
do que é atualmente conhecido sobre microbiologia de deterioração de diferentes produtos alimentícios. Os
microorganismos que dominam um produto podem ser preditos, e estimativas qualificadas podem ser feitas em termos
dos organismos que causam a deterioração, entendendo como os principais parâmetros de preservação afetam a seleção
microbiana. Padrões claros, indepen- dente de matéria-prima e de processamento, em termos dos quais dominam
organismos e estragar os produtos alimentares como uma função de, por exemplo, origem, base de substrato,
temperatura, pH, um we atmosfera. Acreditamos que tal entendimento da ecologia microbiana é essencial para que as
perdas pós-colheita e pós-abate excedentes sejam reduzidas. Além disso, o conhecimento dos microorganismos
envolvidos na deterioração e dos metabólitos associados à deterioração é necessário para desenvolver métodos
microbiológicos e químicos para avaliação da qualidade e vida de prateleira.

O crescimento e a actividade de ismos deterioração microorgan- é principalmente descrita e estudada


como uma função de base de substrato e de parâ- metros químicas e físicas, tais como temperatura, pH,
um w e atmosfera. A importância destas condições para a seleção de uma microflora de deterioração não
pode ser subestimada, no entanto, está se tornando cada vez mais claro que em algumas situações também
o comportamento interativo entre os microrganismos determina a seleção e / ou metabolismo e subsequente
deterioração. A maior parte desta revisão dá 3 exemplos de comportamento interativo microbiano de
importância potencial na deterioração microbiana de alimentos, a saber: (i) antagonismo, (ii) metabiose e
(iii) comunicação célula a célula .

2. O conceito de organismos específicos de deterioração

Todo e qualquer produto alimentício abriga sua própria microflora específica e característica em qualquer ponto no
tempo durante a produção e armazenamento. Esta microflora é uma função das condições de flora, processamento,
conservação e armazenamento da matéria-prima. Apesar da variabilidade em todos os três, alguns padrões muito claros
emergem, e
Com base no conhecimento de alguns parâmetros químicos e físicos, é possível, com grande precisão,
prever quais microrganismos irão crescer e dominar em um determinado produto. No ponto de rejeição
sensorial (deterioração), a chamada microflora de deterioração (ou associação de deterioração) é composta
de microrganismos que contribuíram para a deterioração e microorganismos que cresceram, mas não
causaram mudanças desagradáveis. O primeiro é o chamado sistema específico de deterioração (SSO) do
produto.
O potencial de deterioração de um microrganismo é a capacidade de uma cultura pura de produzir os
metabólitos que estão associados à deterioração de um determinado produto. Em geral, vários dos
organismos isolados de um produto alimentício serão capazes de produzir metabólitos de deterioração
quando permitido o crescimento ilimitado. É crucial que considerações quantitativas sejam
introduzidas (Gram, 1989), uma vez que a atividade de deterioração de um organismo é sua capacidade
quantitativa de produzir metabólitos de deterioração (Dalgaard et al., 1993; Dalgaard, 1995).Assim, é para
ser avaliado se os níveis do organismo específico atingido em alimentos naturalmente deteriorantes são
capazes de produzir a quantidade de metabolitos associados à deterioração. Em geral, requer uma
combinação cuidadosa de microbiologia, análises sensoriais e química para determinar quais
microorganismos são os SSOs de um determinado produto alimentício.

Apesar da importância dos microrganismos na deterioração dos alimentos, a definição e avaliação da


deterioração baseia-se na avaliação sensorial. Como descrito acima, os microrganismos específicos são a
causa da deterioração, no entanto, nem o nível de '' contagem total '' de, por exemplo, 10 7 ufc / cm 2 (Mano
et al., 1995) nem o nível de SSO por si só pode prever diretamente a qualidade sensorial de um produto. Em
contraste, o nível de SSO pode ser usado para prever a vida útil restante de um produto sob condições em
que o SSO é importante. Exemplos disso são a previsão do tempo de conservação restante congelado de
bacalhau com base no número de Shewanella putrefaciens (Jørgensen et al., 1988) e de bacalhau
compactado com atmosfera modificada com base no número de Photobacterium phosphoreum(Dalgaard et
al., 1997) .

3. Microrganismos que estragam os alimentos


Quase todos os grupos de microorganismos abrigam membros que, sob algumas condições, podem
contribuir para a deterioração dos alimentos. Teoricamente, pode-se supor que
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Todos os microorganismos estão inicialmente presentes em um produto alimentício onde após a
seleção ocorre - com base principalmente na composição dos nutrientes e nos parâmetros químicos e
físicos. Microflores semelhantes surgem em diferentes produtos alimentícios sob as mesmas condições,
apesar da heterogeneidade no início. Assim, Pseudo-monas spp. e alguns outros organismos
psicrotróficos Gram-negativos dominam alimentos proteicos armazenados aerobicamente a temperaturas
baixas. Isto é verdade para carne, aves, leite e peixe. Se o pH é alto, como no peixe e na carne de 'Dark
Firm Dry' (DFD), os organismos do tipo S. putrefaciens se desenvolvem em paralelo e podem se tornar os
organismos dominantes, como é o caso dos peixes marinhos e gelados (Chai et al., 1968). As pseudômonas
no leite pasteurizado têm origem na contaminação pós-processo (Eneroth et al., 2000), mas o produto
também pode deteriorar-se devido ao crescimento de Bacillus psicrotróficos (Ternstro m et al., 1993) dos
quais os esporos sobreviveu ao tratamento térmico.

Em carne e peixe, uma mudança na atmosfera, por exemplo, por empacotamento a vácuo, inibirá as
pseudo- monadadas respiratórias e nas carnes causará uma mudança na microflora para bactérias de ácido
láctico (LAB), Enterobacteriaceae e às vezes Brochothrix thermosphacta (Dainty e Mackey, 1992) . Além
disso, os clostrídios podem causar uma deterioração anaeróbica de músculo profundo de carnes embaladas
a vácuo (Broda et al., 1996) . S. putrefaciens, que é capaz de respiração anaeróbica, também cresce e
contribui para a deterioração da carne com alto pH. Em peixes, a embalagem a vácuo seleciona a S.
putrefaciens e a bactéria marinha psico-resistiva P. phosphoreum resistente ao CO 2 . CO 2O
empacotamento de peixes de águas temperadas não seleciona para LAB, mas permite que P. phosphoreum
cresça e este organismo estraga o produto (Dalgaard et al., 1993) . Um tratamento térmico suave dos peixes
resulta na eliminação de bactérias vegetativas e clostridia e Bacillus (que tanto sobrevivem como esporos)
podem crescer e estragar o produto, especialmente se embalados a vácuo (Ben Embarek, 1994) .

Além disso, a "pressão seletiva", por exemplo, a adição de baixos níveis de sal e a secagem dos peixes,
eventualmente, mudam a microflora na mesma direção que a carne embalada a vácuo e os produtos de
carne. Assim, uma microflora de LAB, Enterobacteriaceae e - até certo ponto - Brochodrix
se desenvolve (Lyhs et al., 1998; Truelstrup-Hansen e Huss, 1998; Joffraud et al., 2001) . Devido à origem
aquática, o P. phosphoreum está frequentemente presente. Identificando o SSO de produtos de peixe
levemente preservados
e de produtos cárneos processados tem se mostrado difícil e, provavelmente, diferentes grupos de bactérias
são importantes sob diferentes condições. Assim, em alguns ensaios, os indicadores de deterioração são
paralelos aos metabólitos de P. phosphoreum, em outros ensaios, o de uma flora LAB (Lactobacillus
curvatus) e em outros, os metabólitos combinados de LAB e Enterobacteriaceae (Jørgenen et al., 2000a,
b) .
Aumentar a preservação por uma diminuição do pH (abaixo de 5), um aumento na concentração de NaCl
(acima de 6%) e pela adição de sorbato e / ou benzoato elimina a microflora Gram-negativa . LAB e
levedura são os organismos remanescentes em produtos de peixe semi-conservados . Diferentes
Lactobacillus spp., Incluindo Lactobacillus alimentarius (Lyhs et al., 2001) foram identificados como
organismos de deterioração desses produtos. Carnes que são curadas por sal e pH baixo são
geralmente estáveis em armazenamento e não são estragadas pelo crescimento microbiano (ICMSF,
1998) . O perfil de preservação de, por exemplo, à base de maionesesaladas é semelhante aos produtos
semi-conservados de peixe em termos de pH, temperatura, atmosfera e conservantes químicos e
uma microfluna de LAB pode se desenvolver (Delaquis et al., 1997; ICMSF, 1998) . Além disso, os sucos
de frutas, que são ricos em açúcar e têm um pH baixo (geralmente entre 2,0 e 4,5), muitas vezes estragam
devido ao crescimento de LAB e / ou leveduras (Edwards et al., 1998; Tajchakavit et al., 1998) . No suco
pasteurizado, a bactéria formadora de esporos tolerante a ácido Alicyclobacillus acideoterrestris é um
importante organismo de deterioração (Walls e Chuyate, 2000) . Diminuindo um welimina ainda mais o
crescimento bacteriano, e apenas os extremófilos (como os halófilos ou os osmófilos) e os fungos
filamentosos são capazes de se desenvolver em produtos de peixe, carne e frutas salgados e secos (Pitte
Hocking, 1997) . Assim, como o aumento de perfil preservação em força inibitória, as alterações da
microflora ao longo do percurso seguinte: não fermentativas tróficos psychro- Gram-
negativasbactérias ! bactérias Gram-negativas fermentativas !LAB ! Leveduras ! fungos filamentosos.
Produtos alimentícios de origem vegetal apresentam um caso especial devido à composição dos
nutrientes. O pH elevado permitirá que uma gama de bactérias Gram-negativas cresça, mas a deterioração
é especificamente causada por organismos capazes de degradar o polímero vegetal, a pectina (Liao, 1989;
Liao et al., 1997) . Estes organismos, tipicamente espécies de Erwinia e Pseudomonas, são o SSO de
vários produtos vegetais prontos para o consumo.

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(Nguyen-The e Prunier, 1989; Lund, 1992), mas também os fungos que degradam a pectina podem
desempenhar um papel na deterioração dos vegetais (Pitt e Hocking, 1997) .
A presença de etanol, como na cerveja e no vinho, é semelhante em “força de preservação” para, por
exemplo, baixo pH e alimentos salgados, e apenas permite o crescimento de LAB e leveduras. A resistência
aos compostos antibacterianos encontrados no lúpulo é necessária para que um organismo cresça em
cerveja. As espécies de lactobacilos são tolerantes a estes iso-ácidos e várias espécies foram identificadas
como SSOs na cerveja (Sakamoto et al., 2001) . Além disso, várias espécies de Pediococcus são
importantes organismos que destroem a cerveja (Jespersen e Jakobsen, 1996) .
Exemplos da influência da '' pressão de preservação '' na seleção da microflora deteriorante em uma
variedade de produtos alimentícios são mostrados na Tabela 1 .

3.1. Reações de deterioração de comida

Como mencionado, a deterioração microbiana geralmente se manifesta como slime e / ou off-


odors e off-flavors. Muitos estudos descreveram em termos mais químicos quais compostos caracterizam a
deterioração de determinados produtos e quais substratos foram usados pelos microrganismos para formar
esses compostos (Tabela 2) . Tal conhecimento é importante, por exemplo, se um produto químico
tabela 1
Organismos de deterioração típicos de produtos alimentícios dependendo do perfil de preservação físico / químico

Temperatura Atmosfera pH um w Base de Substrato Típica Deterioração típica

produtos organismo
Baixo Alto Aeróbico não aeróbico Baixo Alto Baixo alto Amino Simples Complexo
ácidos CHO CHO
x x x x x peixe Shewanella
Pseudomonas
x x x x x peixe Photobacterium,
Shewanella
x x x (x) x defumado LAB,
peixe Enterobacteriaceae,
Fotobactéria
x x x (x) x (x) marinado LAB, leveduras
peixe
x x x x x (x) carne Pseudomonas
x x x x x (x) carne LACA,
Enterobacteriaceae,
Brocothrix, clostridia
x x (x) (x) x (x) carne LACA,
produtos Enterobacteriaceae,
Brochotrix
x x x x x leite Pseudomonas
Bacilo
x x x x x cru Erwinia,
legumes Pseudomonas
fungos
x x x x x ovos Pseudomonas
Enterobacteriaceae
x x x x x (x) frutas leveduras
filamentoso
fungos
x x x x (x) maionese leveduras, LAB
saladas
x x x x (x) Cerveja LAB, leveduras
x x x x (x) vinho LAB, leveduras
fungos
x x x x x cereais filamentosos
fungos
x x x x x nozes filamentosos

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mesa 2
Exemplos de substratos e metabolitos típicos de deterioração encontrados em alimentos estragados
microbiologicamente
Sensorial Spoilage Spoilage Comida Deterioração específica Referência
impressão produtos substrato produtos organismo
Lodo EPS sacarose Kimchi Leuconostoc Kim et al. (2001)
(dextrana)
peito de peru Leuconostoc Samelis et al. (2000)
açúcares vinho Pediococcus Walling et al. (2001)
damnosus
açúcares pão Bacilo Thompson et al. (1998)
Lodo hidrolisado pectina legumes Erwinia, Nguyen-The e Prunier (1989)
polímero Pseudomonas
Duvidoso trimetilamina trimetilamina peixe S. putrefaciens Shaw e Shewan (1968)
odor estranho (TMA) óxido (TMAO)
P. phosphoreum Dalgaard et al. (1993)
Aeromonas spp. Gram et al. (1990)
Amônia, NH 3 aminoácidos proteico muitos
pútrido alimentos microorganismos
Biogênico aminoácidos carne Enterobacteriaceae Edwards et al. (1985)
aminas e LAB
pescar um Enterobacteriaceae, Jørgensen et al. (2000b)
LAB
pescar um P. phosphoreum Jørgensen et al. (2000b)
Sulphidy H2S cisteína carne de peixe S. putrefaciens Chai et al. (1968) ,
odor estranho Herbert e Shewan (1976)
Enterobacteriaceae Dainty e Mackey (1992)
L. sake´, L. curvatus
Greening H2S cisteína carne L. plantarum Lee e Simard (1984)
Sulfidil (CH 3 ) 2 S 2 metionina carne de peixe Pseudomonas spp. Segal e Starkey (1969) ,
odores
desagradáveis Enterobacteriaceae Herbert e Shewan (1975)
Ácido ácido acético glicose, carne LAB Nassos et al. (1983)
odor estranho L, ácido D-láctico ribose,
outro CHO
''Doce proteinaceus fosfolipídio leite B. cereus IDF (1992)
coagindo '' partículas gordas
Frutado ésteres peixe P. fragi Miller et al. (1973)
odor estranho
leite P. fragi, Cormier et al. (1991) ,
P. putida e Whitfield et al. (2000)
Y. intermedia
Cheesey acetoína, diacetil, glicose carne B. thermosphacta Dainty e Mackey (1992)
odor estranho 3-metilbutanoil Enterobacteriaceae
homofermentativo
LAB
Remédio 2-metoxi-fenol, açúcares suco A. acidoterrestris
Paredes e Chuyate (2000)
odor estranho sedimento
Mofado tricloroanisol 2,4,6 vinho P. brevicompactum, Filtenborg et al., 1996
odor triclorofenol A. flavus
Uma amina biogênica pode não ser a causa da deterioração, mas pode servir como um índice de deterioração (Jørgensen et al.,
2000a) .
índice de deterioração deve ser desenvolvido. Exemplos disto incluem trimetilamina de peixe marinho
gelado. Este conhecimento também pode ser usado para eliminar um composto promotor de deterioração,
por exemplo sacarose como
ener em camarão salgado. Neste caso, o slime / ropiness é formado por Leuconostoc a partir de sacarose e
substituindo por, por exemplo, adoçantes artificiais ou álcoois de açúcar, pode impedir esta
deterioração (From, 1988) .
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4. Interações entre bactérias que estragam os alimentos
As condições seletivas impostas à comunidade microbiana de alimentos por parâmetros físicos e
químicos, conforme descrito na Tabela 1 , são sem dúvida as mais importantes em termos de crescimento
e seleção de microrganismos. No entanto, a deterioração de alimentos microbiana é um processo que
envolve o crescimento de microorganismos aos números (10 7 -10 9 cfu / g) na qual os microrganismos,
também devem ser assumidas para interagir e influenciar o crescimento de um outro (Boddy e
Wimpenny, 1992 ) . As interações entre microorganismos podem ser classificadas com base em seus efeitos
como sendo prejudiciais ou benéficas (Fredrickson, 1977).. Vários tipos de interações têm sido estudados
em ecossistemas de alimentos, incluindo tanto o comportamento antagônico e coordenado e interações onde
o crescimento ou um metabolismo particular de um organismo é favorecido pelo crescimento de outro
organismo. Esta seção fornece três exemplos de tal comportamento:

? antagonismo causado pela competição por ferro como mediada pela produção de sideróforos bacterianos e
subseqüente supressão da densidade celular máxima de bactérias menos competitivas,
? modificação no perfil de deterioração de um organismo pelo fornecimento de nutrientes de outro

microorganismo (metabiose),
? a capacidade das bactérias Gram-negativas para coordenar a expressão de certas características fenotípicas

(por exemplo, enzimas hidrolíticas) através da comunicação bacteriana via N-acilhomoserina lactonas
(AHLs).

4.1. Antagonismo

Mudanças nas condições ambientais, por exemplo, pela redução do pH, podem ser uma maneira poderosa de um
microorganismo antagonizar outras bactérias e criar uma vantagem seletiva. Além disso, a competição por nutrientes
pode selecionar os organismos mais capazes de eliminar o (s) composto (s) limitante (s). Vários microorganismos
importantes na deterioração de alimentos têm tais habilidades antagônicas. Assim, as bactérias do ácido láctico causam
um abaixamento do pH e podem produzir peptídeos antibacterianos (bacteriocinas) (Adams e Nicolaides, 1997) . As
reações de deterioração de certas bactérias Gram-negativas podem produzir NH 3 e trimetil-amina, que são tóxicas para
várias outras bactérias e, algumas vezes, para o organismo produtor.
em si. Pseudomonas spp., Em particular o grupo fluorescente, produzem uma variedade de compostos
antibacterianos e antifúngicos, tais como antibióticos e cianeto, e ao mesmo tempo competem de forma
muito eficiente pelo ferro (Ellis et al., 2000) .

4.1.1. Concorrência pelo ferro


Apesar da riqueza de nutrientes na maioria dos alimentos, as bactérias podem ser limitadas em
compostos selecionados, como minerais, aminoácidos ou açúcares. Assim, foi demonstrado que a
concentração de ferro é baixa em vários produtos de peixe (Gram, 1994) . O ferro é essencial para a maioria
dos microrganismos e é usado na respiração bacteriana (como o transportador de elétrons) e nas enzimas
redox. Devido ao alto poder oxidativo do Fe 3 + , o ferro está principalmente ligado a complexos insolúveis
no ambiente e em mamíferos e plantas. A maioria dos microorganismos, portanto, desenvolveu sistemas
quelantes de ferro altamente específicos, e muitas vezes eles produzem sideróforos, que são quelantes de
ferro secretados pela célula. Ao ligar de ferro o sideróforo-ferroO complexo é absorvido pela célula
microbiana e o ferro é liberado internamente (Crosa, 1997) . Em particular, pseudomonads são produtores
proeminentes de sideróforos com altas constantes de ligação de ferro. A capacidade quelante do ferro tem
sido de particular interesse na rizosfera, onde o uso de pseudomonas como agentes de biocontrole contra
doenças fúngicas tem sido atribuído em parte à sua vantagem competitiva em relação aoferro (O'Sullivan e
O'Gara, 1992; Ellis et al., 2000) .

As bactérias que crescem em peixes produzem sideróforos (Gram e Melchiorsen, 1996) que só são
induzidos quando a concentração de ferro é limitante. Sideróforos foram extraídos de queijos indicando
que este alimento é limitado em ferro (Ong e Nielands, 1979) . Além disso, as bactérias que estragam os
ovos devem ser capazes de eliminar o ferro das proteínas de ligação do ferro (cf. Cox, 2001 ). Pseudomonas
spp. isolados de alimentos produzem sideróforos (Gram, 1993; Cheng et al., 1995; Laine et al., 1996) , em
particular cepas isoladas de peixes (Gram, 1993; Champomier-Verge`s e Richard, 1994). Também o ferro
de quelatos de S. putrefaciens pela produção de sideróforos (Gram, 1994) , mas apesar desta capacidade, é
fortemente inibido por pseudomonads produtores de sideróforos sob condições limitadas pelo ferro (Gram,
1993) . Quando cultivada em co-culturaem amostras de peixe, pseudômonas produtoras desideróforos
inibem, por exemplo, Shewanella quando as primeiras atingem aproximadamente 10 8 ufc / ge causam
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supressão da densidade celular máxima do organismo inibido ( Gram e Melchiorsen, 1996 ; Fig. 1 ). A depressão da
densidade celular máxima de microrganismos por uma microflora de '' crescimento excessivo '' também é observada
para Listeria monocytogenes crescendo em alimentos levemente preservados com uma flora bacteriana dominante de
ácido láctico (Grau e Vanderlinde, 1992; Nilsson et al.,
1999) . Este último fenómeno pode ser causado pela produção de bacteriocinas pela LAB, mas como vários
LAB não produtores de bacteriocina são tão inibidores (Nilsson et al., 1999) , a inibição pode também ser explicada
pela LAB competindo com a Listeria em alguns nutrientes essenciais (Buchanan e Bagi, 1997) . Esta supressão (de
densidade populacional máxima) de um
Fig. 1. A supressão da densidade celular máxima de S. putrefaciens por sideróforos produzindo P. fluorescens quando
cultivada em músculo de bacalhau a 0 jC (modificado de Gram e Melchiorsen, 1996 ).

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Um organismo particular de uma microflora que cresce excessivamente é chamado de efeito
Jameson (Jameson, 1962; Stephens et al., 1997; Ross et al., 2000) .
Não está claro até que ponto a atividade competitiva de, pseudomonads, por exemplo, contribui para a
sua dominância durante a deterioração de alimentos proteicos. Uma vez que o S. putre-faciens pode ser
isolado de perca fresca do Nilo e o peixe contém óxido de trimetilamina, seria de esperar que esta bactéria
contribuísse para a deterioração do peixe gelado. No entanto, a deterioração é causada exclusivamente por
Pseudomonas spp. (Gram et al., 1990) e tem sido sugerido que sua capacidade competitiva contribui para
essa dominância (Gram e Melchiorsen, 1996) .
Remoção de ferro e outros metais vestigiais tem sido sugerida como uma forma de controlar o
crescimento de microorganismos de deterioração. Leveduras de deterioração não cresceram em suco de uva
em que o ferro foi quelado por resinas (Feng et al., 1997) . É, no entanto, improvável que a adição de altas
concentrações de quelantes de ferro seja amplamente adotada devido aos óbvios efeitos negativos sobre o
valor nutricional de produtos alimentícios limitados em ferro.

4.2. Metabiose

Inúmeras formas de interdependência existem entre diferentes organismos. O termo metabiose descreve a
dependência de um organismo em outro para produzir um ambiente favorável. Isto pode ser a remoção de um oxigênio
por uma microflora Gram-negativa permitindo que organismos anaeróbicos como o Clostridium botulinum
cresçam (Huss et al., 1979) ou podem ser situações onde um organismo fornece nutrientes aumentando o crescimento
de outro. Assim, vários estudos têm
mostraram que, apesar da atividade inibitória das pseudomônadas descritas acima, sua presença também
pode aumentar o crescimento de alguns microrganismos. A pré-inoculação de leite com
diferentes bactérias psicrotróficas Gram-negativasresultou em maior crescimento e mais ácido de bactérias
lácticas (Cousin e Marth, 1977) e o crescimento de Staphylococcus aureus também pode ser estimulado por
Pseudomonas spp. ( Seminiano e Frazier, 1966) . Essa inter- dependência de nutrientes também pode
desempenhar um papel na deterioração dos alimentos (Dainty et al., 1986; Jørgensen et al., 2000b) .
Aminas biogênicas, que são formadas por decomposição bacteriana de aminoácidos, têm sido sugeridas
como um indicador de qualidade de carne bovina embalada a vácuo (Edwards et al., 1985) . A microflora
de deterioração deste produto consiste tipicamente de uma mistura de LAB e Enterobacteriaceae. Hafnia
alvei e Serratia liquefaciens (hoje: Serratia proteamaculans) como culturas únicas produzem níveis de
cadavarina semelhantes ao produto naturalmente contaminado, no entanto, o nível de pureza das culturas
individuais não corresponde ao produto deteriorante. Alguns LAB degradam a arginina de ornitina (que é
o pré-cursor de putrescina) e co-inoculação do formador de putrescina Enterobac- teriaceae comLAB
com degradação de argininaresultou em uma produção 6 a 15 vezes maior de putrescina do que em culturas
isoladas ( Dainty et al., 1986 ; Tabela 3 ). As mudanças nas aminas biogênicas e no pH durante o
armazenamento do salmão defumado frio embalado a vácuo podem ser combinadas a um índice de
qualidade que se correlaciona com a avaliação sensorial do produto (Jørgensen et al., 2000a) . Altos níveis
de aminas biogênicas podem ser produzidos por culturas únicas de P. phosphoreum ou por L.
curvatus (Jørgensen et al., 2000b), mas também podem surgir de co-culturas de lactobacilos e
Enterobacilos.
Tabela 3
Interação metabólica entre bactérias do ácido láctico e Enterobacteriaceae isoladas de carne embalada a
vácuo estragada (modificada de Edwards et al., 1985; Dainty et al., 1986 )

Estirpe bacteriana / espécie


produtos presente
S. liquefaciens H. alvei Enterobacteriaceae degradante de arginina LAB Putrescina Cadaverina
(ufc / g) (ufc / g) (ufc / g) LAB (cfu / g) (ufc / g) (Ag / g) (Ag / g)
Carne 10 5 - 10 8 - - - - 1 58
Carne 10 5 -7 - 3 ? 10 7 - 20 59
Carne - 10 - - - 4 58
Carne - 10 6 - 10 7 - 32 58
Carne - - - 10 7 - 10 8 - 1 <0,1
Estragar a carne - - 5 ? 10 4 - 10 6 - 10 6 - 10 7 15 a 20 50
L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97 87
teriaceae. Semelhante aos estudos da carne embalada a vácuo (Dainty et al., 1986) , a produção de
putrescina foi aumentada 10 a 15 vezes quando asEnterobacteriaceae positivas para ornitina-
decarboxilase foram co-cultivadas com LAB positivo para arginina-deiminase quando comparado com
LAB culturas (Jørgensen et al., 2000b) . Outros estudos descobriram similarmente que a interação entre
LAB e Enterobacteriaceae pode ser importante na deterioração de alimentos. Borch et
al. (1996)descobriram que uma mistura de LAB e H. alvei produzia os odores desagradáveis típicos de
estragar embalados a vácuocarnes, enquanto o cultivo dos organismos como culturas individuais não
resultou em odores desagradáveis. No salmão fumado a frio , a inoculação de três bactérias Gram-
negativas (Shewa-anella, Photobacterium e Aeromonas) não causou a deterioração do salmão fumado a
frio embalado a vácuo, enquanto a co-inoculação das bactérias Gram-negativas com B. thermosphacta e A
Carnobacterium piscicola produziu odores desagradáveis (Joffraud et al., 2001) .

Em leite pasteurizado, tanto Enterobacteriaceae (Yerestia intermedia) como Pseudomonas putida. pode
produzir odores desagradáveis (Whitfield et al., 2000). No entanto, a quantidade de ésteres que
causam odores frutados (do tipo pinha) foi aumentada quando os dois organismos foram co-cultivados.
Espécies psicotolerantes de Clostridium foram identificadas como o agente causador da deterioração
de carnes embaladas em vácuo (Broda et al., 1996) . Até onde sabemos, não houve relatos sobre a
influência de microrganismos que interagem nesse espólio. No entanto, bactérias aeróbicas (como S.
putrefa-ciens) afetam significativamente (aumentam) a produção de toxinas pelo C. botulinum Tipo
E (Huss et al., 1979) e pode-se especular que bactérias aeróbicas na carne por meio da remoção de oxigênio
pode criar um ambiente mais vantajoso para a clostridia de deterioração psicrotrófica.
O termo “organismo específico de deterioração” foi originalmente criado para descrever a espécie
(suposta) única sendo responsável pela deterioração. Embora Jørgensen et al. (2000b) introduziram o termo
“associação de deterioração metabólica” para descrever situações em que duas ou mais espécies
microbianas contribuem para a deterioração por troca de metabólitos ou nutrientes, este cenário poderia ser
coberto pelos “organismos específicos de deterioração”. cept onde deve ser especificado que um consórcio
de organismos interage para estragar o produto.
4.3. Comunicação baseada em lactona homoserinaacilada e detecção de tremue

A expressão de muitas características fenotípicas em microorganismos é governada por regulação gênica rigorosa e
influenciada pela fase de crescimento, nutrientes, tensões externas e uma infinidade de outros fatores. Vários padrões
comportamentais estão correlacionados com a densidade da população, e a capacidade de regular a expressão gênica
em função da densidade celular foi denominada “quorum sensing” (Fuqua et al., 1994) . O sensoriamento de quorum
exige que os microorganismos sejam capazes de se comunicar por meio de sinais químicos. Os péptidos servir como
as moléculas de sinal para monitorizar o tamanho da população em muitas bactérias Gram-
positivas bactérias (Kleerebezem et al., 1997) . Nas bactérias Gram-negativas , os sinais mais intensamente estudados
são o N-acillactonas homoserinas (AHLs) (Fuqua et al., 1996; Eberl et al., 1999; Whitehead et al., 2001) (Fig.
2) . Os sistemas de detecção de quórum baseados em AHL da família lux-homologousrequerem um mínimo de quatro
componentes para o funcionamento adequado:

(i) uma molécula sinalizadora do tipo AHL difusível, sintetizada por uma enzima (denominada
homólogo);
(ii) um receptor de ligação a AHL (referido como o homólogo de LuxR) cuja actividade de ligação ao ADN é
alterada em resposta à ligação da sua molécula de sinal cognato;
(iii) uma sequência de DNA (tipicamente referida como lux-box) localizada na região promotora de um gene
alvo, atuando como seqüência alvo para o homólogo regulador de LuxR, permitindo que ele atue como
regulador transcricional; e finalmente
(iv) um conjunto de genes alvo que resulta em um fenótipo particular, que é supra- regulado ou reprimido em
função da ligação LuxR-AHL .

O quorum sensing resulta do fato de que os AHLs são difusíveis sobre a membrana celular e que
a proteína reguladora LuxR requer uma concentração de limiar dos AHLs para ser ativada. Assim, embora
as AHLs sejam produzidas em baixos níveis em culturas diluídas, a ligação à proteína receptora e a ativação
transcricional dos genes-alvo só ocorrem em altas densidades celulares. A ligação do complexo LuxR-AHL
à lux-box resulta na transcrição de genes a jusante da lux-box e esta transcrição

88L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97

Fig. 2. Estrutura de lactonas homosserinas aciladas típicas. A cadeia de carbono pode variar de 4 a 14 átomos de carbono e o
terceiro átomo de carbono pode ser substituído por um grupo oxo- ou hidroxilo.
resulta em uma resposta fenotípica regulada pela AHL. Em algumas bactérias, o gene lux-homólogo está
localizado a jusante da lux-box. A produção da sintase AHL é, portanto, também regulada pelo complexo
LuxR-AHL, ou seja, é autoinduzível. Assim, a activação da proteína resulta em um reguladoras matic
dra- sobre-regulação de produção de AHL e como uma consequência fenótipos AHL regulados. Até
um aumento de 1000 vezes na atividade por célula foi relatado, por exemplo, para a produção de AHL e a
bioluminescência regulada pela AHL em Vibrio fischeri (Nealson et al., 1970; Ravn et al., 2001) . Em
outras bactérias, a produção de AHLé constitutivo e parece que a regulação para cima de fenótipos é menos
dramática (Atkinson et al., 1999; Ravn et al., 2001; Christensen et al., submetidos para publicação) .
A produção de AHLs e a regulação de diferentes características fenotípicas foram relatadas em muitas
bactérias Gram-negativas (para uma revisão recente, ver Whitehead et al., 2001 ). O sistema de quorum
sensing pode ser vantajoso para as bactérias, já que elas não gastam energia expressando fenótipos (em
baixas densidades de células) que são requeridas somente em altas densidades. Exemplos clássicos incluem
a regulação do comportamento simbiótico (por exemplo, bioluminescência em V. fischeri) ou fatores de
virulência (por exemplo, elastase em Pseudomonas aeruginosa (Passador et al., 1993) , produção de
antibiótico em Erwinia carotovora (Bainton et al., 1992) e Ti transferência de plasmídeo em
Agrobacterium tumefaciens (Zhang et al.,
1993), mas também comportamento mais complexo, como motilidade superficial e colonização de S.
liquefaciens (Eberl et al., 1996, 1999) e formação de biofilme de P. aeruginosa (Davies et al., 1998) e
Burkholderia cepacia (Huber et al. ., 2001) . A regulação dependente da densidade celular da expressão
gênica provavelmente reflete a necessidade de que o patógeno invasor atinja uma densidade populacional
crítica suficiente para sobrecarregar as defesas do hospedeiro e, assim, estabelecer a infecção. Da área
de interações planta-micróbio, um exemplo elegante foi publicado recentemente (Mae et al.,
2001) . Plantas transgênicas produtoras de N-oxoacil-homoserinalactona (OHL) apresentou resistência
aumentada à infecção por E. carotovora. As moléculas sinalizadoras originárias da planta forçam a E.
carotovora a ligar a produção de fatores de virulência à baixa densidade populacional bacteriana. A
produção de fatores de virulência provoca uma defesa vegetal que, devido à densidade bacteriana baixa e
insuficiente, empurra o equilíbrio da interação planta-patógeno na direção do aborto por infecção.

4.3.1. AHLs em alimentos e bactérias de deterioração de alimentos Como descrito acima, o organismo
específico de deterioração
Este conceito exige que seja estabelecida uma ligação entre a produção qualitativa e quantitativa de
metabolitos (deteriorantes) num organismo, o impacto destes metabolitos na impressão sensorial e o
crescimento do (s) organismo (s) em produtos naturalmente deteriorantes. Em particular, a quantidade de
metabolito por célula (por exemplo, o rendimento) é um

L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97 89


Tabela 4
Presença de lactonas homoserinas aciladas em brotos de feijão armazenados a 5 jC ( Rosager e Rasmussen, 2001 ; Gram e
Melchiorsen, dados não publicados)

Tempo de
armazenamento, Presença de Aeróbico
contagem em
dias AHLs pelo placas,
Monitor TraR log (cfu / g)
tensão pZLR4
1 + 8,00
6 ++ 9,30
1 + 7,70
9 ++ 9,00
1 + 8,95
4 ++ 9,78

parâmetro importante ao avaliar a atividade de deterioração (Dalgaard, 1995) . Se o quorum sensing for
usado por bactérias Gram-negativas envolvidas na deterioração e se as AHLs (up) regularem características
relevantes para o comportamento de deterioração, tais informações são cruciais para a avaliação da
atividade de deterioração de um organismo. Nós nos propusemos a determinar se a sinalização de
AHL ocorre em alimentos durante o armazenamento e a deterioração, como a sinalização de AHL difundida
está entre as bactérias de deterioração Gram-negativas e até que ponto a sinalização de AHL desempenha
um papel na deterioração de alimentos bacterianos.
As AHLs podem ser extraídas de amostras complexas como alimentos por homogeneização em acetato
de etila. Subsequentemente, a presença de AHLs pode ser avaliada usando uma ou várias cepas
de monitoramento de AHL bacterianas (McLean et al., 1997; Shaw et al., 1997; Ravn et al., 2001) . Usando
o Chromobacterium violaceum CviR (por exemplo, monitorar a cepa CV026) e os sistemas de
monitoramento TraR do A. tumefaciens (por exemplo, monitorar cepa com plasmídeo pZLR4),
descobrimos que muitos alimentos comerciais contêm grandes quantidades de AHLs ( Tabelas 4-6 ; Gram
et al. , 1999). Vários tipos de AHLs são produzidos em alimentos e isso pode ser visualizado pela separação
de AHLs extraídos em placas cromatográficas de camada delgada e posterior desenvolvimento
por Cepas AHL-monitor , por exemplo, A. tumefaciens pZLR4 (Fig. 3) . Além disso, a produção de AHL
em alimentos pode ser visualizada diretamente usando sistemas de repórter. Se uma estirpe produtora de
AHL e uma AHL-negativo estirpe que transporta um sistema de monitor de AHL (por exemplo, o luxR-
gene e luxI-promotor fundido com a GFP-repórter gene) são co-inoculada num pedaço de carne ou de
salmão, a aparência de verde fluorescência em células bacterianas únicas na carne / salmão significa
expressão in situ de lux e, portanto, produção de AHL (Fig. 4) .
Tabela 5
Presença de AHLs em produtos de peixe, dependendo da contagem de colônias e condições de armazenamento (Rosager e
Rasmussen, 2001; Gram et al., 1999)

Produto
alimentar Armazenamento ArmazenamentoArmazenamento Presença de AHLs log (cfu / g)
temperatura atmosfera Tempo LuxR TraR Aeróbico Entero-
(jC) (dias) monitor monitor placa bacteriaceae
pSB403 pZLR4 contagem

Filé de peixe 2 saco de plástico 0 nd ? 5,30 nd


10 ++ 8,30 nd
Filé de peixe 2 CO 2 -atm 1 nd + 3,90 nd
6 + 5,90
Peixe picadinho 2 CO 2 -atm 1 nd + 4,60 nd
3 + 5,70
Fumado a frio 5 vácuo 5 a 8 semanas ? nd nr <5
salmão,
6 amostras
Fumado a frio 5 vácuo 5 a 8 semanas + nd nr z6
salmão,
4 amostras
Fumado a frio 5 vácuo 0 nd ? 2,60 nd
salmão
9 ? 4,48
21 + 7,60
nd: não
concluído.
nr: não relatado.

90L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97

Tabela 6
Presença de AHLs em carne de frango e carne embalada a 5ºC (Rosager e Rasmussen, 2001; Bruhn et al., 2002)

Produto alimentar Armazenamento Fora- pH Presença de AHLs Entero- log (cfu / g)


Tempo odor bacteriaceae
CviR TraR LAB Aeróbico
(dias) monitor monitor placa
CVO26 pZLR4 contagem
Carne de vaca embalada
a vácuo , 0- 5,5 ?? 4,72 5,66 6,53
loja 1 4- ?? 3,85 6,30 7,08
7- ?? 4,38 7,04 7,76
14- ?+ 4,95 6,98 8,49
21Sour um ?+ 3,57 7,67 8,26
28Azedar 5,0 ?+ 4,74 7,95 8,15
Carne de vaca embalada
a vácuo , 0- 5,6 ?+ + 6,56 7,77 7,82
loja 2 7- ?+ + 6,58 8,11 8,53
14- ?+ + 6,63 8,23 8,30
21- uma ?+ + 7,11 8,32 8,45
28Pútrido 5,3 ?+ + 7,11 8,57 8,78
Carne de vaca embalada
a vácuo , 0- 5,8 ?+ + 4,04 6,45 6,45
loja 3 7- ?+ 6,36 8,49 8,56
14- ?+ + 6,57 8,20 8,71
21Putrid a ?+ 5,79 7,96 8,34
28Pútrido 5,6 ?+ + 6,83 8,36 8,67
Carne de vaca embalada
a vácuo , 0- 5,3 ?+ + 6,28 8,20 8,68
loja 4 7- ?+ + 6,11 8,26 8,64
14- ?+ + 6,23 8,26 8,65
21Sour um ?+ + 6,30 8,49 8,54
28Azedar 5,2 ?+ + 6,30 8,49 8,62
Carne de vaca embalada
a vácuo , 0- 5,7 ?+ + 7,04 7,08 7,89
loja 5 7- ?+ + 7,28 7,89 8,74
14Putrid a ?+ + 7,15 8,78 9,00
21Pútrido 5,5 ?+ + 7,38 8,48 8,56
Carne de vaca embalada
a vácuo , 2nd nd nd ++ nd nd 7,60
loja 6 23nd nd nd ? nd nd 8,11
Turquia,
armazenamento
aeróbico 0nd nd nd + nd nd 8,00
4nd nd nd ++ nd nd 8,00
21nd nd nd ++ nd nd 9,90
um Rejeitável baseado na avaliação de odores.
Muitas bactérias Gram-negativas isoladas de alimentos produzem AHLs (Tabela 7) , assim, todas,
exceto uma das
148 Enterobacteriaceae isoladas de salmão defumado a frio e carnes embaladas a vácuoproduziram
quantidades detectáveis de AHLs (Ravn et al., 2001) . As AHLs são produzidas por pseudomonas
envolvidas na deterioração de germinação (Gram e Melchiorsen, não publicadas) e cepas de P.
phosphoreum também produzem AHL (Ravn et al., Dados não publicados). Além disso, vários Erwinia
pectinolítico e Pseudomonas, que estragam vegetais prontos para consumo, como brotos de feijão,
produzem AHLs (Rasch et al., Em preparação) . Assim, a produção de AHL é um fenômeno generalizado
em bactérias que estragam os alimentos.
A produção de AHL pode ser determinada pelo isolamento aleatório / representativo de culturas puras e
pela subsequente determinação de AHLs em super-culturas utilizando os monitores mencionados acima. As
bactérias produtoras de AHL também podem ser isoladas diretamente por replicação a partir de placas
aeróbicas não seletivas para meios de ágar contendo cepas de monitor AHL (Fig. 5) .

4.3.2. Um papel potencial para os AHLs na deterioração de alimentos? A mera detecção de AHLs em
alimentos antes e
durante a deterioração e nas bactérias Gram-negativasque podem estar envolvidas na deterioração não

L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97 91


Fig. 3. Separação cromatográfica em camada delgada de AHLs extraídos de brotos de feijão (faixa 2), de culturas bacterianas puras isoladas
de brotos (faixas 3 e 4) e de brotos inoculados com bactérias produtoras de AHL (faixa 5). Padrões de N-3-oxo-hexanoil-homoserina-lactona
(OHHL), N-hexanoil- homoserina-lactona (HHL) e N-octanoil- homoserina-lactona (AHLs).

conclusão de que a produção de AHL desempenha um papel na deterioração. Para elucidar isso, vários
arranjos experimentais podem ser buscados. Através da construção de mutantes negativos no
sinal (Christensen et al., Apresentados para publicação) , os fenótipos regulados por AHLs podem ser
identificados. Além disso, comparando o comportamento e o impacto sensorial de cepas de tipo
selvagem produtoras de AHL com mutantes não produtores de AHL , as possíveis reações de deterioração
reguladas pela comunicação AHL podem ser elucidadas.
Testes de armazenamento com brotos de feijão demonstraram que a inoculação de brotos com E.
carotovora , produtora de AHL, resulta em uma deterioração mais rápida. Atualmente, estamos estudando
o papel potencial dos AHLs nessas reações (Rasch et al., Em preparação) . Prevê-se que a principal reacção
de deterioração seja a degradação da pectina por Erwinia spp. e como a atividade pectinolítica é regulada
por AHLs em E. carotovora (Pirhann et al., 1993; Andersson et al., 2000) , a hipótese parece justificada.
Como mencionado, Enterobacteriaceae isolado de vários peixes e produtos de carne produzem
AHLs (Ravn
et al., 2001) . Estes organismos podem contribuir para a deterioração. Leroi et al. (2001) usaram
uma análise de regressão múltipla por etapas dos dados de ensaios de armazenamento
com salmão defumado frio de diferentes origens e descobriram que o prazo de validade estava
principalmente ligado à contagem inicial de Enterobacteriaceae. Quanto maior a contagem inicial no ágar
de glicose violeta vermelho, menor a vida de prateleira. Com base na produção de aminas
biogênicas, Jørgensen et al. (2000b)identificaram P. phosphoreum ou L. curvatus ou uma mistura de
Enterobacteriaceae e bactérias do ácido lático como o SSO do salmão embalado a vácuo, fumado a
frio . Além disso, embalado a vácuocarnes, a detecção de AHL está correlacionada com o número de
Enterobacteriaceae sendo superior a 10 6 ufc / g (Tabela 6) . Actualmente, não se sabe se a capacidade
destas bactérias para produzir AHLs desempenha um papel importante na deterioração de carne e peixe.

A deterioração do leite pasteurizado é causada pelo crescimento de Bacillus onde os esporos


sobreviveram ao tratamento térmico (Ternstro¨m et al., 1993) ou pela atividade exo-enzimática das
espécies de Pseudomonas (re-) contaminando o leite após a pasteurização (Eneroth et al. al., 2000) . Tem
sido sugerido que o quorum sensing está envolvido na regulação das atividades hidroelíticas pelas
pseudômonas que estragam o leite (Whan et al., 2000), no entanto, até o momento (janeiro de 2002),
nenhum estudo foi conduzido sobre este tópico. Enterobacteriaceae que produzem AHLs também podem
ocorrer em leite pasteurizado ( Lindberg et al., 1998 ; Whitfield et al., 2000).). Devido ao envolvimento
comum de AHLs diretamente na regulação de enzimas hidrolíticas extracelulares (Eberl,
1999) ou diretamente através da regulação de sistemas de transporte (Riedel et al., 2001; Christensen et al.,
Submetido para publicação) , o hipótese merece investigação.

As AHLs foram prontamente extraídas tanto de produtos avícolas quanto de


produtos cárneos embalados a vácuo (Tabela 6) . A presença de AHLs em carnes embaladas a vácuo foi
correlacionada ao nível de Enterobacteriaceae. O envolvimento destes organismos na deterioração está bem
documentado (Borch et al., 1996) , em particular em associação com LAB (Tabela 3) . Ainda não se sabe
se as reações de deterioração destas Enterobacteriaceae são influenciadas por AHLs.

4.3.3. Outros aspectos de AHLs em alimentos


Como é evidente nas Tabelas 4 a 6 , muitos dos nossos alimentos contêm AHLs. O maior interesse
nestes compostos de sinalização deriva do seu papel nas bactérias-bactérias

92L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97

Fig. 4. Detecção in situ da produção de AHL em células bacterianas únicas na carne, avaliada pela expressão de Proteína Fluorescente Verde. O
OHHL produtor de H. alvei foi co-inoculado com um H. alvei negativo para OHHL (mutante I) portador de um sistema monitor de
AHL (promotor luxR, luxI fundido a gfp). Fluorescência verde foi detectada usando um microscópio confocal de varredura a laser (Christensen,
Ravn, Hentzer, dados não publicados).
interações. No entanto, recentemente foi demonstrado que os AHLs podem agir diretamente em organismos
eucarióticos e podem suprimir reações importantes para a resposta imune de células epiteliais (Telford et
al., 1998) . Se os AHLs puderem agir diretamente sobre as células gastro-epiteliais , essa ação pode ser um
componente ou mecanismo que facilita o ataque de patógenos de origem alimentar no tratogastrointestinal.
Até à data, pouco trabalho foi feito sobre a estabilidade e degradação de AHLs e, portanto, não se sabe o quão
estáveis estes compostos são nos alimentos e como os procedimentos de preparação de alimentos os afetam. Como
mostrado na Tabela 6 , os AHL detectados em carnes embaladas a vácuo podem desaparecer durante o armazenamento,
e Ravn et al. (em preparação ) descobriu que a degradação de AHLs de Enterobacteriaceae derivada de alimentos pode
ser facilitada pelos organismos produtores. Dois estudos recentes demonstram
que algumas bactérias são capazes de degradar as AHLs. Dong et al. (2000) demonstraram que uma enzima
de Bacillus spp. AHLs degradadas e Se´veno et al. (2001) sugeriram que uma cepa de Pseudomonas
aureofaciens degrada suas próprias moléculas sinalizadoras.
4.4. Perspectivas na preservação de alimentos

Devido ao envolvimento de AHLs na regulação de fatores de virulência em várias bactérias oportunistas humanas
e fitopatogênicas, uma intensa busca tem sido realizada nos últimos 6 anos para compostos que especificamente
poderiam bloquear a comunicação AHL. No cenário clínico, prevê-se que tais compostos possam bloquear a expressão
de virulência sem afetar o crescimento, eliminando assim o risco de desenvolvimento de resistência (Givskov et al.,
1996; Finch et al., 1998) . Tal quórum

L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97 93


Tabela 7
Produção de AHLs por bactérias Gram-negativas associadas a deterioração de alimentos (dados não publicados pelos
autores)

Grupo bacteriano / espécie Comida Produção


mercadoria de AHL (s)
Enterobacteriaceae peixe +
carne +
aves
domésticas +
brotos +
Pseudomonas peixe +
brotos +
Shewanella peixe ? uma
Fotobactéria peixe +
Aeromonas peixe +
aves
domésticas +
brotos +
uma Alguns isolados deu uma resposta fraca emAHL-monitor estirpes, o que indica a possibilidade de produção de AHLs,
mas isto não foi ainda investigado.

Os inibidores de detecção (QSI) são tipicamente análogos dos AHLs (Eberhard et al., 1986) , ou compostos
que degradam os AHLs (Dong et al., 2000). Um grupo promissor de QSI são as furanonas halogenadas
produzidas pelas algas vermelhas australianas, Delisea pulchra (Givskov et al., 1996) . Essas furanonas
interferem nas proteínas receptoras e liberam o sinal AHL (Manefield et al., 1999, 2002) . O tratamento
com estes compostos reduz a expressão de factores de virulência regulados por AHL e a formação de
biofilme em eg P. aeruginosa e S. liquefaciens (Hentzer et ai., 2002; Rasmussen et ai., 2000; Givskov et
ai., 1996) . QSIs como o D. pulchra
As furanonas também podem ser usadas como conservantes de alimentos em alimentos selecionados, nos quais as
características reguladas pela AHL contribuem para a deterioração do produto. A descoberta de compostos de QSI a
partir de fontes de algas (vegetais) levanta a possibilidade de identificação de compostos activos de QSI a partir de uma
multiplicidade de organismos marinhos, bem como de alimentos naturais ou subprodutos alimentares . Estudos
recentes mostraram que vários alimentos contêm compostos de furanona com similaridade aos compostos de D. pulchra
descritos acima (Slaughter, 1999) . Os compostos QSI podem influenciar a colonização de superfícies de carne, a
formação de toxinas e talvez a proliferação bacteriana. A ocorrência natural de IQS é uma consideração importante
para a avaliação de seu status toxicológico e pode facilitar seu uso em alimentos.

5. Observações conclusivas

Muitos alimentos estragam devido à degradação microbiana, com seus metabólitos sendo a causa dos aromas
anormais ou as mudanças na textura, resultando em rejeição sensorial. Apesar da ampla gama de matérias-primas, dos
diferentes parâmetros de processamento e da diversidade de condições de armazenamento, microfloras muito similares
se desenvolverão em produtos com características físicas e químicas similares. Apenas uma fração dos microrganismos
presentes na deterioração de produtos alimentícios causa as características de deterioração. Esses organismos são
conhecidos em alguns produtos, mas é necessário muito trabalho em uma variedade de produtos alimentícios para
identificar os organismos responsáveis pela deterioração. Sob algumas condições
Fig. 5. Colônias bacterianas produtoras de AHL visualizadas por replicação a partir de uma placa TSA de uma série de diluição
de carne embalada a vácuo em A. tumefaciens pZLR4 em um meio contendo X-Gal (esquerda) e em C. violaceum
em LB 5- médio (direita) (Bruhn et al., Em preparação) .

94L. Gram et al. / International Journal of Food Microbiology 78 (2002) 79–97


Além disso, o comportamento interativo das bactérias deteriorantes pode influenciar seu crescimento e
metabolismo. Alguns exemplos foram descritos, mas é provável que o comportamento interativo
(metabiose e antagonismo) seja importante em qualquer alimento em que uma flora mista se desenvolva
durante o armazenamento. A detecção de sinais químicos, lactonas de homoserina aciladas, envolvidos na
regulação do quorum de detecção de bactérias, em alimentos e bactérias que estragam os alimentos é de
interesse significativo. Análises da possível importância dos compostos AHL em reações de deterioração,
e o potencial desenvolvimento de novas técnicas de preservação baseadas em inibidores de quorum sensing,
merecem estudos adicionais.

Agradecimentos

Os autores e os estudos sobre o envolvimento dos AHLs na deterioração da qualidade dos alimentos
foram apoiados por bolsas de pesquisa do Conselho Dinamarquês de Pesquisa para as Ciências Técnicas
[no. 9700726 e 26000134] e pela Academia de Pesquisa dinamarquesa [bolsa de doutorado para
LR]. Agradecemos a Morten Hentzer pela assistência na microscopia confocal de varredura a
laser. Estendemos nossos agradecimentos a Claus Reesbøll e ao bibliotecário Søren Tørper Christensen,
que nos ajudaram a obter referências adicionais durante a revisão - para a qual recebemos apenas duas
semanas.

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