UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA
Y PARASITOLOGÍA

TESIS

Concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de Minthostachys

mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y
Staphylococcus aureus

Autoras: - SUSANA FIORELLA MANTILLA GERMAN

- EVELYN KARYN YUPANQUI ROJAS

Asesor: Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez

Co-asesor: MsC. Edgar David Zavaleta Verde

TRUJILLO - PERÚ

2018
 RESUMEN

El control del crecimiento microbiano es un factor importante en la conservación de

alimentos, para lo cual comúnmente se usan productos químicos; sin embargo estos están
siendo sustituidos por sustancias naturales como los aceites esenciales. La presente
investigación tuvo como objetivo determinar la concentración mínima inhibitoria del
aceite esencial de Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria
monocytogenes y Staphylococcus aureus. Para ello se extrajo el aceite esencial de toda
la planta de muña mediante la técnica de destilación por arrastre de vapor, y se preparó
una solución stock. Se realizó la curva de crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus,
determinando que el tiempo de generación fue de 55 y 42 minutos respectivamente; y la
fase logarítmica media 7 y 8 horas respectivamente. Se preparó el inóculo de cada
bacteria, en su fase logarítmica media y con la solución stock se realizó la determinación
de la concentración mínima inhibitoria, utilizando pocillos de microcultivo con
concentraciones finales de 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5 y 2.5 µg/mL del aceite esencial.
Los sistemas se incubaron a 37°C por 24 horas, todo se realizó por triplicado. El resultado
de la concentración mínima inhibitoria de Minthostachys mollis “muña” sobre el
crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus fue de 40 µg/mL y 80 µg/mL
respectivamente.

Palabras claves: Concentración mínima inhibitoria. Aceite esencial. Minthostachys

mollis “muña”. L. monocytogenes. S. aureus.

2
 ABSTRACT

The control of microbial growth is an important factor in food preservation, for which
chemicals are commonly used; however, these are being replaced by natural substances
such as essential oils. The objective of the present investigation was to determine the
minimum inhibitory concentration of the essential oil of Minthostachys mollis "muña" on
the growth of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. To do this, the
essential oil was extracted from the entire muña plant using the steam distillation
technique, and a stock solution was prepared. The growth curve of L. monocytogenes and
S. aureus was determined, determining that the generation time was 55 and 42 minutes
respectively; and the logarithmic phase averages 11 and 8 hours respectively. The
inoculum of each bacterium was prepared, in its average logarithmic phase and with the
stock solution the determination of the minimum inhibitory concentration was made,
using microculture wells with final concentrations of 320; 160; 80; 40; twenty; 10; 5 and
2.5 μg/mL of the essential oil. The systems were incubated at 37°C for 24 hours,
everything was done in triplicate. The result of the minimum inhibitory concentration of
Minthostachys mollis "muña" on the growth of L. monocytogenes and S. aureus was 40
μg/mL and 80 μg/mL respectively.

Key words: Minimum inhibitory concentration. Essential oil. Minthostachys mollis

"muña". L. monocytogenes. S. aureus.

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 I. INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Listeria comprenden un grupo de bacterias Gram positivas,
anaerobios facultativos, bacilos no esporulados que están ampliamente distribuidos en el
medio ambiente (Hain y col., 2007). Debido a su naturaleza ubicua, estas bacterias pueden
persistir en las instalaciones de procesamiento de alimentos y, por lo tanto, pueden
contaminar los productos alimenticios (Carpentier y Cerf, 2011).
De las siete especies reconocidas de Listeria (L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayii y L. murrayi),
solo L. monocytogenes y L. ivanovii actualmente se consideran como patógenos e
infecciosos, provocando enfermedades en animales y seres humanos, ya que son
conocidos por ser β-hemolíticos (Brugere-Picoux, 2008; Schuchat y col., 1991).

Listeria monocytogenes se diferencia de la mayoría de los patógenos bacterianos

encontrados en alimentos debido a su capacidad para sobrevivir con condiciones
ambientales duras, creciendo sobre un amplio rango de temperaturas (1 a 45 °C), amplio
rango de pH (4.5 a 9.6), alta concentración de sal (10 a 15 % de NaCl), y actividad de
agua muy baja (0.94). Por lo tanto, puede crecer en diferentes tipos de productos
alimenticios (Farber y Peterkin, 1991).
Desde una perspectiva de salud pública, L. monocytogenes (principalmente los serotipos
1 / 2a, 1 / 2b, 4b) son los responsables de los síndromes severos en los seres humanos,
tales como la meningitis, la septicemia, el aborto y la enteritis febril. Su principal impacto
se da en los individuos inmunocomprometidos, con una alta tasa de mortalidad (20% a
30%) (Swaminathan y Gerner-Smidt, 2007).

L. monocytogenes puede sobrevivir en el entorno gástrico, colonizar el intestino y cruzar

la barrera intestinal, la hemato-encefálica y la materno-fetal. Ha desarrollado mecanismos
avanzados que le permiten invadir y sobrevivir en una amplia variedad de células, incluso
en las que normalmente no son fagocíticas, como células epiteliales y endoteliales y
hepatocitos (Portnoy, 2007; Cossart y Toledo-Arana, 2007). Entre los factores de
virulencia de esta bacteria se encuentran: las proteínas de superficie internalinas (InA,
InB) que favorecen la invasión celular por un mecanismo tipo zipper, en el que la bacteria
se hunde progresivamente en la superficie celular; la listeriolisina O y fosfolipasas que
permiten lisar y escapar de las vacuolas fagocitarias una vez internalizada en la célula; la
proteína polimerizadora de actina, ActA, necesaria para la motilidad en el citoplasma

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celular e intercelular; y transportadores de hexosa fosfato que le permiten utilizar azúcares
en el citosol celular durante su replicación intracitoplasmática (Wallecha y col., 2009).

El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro entre
0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas (Kloss y col., 1992). Ogston introdujo el nombre de
Staphylococcus, del griego staphyle que significa racimo de uvas, para describir a los
cocos responsables de inflamación y supuración. Son bacterias no móviles, no
esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula
de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría de los estafilococos producen β-
hemólisis o hemólisis total y catalasa; característica que se utiliza para diferenciar el
género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa
negativos (Kloss y col., 1992; Kuroda y col., 2001).

S. aureus se diferencia de las demás especies por producir coagulasa que se manifiesta
por su capacidad para coagular el plasma, es resistente al calor, a la desecación y puede
crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7.5%). S. aureus crece bien en medios
de cultivos no selectivos, como el agar sangre, agar chocolate, agar cerebro corazón (agar
BHI) y medios selectivos como el agar manitol salado o medio de Chapman por su
elevado contenido de sal que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
negativas. Este medio permite realizar la identificación presuntiva de S. aureus por la
pigmentación amarilla, característica de esta bacteria, debido a que fermenta el manitol
se genera un cambio de color en el medio que vira de rojo pálido a amarillo (Compernolle
y col., 2007; Marcos Vivoni y Meurer, 2005).

Estudios demuestran que el género Staphylococcus contiene 32 especies, de las cuales 16

de ellas se localizan en los humanos, algunas forman parte de la microbiota de piel y
mucosas, y otras se encuentran entre la flora de otros mamíferos y aves. Entre las especies
que colonizan al humano, las de mayor importancia clínica son: S. aureus y S.
lugdunensis; en tanto que en animales se encuentra además de S. aureus a S. intermedius
(Kloss y col., 1992; Kloss y Bamerman, 1995). El S. epidermidis y el S. saprophyticus
son comúnmente responsables de infecciones relacionadas con dispositivos e infecciones
del tracto urinario, siendo éstos menos infecciosos que S. aureus (Lowy, 1998; Moreillon
y col., 2005).

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S. aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en diversas partes del
organismo humano, sino porque es una de las principales bacterias implicadas en
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales enfermedades son causadas por
diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas, siendo esto
relativamente común en determinados sectores de la población y en algunas regiones
geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud. Las infecciones causadas por
la ingesta de alimentos contaminados con toxinas que se encuentran presentes en el aire,
la leche, el agua potable, la aguas residuales y, desde luego, la comida o en el equipo
donde los alimentos han sido elaborados (Tibavizco y col., 2007).

S. aureus tiene en su superficie proteínas conocidas por inhibir la fagocitosis y la

opsonización por el sistema del complemento en el ser humano. El reconocimiento del
complemento y las inmunoglobulinas por los receptores son bloqueados por la proteína
A de la pared celular que se une a la porción Fc de la inmunoglobulina IgG. Esta bacteria
produce moléculas que pueden inhibir el reclutamiento de neutrófilos, la fagocitosis y el
reconocimiento de la bacteria, a pesar de que emplea un número significativo de factores
de evasión. Durante el desarrollo de las infecciones por S. aureus, los neutrófilos
participan reclutando leucocitos en el sitio de la infección, así como el complemento que
tiene un papel central en nuestro sistema inmune innato, involucrado en la quimiotaxis,
opsonización y destrucción de la membrana celular de los patógenos (Foster, 2005;
Voyich y col., 2005).

Las infecciones causadas por S. aureus pueden resumirse de la siguiente manera:

frecuentemente neonatos, niños y adultos que pueden ser colonizados por esta bacteria y
portar el microorganismo generalmente en fosas nasales y, en ocasiones, en la piel y la
ropa (Moroney y col., 2007). Durante varias décadas se han reportado un gran número de
brotes epidémicos a nivel mundial, sobre todo en los hospitales, centros de atención,
clínicas y recientemente ha surgido en la comunidad. Actualmente, estos brotes se dividen
como infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad. Un aspecto
importante en salud pública son las infecciones por S. aureus que han reemergido debido
a que la bacteria se ha tornado resistente a diversos antibióticos con los que normalmente
se les trata. (Creench y col., 2005).

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El hombre a través del tiempo ha encontrado en los recursos naturales la solución a
diferentes problemáticas, empleando las plantas a nivel alimenticio, industrial y
medicinal, convirtiéndose de esta manera, en materias primas de vital importancia para el
avance de la humanidad (Ben-Hsouna y col., 2013).
El valor medicinal de las plantas curativas, se debe a la presencia de una sustancia química
(principio activo) que produce un efecto fisiológico. Mucho de los principios activos son
sumamente complejos, desconociéndose aún su naturaleza química; otros han sido
purificados, sintetizados o imitados. Por lo general pertenecen a una de estas categorías:
aceites esenciales, alcaloides, glúcidos, taninos, sapogeninas, fenoles, quinonas, terpenos,
carotenoides, cumarinas, flavonoides y resinas (Thompson, 1981).

Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles generalmente destilables por
arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las
plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de
alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéuticas (saborizantes) (Reichling y col.,
2009). Los aceites esenciales lo constituyen una diversa familia de compuestos orgánicos
de bajo peso molecular con grandes diferencias en la actividad antimicrobiana. Los
componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su
estructura química: terpenos, terpenoides, fenilpropenos, y fenilpropanoides (Berka-
Zougali y col., 2012).

Los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales contienen principios activos

que exhiben bioactividades como: antioxidante, antifúngica, antimicrobiana, entre otras
(Matiz y col., 2012). Los aceites esenciales y sus principales constituyentes inhiben a los
microorganismos por una variedad de mecanismos tales como: destrucción de la
membrana citoplasmática, fuga de constituyentes intracelulares tales como metabolitos
e iones, coagulación de contenido celular, inhibición de la síntesis de proteínas, enzimas
asociadas con la síntesis de la pared celular, síntesis DNA/RNA, destrucción de la
integridad osmótica de la membrana celular (Kuorwel-Kuorwel y col., 2011).

La biodiversidad vegetal ofrece alternativas antibacterianas; algunas especies con

excelentes resultados, debido a sus constituyentes químicos. Entre las cuales tenemos a
Minthostachys mollis, nombre científico de la muña, planta nativa que crece en diversas
zonas de la serranía peruana, la cual es usada para el tratamiento de dolencias de vías

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respiratorias y digestivas. La muña habita en los diferentes pisos ecológicos de nuestra
serranía, crece entre 2500 y 3500 m.s.n.m, donde existe en abundancia (Salaverry, 2005;
Roersch, 1999; Rojas y col., 2003). El clima más apropiado es aquel con abundante
lluvias y elevada luminosidad (Salaverry, 2005).

Minthostachys mollis es una planta de 0.9 a 1.5 m de altura, frondosa en la parte superior,
de aspecto bien tupido en hojas, las mismas que son opuestas y aserradas presentando
pelos en los peciolos y en la cara inferior de las hojas, en las cuales se deposita la mayor
cantidad de aceite esencial. El tallo es ramificado desde la base, que también presenta
pelos, tiene forma prismático cuadrilátero y propenso a la lignificación. Las flores se
encuentran en la parte superior de las ramas reunidas en verticilos. Las flores son
pequeñas y blancas; irregulares o zigomorfas. Se encuentran reunidas en seudo verticilos
axilares, formados por cuatro pequeñas cimas, brevemente pedunculadas, dos en cada
axila y situadas en la parte superior de las ramas (Salaverry, 2005).

La muña, según el sistema de Engler & Prantil, modificado por Melchor en 1964, recibe
la siguiente clasificación (Dabbah y col., 1970):
REINO: Vegetal
DIVISIÓN: Angiospermae
CLASE: Dicotyledoneae
SUB CLASE: Simpetaleae
ORDEN: Tubiflorales
FAMILIA: Lamiaceae
GÉNERO: Minthostachys
ESPECIE: Minthostachys mollis (Kunt/Griseb)
NOMBRE COMUN: “MUÑA”

La composición de la muña es: aceite esencial, glicósidos, mucílagos, saponinas, taninos,

alcaloides, esteroles, éteres y terpenos en mayor porcentaje. Además contiene
carbohidratos, calcio, fósforo, fierro, trazas de vitamina B1, esencias, mentol y mentona
(Alaba y Jiménez, 2014).
Gibaja (1960) realizó la desterpenación del aceite esencial de Minthontanchy mollis
(muña) determinando el 10.20% para la parte desterpenada (compuestos oxigenados) y

8
89.80 % para la fracción terpénica. Cano (2007) determinó la presencia de carvacril
acetato, carvacrol, pulegona y mentona.

Inga y Guerra (2000) demostraron mediante un estudio las propiedades bactericidas /

bacteriostáticas del aceite esencial de Minthostachys mollis frente a Staphylococus aureus
ATCC 25923, B. cereus MC, Salmonella typhi, S. sonnei MC, Escherichia coli
ATCC.25922 y K. pneumoniae ATCC 10031. Además de la acción fungistático /
funguicida para Fusarium moniliforme y Aspergillus Níger.
Primo y col. (2001) estudiaron a Minthostachys verticillata “peperina”, observaron buena
actividad contra Staphylococcus aureus, B. cereus, E. coli, P. mirabillis y antiviral contra
el virus Herpes Simplex tipo 1 y el virus de la Pseudorrabia, aunque con escasa actividad
contra P. aeruginosa (Primo y col., 2001).

Díaz K. y col. (2005), obtuvieron el aceite esencial de muña mediante la técnica arrastre
de vapor de agua y fue sometida a cromatografía de gases y se determinó sus principales
componentes pulegona y transmenton. Concluyó que el aceite esencial de muña presenta
actividad antibacteriana en Streptococcus mutans, Lactobacillus sp., Fusobacterium
nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans y Actinomyces sp. frente a
Amoxicilina como control positivo y agua destilada como control negativo. En las
pruebas de susceptibilidad concluyó que la bacteria más sensible al aceite esencial de
muña era Fusobacterium nucleatum seguido de Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Streptococcus mutans, Lactobacillus sp. y Actinomyces sp. con una media de halos de
inhibición 20.13 mm, 18.42 mm, 16.50 mm, 14.38 mm, 11 mm respectivamente. La
propiedad antimicrobiana se debería a las sustancias terpenoides presentes en el aceite
esencial del Minthostachys mollis (Díaz, 2005).

Paredes N. y col (2009), determinaron la efectividad antibacteriana salival mixta de las

infusiones a base de té verde, y té verde y muña, no encontró efectividad en la infusión a
base de muña, y que existían diferencias significativas entre las medias de las muestras.
Así mismo, la infusión a base de té verde resultó ser similar en cuanto a su efectividad
antibacteriana con respecto a la Clorhexidina. De los resultados obtenidos se concluye
que se ha evidenciado la efectividad antibacteriana de una infusión a base de té verde y
muña sobre la flora salival mixta, sin embargo, se observó una efectividad antibacteriana
menor con respecto a la infusión a base de té verde y la Clorhexidina (Paredes, 2009).

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La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente
mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. La Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL)
que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de
incubación a 37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros
métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias
inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es
indeterminado (Andrews, 2001).

Sabiendo que los alimentos son vehículos de transmisión de microorganismos patógenos,

ya que son manipulados y trabajados en condiciones inadecuadas de higiene, los cuales
al ser consumidos genera una serie de consecuencias que son perjudiciales para la salud
del ser humano. Conociendo también que en la desinfección de alimentos se utilizan
agentes químicos comunes que por sus características pueden alterar directa o
indirectamente el alimento, causando daños en la producción del alimento y en la salud
del consumidor. Es por ello que se busca una alternativa diferente como el empleo de
plantas medicinales para el control de calidad e inocuidad en la fabricación de alimentos.
Además se han encontrado estudios ya realizados con Minthostachys mollis “muña”, que
inhibe a otros géneros bacterianos, es por ello que se espera saber cuál es la concentración
mínima del aceite esencial de M. mollis que inhibe el crecimiento de L. monocytogenes y
S. aureus.

Este trabajo forma parte del programa sobre acción bacteriana de plantas medicinales que
está ejecutando el laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana en el Departamento de
Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.

OBJETIVO GENERAL

• Determinar la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de

Minthostachys mollis “muña” sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes y
Staphylococcus aureus.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar la fase logarítmica media y el tiempo de generación de L.

monocytogenes ATCC® 19115™ y S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.

 Conocer la concentración mínima de Minthostachys mollis “muña” que inhibe el

crecimiento de L. monocytogenes ATCC® 19115™, mediante la técnica de
dilución en caldo en pocillos de microcultivo.

 Conocer la concentración mínima de Minthostachys mollis “muña” que inhibe el

crecimiento de S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™, mediante la técnica de
dilución en caldo en pocillos de microcultivo.

11
 II. MATERIALES Y MÉTODOS

1. MATERIAL BIOLÓGICO

 Cepa de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.

 Cepa de Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.
 Minthostachys mollis “muña”

2. PROCEDIMIENTO

2.1 Procesamiento de Minthostachys mollis “muña”

La planta Minthostachys mollis “muña”, se obtuvo en el Mercado “La
Hermelinda”, distrito de Trujillo, provincia de Trujillo, departamento
de La Libertad.

2.1.1. Identificación Taxonómica de Minthostachys mollis “muña”

La planta obtenida en el Mercado “La Hermelinda”, fue identificada en

el Herbario Antenor Orrego (HAO) de la Universidad Privada Antenor
Orrego (Anexo 01 y 02).

2.1.2. Obtención del aceite esencial de Minthostachys mollis “muña”

El aceite esencial se obtuvo a partir de toda la planta de M. mollis “muña”
por el método de destilación por arrastre de vapor (Berka-Zougali y col.,
2012), para ello se usó 2 Kg de la planta (Anexo 03).

2.1.3. Preparación de solución Stock del aceite esencial

El aceite esencial de M. mollis “muña” se disolvió inicialmente en una
mezcla solubilizante (Tween 80) a una concentración de 40 mg/mL.
Después, se tomó una alícuota de 1 mL de esta solución y se diluyó en 9
mL de Caldo de Enriquecimiento BHI (Anexo 04).

12
2.2. Reactivación de las cepas Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ y
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™

2.2.1. Reactivación de la cepa Listeria monocytogenes ATCC® 19115™

L. monocytogenes ATCC® 19115™ en presentación KWIK STIK
contenía un microorganismo liofilizado, con una ampolla de fluido de
rehidratación en la parte superior y una torunda para su adecuada
inoculación (Anexo 5).
Con un hisopo estéril embebido con el microorganismo liofilizado se
reactivó en caldo BHI y se incubó a 37°C durante 24 horas; pasado el
tiempo de incubación se extrajo una alícuota del medio y se sembró en
agar BHI por la técnica de siembra en estrías por agotamiento, luego fue
incubado a 37°C durante 24 horas, con la finalidad de obtener colonias
aisladas.

2.2.2. Reactivación de la cepa Staphylococcus aureus subsp. aureus

ATCC® 12600™

Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ en presentación

KWIK STIK contenía un microorganismo liofilizado, con una ampolla
de fluido de rehidratación en la parte superior y una torunda para su
adecuada inoculación (Anexo 9).
Se sembró en el medio Agar manitol salado utilizando la técnica de
siembra en estrías por agotamiento y se incubó a 37°C durante 24 horas.

2.3. Obtención de la curva de crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus

2.3.1. Curva de crecimiento de Listeria monocytogenes

Se sembró 1 mL de suspensión de L. monocytogenes equivalente al tubo

N° 0.5 del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL) en 99 mL de
caldo de enriquecimiento BHI a 37 °C durante 12 horas en agitación
constante y se determinó la concentración de la población microbiana
cada 2 horas por el método de recuento en placa. Con estos recuentos se

13
 obtuvo la curva de crecimiento, la fase logarítmica media y por
consiguiente el tiempo de generación.

2.3.2. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus

Se sembró 1 mL de suspensión de S. aureus equivalente al tubo N° 0.5

del Nefelómetro MacFarland (1.5x108 UFC/mL) en 99 mL de caldo
nutritivo a 37 °C durante 12 horas en agitación constante y se determinó
la concentración de la población microbiana cada 2 horas por el método
de recuento en placa. Con estos recuentos se obtuvo la curva de
crecimiento, la fase logarítmica media y por consiguiente el tiempo de
generación.

2.4. Preparación de inóculos

2.4.1. Preparación de inóculo de L. monocytogenes

Se sembró L. monocytogenes en una placa conteniendo Agar BHI y se
incubó a 37 °C por 7 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica
media. Se preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo
N° 0.5 del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL).

2.4.2. Preparación de inóculo de S. aureus

Se sembró S. aureus en una placa conteniendo Agar nutritivo y se incubo

a 37 °C por 8 horas obteniendo un cultivo en fase logarítmica media. Se
preparó una suspensión bacteriana de 1 mL equivalente al tubo N° 0.5
del Nefelómetro de MacFarland (1.5x108 UFC/mL).

2.5. Determinación de la concentración mínima inhibitoria

Se realizó por la técnica de dilución en caldo en pocillos de microcultivo

(Negroni, 1991; Brooks y col., 1996) de 2 mL de volumen. Se adicionó 800 µL
de Caldo de Enriquecimiento BHI en 8 pocillos y para el primer pocillo se

14
 adicionó 800 µL de solución Stock del aceite esencial de M. mollis. Del primer
pocillo se tomó 800 µL y se realizó diluciones hasta el octavo pocillo para
obtener las concentraciones 400; 200; 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125 µg/mL.
Luego se completó el mililitro con 200 µL de inóculo (3x105 células) para tener
las concentraciones finales de: 320, 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5 µg/mL. Se
adicionó en un noveno pocillo 800 µL de Tween 80 que sirvió de control del
medio (Cueva-Yesquen, 2016).

Se incubó los 9 sistemas a 37 °C por 24 horas y se verificó el crecimiento con la

aparición de turbidez (Anexo 14 y 15).

3. PROCESAMIENTO DE DATOS

3.1. Determinación de la CMI

Al realizar la lectura, se observó el crecimiento o inhibición del

microorganismo en todos los pocillos, adecuados a diferentes concentraciones
del aceite esencial, y en donde no hubo crecimiento visible correspondió a la
CMI.
Los resultados se validaron realizando tres repeticiones.

15
 III. RESULTADOS

A partir de la planta muña, se obtuvo el aceite esencial, con el cual se determinó la

concentración mínima inhibitoria sobre el crecimiento de L. monocytogenes
ATCC® 19115™ y S.aureus subsp. aureus ATCC® 12600™, así como también se
determinó la fase logarítmica media y el tiempo de generación, los cuales se utilizaron
para la CMI en el sistema de pocillos.

En la Figura 01 se observan dos líneas: la azul es la curva de crecimiento y la roja es

la curva corregida, con esto se determinó la fase logarítmica media de Listeria
monocytogenes ATCC® 19115™ que fue de 7 horas, la tasa de crecimiento (u=m) que
fue de 0.752 (presente en la ecuación de la recta).

En la Figura 02 se observan dos líneas: la azul es la curva de crecimiento y la amarilla

es la curva corregida, con esto se determinó la fase logarítmica media de
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ que fue de 8 horas, la tasa de
crecimiento (u=m) que fue de 0.9792 (presente en la ecuación de la recta).

En la Tabla 01 se muestra el tiempo de generación para Listeria monocytogenes

ATCC® 19115™ y Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ fue de 55
y 42 minutos respectivamente.

En la Tabla 02 se muestra que la concentración mínima inhibitoria del aceite esencial

de Minthostachys mollis sobre el crecimiento de Listeria monocytogenes fue de 40
µg/mL y sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus fue de 80 µg/mL.

16
 1,00E+11

1,00E+10

1,00E+09 Fase logarítmica

UFC/ mL

Fase logarïtmica
1,00E+08 corregida

1,00E+07

y = 0,752x +15771
1,00E+06
0 2 4 6 8 10 12
Horas

Figura 01. Fase logarítmica de la curva de crecimiento de Listeria monocytogenes

ATCC® 19115™.

17
 1,00E+13

1,00E+12

1,00E+11
Fase logarítmica
UFC/ mL

Fase logarítmica
1,00E+10 corregida

1,00E+09

y = 0,9792x + 18,457
1,00E+08
0 2 4 6 8 10 12
Horas

Figura 02. Fase logarítmica de la curva de crecimiento de Staphylococcus aureus

subsp. aureus ATCC® 12600™.

18
Tabla 01. Tiempo de generación de L. monocytogenes ATCC® 19115™ y S. aureus subsp.
aureus ATCC® 12600™.

L. monocytogenes S. aureus subsp. aureus

ATCC® 19115™ ATCC® 12600™
55 minutos 42 minutos

Tabla 02. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Minthostachys
mollis sobre el crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus.

Bacterias CMI
L. monocytogenes ATCC® 19115™ 40 µg/mL
S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ 80 µg/mL

19
 IV. DISCUSIÓN

El efecto antimicrobiano de los aceites esenciales se determina evaluando mediante la

concentración mínima inhibitoria (CMI), que se define como la concentración en la que
se evita el crecimiento visible de bacterias bajo las condiciones de crecimiento definidas.
Las técnicas más comúnmente utilizadas son: la dilución en agar y dilución en caldo. La
técnica de dilución en caldo utiliza un medio líquido que contiene concentraciones
crecientes geométricamente (típicamente una serie de diluciones dobles) del agente
antimicrobiano, que es inoculado con un numero definido de células bacterianas
(Wiegand y col., 2008). Además la técnica de dilución en agar o difusión en disco puede
reducir la eficiencia del aceite esencial por la precipitación de este en los pocillos o en los
discos (Sánchez y Kouznetsov, 2010).

La demanda del consumidor por alimentos naturales, con ausencia o reducida cantidad de
productos químicos ha ido incrementando notoriamente, lo que hace indispensable la
búsqueda de compuestos alternativos y nuevas tecnologías no contaminantes. El control
del crecimiento microbiano es uno de los factores más importantes a considerar en la
conservación de alimentos, por lo que la sustitución de los productos antimicrobianos
químicos por sustancias naturales, como los aceites esenciales, que no alteran las
características sensoriales ni nutricionales de los alimentos ha sido revisada por diversos
autores desde hace varios años (Velázquez, 2010).

Los aceites esenciales son compuestos extraídos de varios tipos de plantas y usados para
preservar alimentos y bebidas, tienen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de
microorganismos (Azaña, 2010). Los componentes activos de los aceites esenciales
pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos, terpenoides,
fenilpropenos, y fenilpropanoides (Berka-Zougali y col., 2012). Los terpenoides pueden
servir como un ejemplo de agentes liposolubles, los cuales afectan la actividad de las
enzimas catalizadoras a nivel de membrana, por ejemplo: ciertos componentes del AE
pueden actuar como desacopladores, los cuales interfieren en la translocación de protones
sobre la membrana y subsecuentemente interrumpir por la fosforilación del ADP (Cano
y col., 2008).

Estudios in vitro han mostrado que los aceites esenciales inhiben el crecimiento
bacteriano pero varían en su eficacia debido a que los componentes químicos que actúan

20
como agentes antimicrobianos varían en tipo y concentración (Hyldgaard y col., 2012).
La actividad antimicrobiana de los diferentes aceites esenciales es muy difícil de
comparar teniendo en cuenta la variación de la composición del aceite esencial
(compuestos orgánicos de bajo peso molecular) entre especies de plantas, diferencias en
el origen geográfico, estación del año, métodos de extracción y parte de la planta que es
usada (Kuorwell-Kuorwell y col., 2011).

En recientes estudios se ha demostrado la actividad antibacteriana de diversos aceites

esenciales, los cuales pueden contener más de 150 componentes (Brack y Heinz, 2002).
El análisis del aceite esencial de M. mollis recogidos de Mollis Tuñame Paramo, estado
Trujillo, Venezuela mediante la técnica de cromatografía de gases mostrando la presencia
de trece compuestos, siendo pulegona (55.2%) y mentona (36%) los componentes
principales además de linalol (0.5%), minomeno(0.1%), isopulegona (1.5%), piperitona
(1.5%), piperitenone (1.7%), entre otros (Mora y col., 2009), y en una menor proporción
se encuentra el carvacrol así como en varias hierbas conocidos como el orégano
(Origanum vulgare), la ajedrea de verano (Satureja hortensis) o tomillo (Thymus
serpyllum) (Baca, 2014).

Los aceites esenciales que tienen mayor capacidad inhibitoria presentan como mayores
componentes del mismo, compuestos tales como el timol, el carvacrol, el linalol, el
aldehído cinámico, la alicina y el eugenol (Winward y col., 2008; Delaquis y col.; 2002;
Benkeblia, 2004); dichos aceites por su acción lipofílica tienen la capacidad de pasar las
membranas celulares, romper polisacáridos, ácidos grasos y lípidos, permeabilizando la
membrana celular; conduciendo a la pérdida de iones, al colapso de la bomba de protones
y a la disminución del ATP lo cual conduce a la muerte celular; a nivel citoplasmático
puede actuar sobre lípidos y proteínas coagulando dichas moléculas (Bakkali y col.,2008).

Con respecto a la composición química del aceite esencial de Minthostachys mollis

(muña) existen pocos trabajos de investigación por lo que se tiene poca información; el
aceite esencial de Minthostachys mollis (muña), al igual que otros aceites esenciales,
presenta una estructura aldehídica, cetónica, alcohólica (mentol y mentona), ésteres,
éteres y terpenos en mayor porcentaje (Azaña, 2010). Además se determinó la presencia
de carvacril acetato, carvacrol, pulegona y mentona (Cano, 2007).
Entre los compuestos fitoquímicos responsables de la actividad antibacteriana destacan
los derivados fenólicos timol y carvacrol (Domingo y López-Brea, 2010), los cuales

21
pueden penetrar la membrana del citoplasma, causando una desestabilización de esta;
igualmente podría actuar como intercambiador de protones, reduciendo el gradiente de
pH a lo largo de la membrana (Xu y col., 2008), y con algo menos de actividad se
presentan los derivados alcohólicos y cetónicos (Domingo y López-Brea, 2010).

Investigaciones recientes reportan que el carvacrol aumenta la fluidez de la membrana y

causa fuga de protones e iones de potasio lo que resulta en un colapso del potencial de
membrana y la inhibición de la síntesis de ATP; del mismo modo refieren que el mentol
tiene un efecto “antiplasmid” (secuencia extracromosómica de ADN que no puede ser
compartida entre los patógenos) lo que hace interrumpir la eficiencia de la célula (Fisher
y Phillips, 2008).
La actividad antibacteriana del timol y otros monoterpenos está relacionada a daños
estructurales y funcionales que provocan en la fracción lipídica de la membrana
plasmática; estos interactúan con proteínas de membranas y dianas intracelulares, inducen
alteraciones en la permeabilidad de la membrana, despolarización y liberación de material
intracelular de las bacterias (Hyldgaard y col., 2012).

Cabe resaltar que los aceites esenciales mostraron un mayor efecto inhibitorio frente a
cepas Gram-negativas. Este comportamiento particular frente a un grupo de cepas,
probablemente se debe a que la pared celular de las bacterias Gram-positivas estudiadas
está compuesta básicamente por peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared,
ácidos teicoicos que también suelen estar presentes en pequeñas cantidades y
polisacáridos; mientras que la pared celular de las Gram-negativas está constituida solo
por el 10% del peptidoglicano, además posee tres polímeros que se encuentran fuera de
su envoltura: lipoproteína, membrana externa y lipopolisacáridos, este último con un
contenido de lípido A que pudiera favorecer la entrada, por disolución de los aceites
esenciales debido a su carácter hidrofóbico y provocar la muerte celular por
desestabilización de la membrana externa y la membrana plasmática. Este lípido A no
está presente en las bacterias Gram-positivas y esta sería una causa probable del efecto
del aceite en los diferentes grupos bacterianos, donde las bacterias Gram-negativas son
relativamente más sensibles (Guerra y col., 2014).

En esta investigación se expuso a L .monocytogenes y S. aureus a las mismas condiciones

y concentraciones del aceite esencial de Minthostachys Mollis (Muña), por lo cual se

22
asume que la actividad antimicrobiana de éste depende principalmente de tres
características: su carácter hidrófilo o hidrófobo, sus componentes químicos y el tipo de
microorganismo que debe atacar (Fisher y Phillips, 2008; Solórzano Santos y Miranda-
Novales, 2011). Es por ello que se concluye que la concentración mínima inhibitoria de
L. monocytogenes es 40 µg/ml y S. aureus es 80 µg/ml.

23
 V. CONCLUSIÓN

 El tiempo de generación de Listeria monocytogenes fue de 55 minutos y su fase

logarítmica media fue de 7 horas.

 El tiempo de generación de Staphylococcus aureus fue de 42 minutos y su fase

logarítmica media fue de 8 horas.

 La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial para L. monocytogenes

fue de 40 µg/mL, mientras que para S. aureus fue de 80 µg/mL.

24
 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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31
ANEXOS

32
ANEXO 01. Ficha de identificación taxonómica de Minthostachys mollis “muña”

33
ANEXO 02. Constancia de identificación de la especie de la planta de
Minthostachys mollis “muña”

34
ANEXO 03. Equipo de destilación por el método de arrastre de vapor

35
ANEXO 04. Soluciones de trabajo para realizar la concentración mínima inhibitoria.

36
ANEXO 05. Presentación KWIK-STIK de Listeria monocytogenes
ATCC® 19115™

37
ANEXO 06. Certificado de Identificación de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™

38
ANEXO 07. Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Listeria monocytogenes
ATCC® 19115™ en Agar BHI

39
ANEXO 08. Observación microscópica de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.
Aumento 1000 X. Coloración Gram

40
ANEXO 09. Presentación KWIK-STIK de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™

41
ANEXO 10. Certificado de Identificación de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™

42
ANEXO 11. Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Staphylococcus aureus
subsp. aureus ATCC® 12600™ en Agar Manitol Salado

43
ANEXO 12. Observación microscópica de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™. Aumento 1000 X. Coloración Gram

44
ANEXO 13. Biorreactor utilizado para determinar la curva de crecimiento de L.
monocytogenes y Staphylococcus aureus

45
ANEXO 14. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de
Minthostachys mollis “muña”, para evaluar CMI frente a Listeria
monocytogenes ATCC® 19115™.

320 µg/mL 160 µg/mL 80 µg/mL 40 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL

5 µg/mL 2.5 µg/mL

La concentración mínima
inhibitoria de L. monocytogenes
ATCC® 19115™ es 40 µg/mL.

46
ANEXO 15. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de
Minthostachys mollis “muña”, para evaluar CMI frente a Staphylococcus
aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.

320 µg/mL 160 µg/mL 80 µg/mL 40 µg/mL 20 µg/mL 10 µg/mL

5 µg/mL 2.5 µg/mL

La concentración mínima inhibitoria

de Staphylococcus aureus subsp.
aureus ATCC® 12600™ es 80 µg/mL.

47
 ANEXO 16

Tabla 03. Inhibición bacteriana según la concentración del aceite esencial de

Minthostachys mollis (µg/mL).

Concentración Bacterias
del aceite esencial S. aureus L. monocytogenes
de Minthostachys
mollis (µg/mL) 1° repetición 2° repetición 3°repetición 1° repetición 2° repetición 3°repeticion

320 I I I I I I
160 I I I I I I
80 I I I I I I
40 N.I N.I N.I I I I
20 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
10 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
5 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
2,5 N.I N.I N.I N.I N.I N.I

LEYENDA
I = Inhibe el crecimiento
N.I = No inhibe el crecimiento

48