BIOQUÍMICA GÚIA 6

PRODUCCIÓN DE PIRUVATO ACETALDEHÍDO Y ETANOL POR

FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA CON LAS ENZIMAS DE LA LEVADURA

I. EL PROBLEMA

Demostrar experimentalmente algunos métodos para la obtención de

intermediarios metabólicos, particularmente los de la fermentación de la glucosa
con las enzimas de la levadura y reconocerlos por medio de reacciones
colorimétricas cualitativas.

II. INTRODUCCIÓN

La primera etapa de la fermentación de glucosa por las enzimas de la levadura es

la producción de piruvato, este procedimiento se efectúa mediante una serie de
reacciones que implican un número considerable de intermediarios, al cual se le
denomina glicólisis anoxigénica o anaeróbica.

La reacción global se podría considerar como la transferencia de dos pares de

átomos de hidrógeno (2e- 2H+) de la glucosa al NAD+. Debido a que la coenzima
sólo se encuentra en cantidades catalíticas, es necesario reoxidarla para que esta
transformación no se suspenda, y así, el NADH+ + H+ que se forma se reconvierte
en NAD+ por el oxígeno molecular a través de la cadena respiratoria. Sin embargo,
este proceso no se realiza cuando las condiciones son anaerobias y en este caso
la reoxidación se efectúa cuando el piruvato se convierte en acetaldehído y
posteriormente en etanol, según las siguientes reacciones

1
El piruvato forma acetaldehído y CO2 por la acción de la piruvato descarboxilasa la
cual requiere del ión magnesio y de la tiamina pirofosfato (TPP). La enzima que
cataliza la etapa final de la fermentación es la alcohol deshidrogenasa, el
acetaldehído entonces se reduce a etanol reacción en la cual el NADH + + H aporta
el potencial de reducción.

Los metabolitos piruvato y acetaldehído, normalmente se encuentran presentes

en muy bajas concentraciones, por lo tanto, para demostrar su existencia como
intermediarios en las vía metabólicas, es necesario impedir que se transformen en
otros compuestos, situación que se logra ya sea bloqueando la enzima que
cataliza la conversión del metabolito mediante el empleo de inhibidores, o
cambiando las condiciones fisiológicas, por ejemplo, el valor de pH para que la
velocidad de catálisis disminuya, o mediante agentes que atrapen al intermediario
formando un compuesto que no se pueda metabolizar.

El pH óptimo para la fermentación alcohólica inducida por levaduras es 4,5

situación que se verifica a través del ensayo en el laboratorio. Cuando el pH es
ligeramente alcalino se inactiva la piruvato descarboxilasa, generándose en el
medio una acumulación de piruvato, su presencia se puede demostrar por la
reacción con 2,4 dinitrofenilhidrazina.

El pH que favorece la acción de la etanol deshidrogenasa oscila entre 5 a 6; sin

embargo, en caso de modificarlo hacia un rango ligeramente alcalino (pH=8), la
reacción se favorece hacia la oxidación del etanol, es decir, se acumula
acetaldehído.

Para atrapar acetaldehído se le añade a la mezcla de incubación sulfito de sodio

(adición bisulfítica) y este se reconoce con el reactivo de schiff.

2
Otro de los productos de la fermentación de la glucosa es el etanol y para
reconocerlo se realiza el ensayo de vanadato oxina.

Fundamentos químicos de pruebas de reconocimiento

Dinitrofenilhidrazina
Para el reconocimiento de aldehídos y cetonas, se realiza la prueba con 2,4-dinitro-fenil-
hidrazina, que conduce a la formación de las 2,4-dinitro-fenil-hidrazonas
correspondientes, que son sólidas. La formación del precipitado coloreado naranja, rojo o
amarillo es prueba positiva para aldehídos y cetonas.

Cetonas:

R-CO-R + H2NNHC6H3(NO2)2 RR’-C=NNHC6H3(NO2)2 + H2O

Cristales coloreados

Prueba de Schiff
El clorhidrato de pararosanilina decolorado o fusina (reactivo de Schiff) reacciona con los
aldehídos produciendo un complejo de color violeta. El formaldehido, ácido glioxílico,
paraformaldehido, acetaldehído y benzaldehído se pueden detectar en cantidades
superiores a 1mg bajo las condiciones del ensayo; no dan prueba positiva la acetona y la
vainillina (es un aldehído). Como interferentes de la prueba se reporta que 10 mg de
etanol al 96% y 10 mg de ácido acético glacial generan un color levemente violeta,
parecido al observado para 1 mg de paraformadehído o ácido glioxílico.

Adición bisulfítica
Todos los aldehídos, las metilcetonas y algunas cetonas cíclicas reaccionan con bisulfito
de sodio produciendo compuestos de adición bisulfítica.

3
 La adición de un ácido o una base disueltos en agua destruye el ión bisulfito y regenera
el compuesto carbonílico.

Vanadato oxina
Los alcoholes, aunque estén mezclados con otros compuestos como hidrocarburos,
éteres, cetonas y compuestos halogenados, son reconocidos mediante la formación de un
complejo de coloración roja, rosa o naranja, en la capa de benceno, con una mezcla de 8-
hidroxiquinolina (oxina) y vanadato de amonio.

III .MATERIALES Y REACTIVOS

Material de prueba:

Levadura en pasta

Material por grupo

10 Tubos de ensayo Papel de aluminio

2 Vasos de precipitados (250 mL) Balanzas
3 Pipetas (1, 2 y 5 mL) Baño maría

4
4 Tubos de centrífuga Centrífuga
2 Pinzas para tubo Estufa de calentamiento
1 Espátula Pipeta Pasteur
1 Pipeteador

Reactivos

Fosfato de sodio dibásico, 0.5mol/L (Na2HPO4)

Fosfato de sodio monobásico, 0.5mol/L (NaH2PO4)
Suspensión de levadura, 100 g/L en (Na2HPO4)
Suspensión de levadura, 100 g/L en (NaH2PO4)
Suspensión de levadura, 100 g/L en (H2O)
Suspensión de levadura, 100 g/L en (H2O)
Glucosa, 100 g/l
Sulfito de sodio
Hidróxido de sodio, 100 g/L
Hidrocloruro de 2, 4 – dinitrofenilhidrazina (solución saturada en ácido clorhídrico
2M).
Reactivo de 2,4 dinitrofenilhidrazina (disolver 3 g de 2, 4 dinitrofenilhidrazina en 15
ml de H2SO4, esta solución se añade con agitación fuerte sobre una mezcla
previamente preparada de 20 ml de agua con 70 mL de etanol al 95%) frasco
gotero.
Ácido tricloroacético, 100g/L
Etanol.
Acido pirúvico o piruvato de sodio al 1%
Benzaldehído
Vanadato de amonio (300 mg/L) en frasco gotero
Solución de oxina (8-hidroquinolina al 2.5% en ácido acético al 6%) frasco gotero.
Reactivo de Schiff (Preparación: Un litro de reactivo se prepara mezclando 1g de
fusina (cloruro de p-rosamilina) en 500mL de agua destilada, 20 mL de solución
acuosa y saturada de bisulfito de sodio, y 10 mL de HCl concentrado; llevar a
volumen (1L) con agua destilada. El reactivo debe ser transparente.)

IV. PROCEDIMIENTO

Procedimiento a cargo del auxiliar de laboratorio:

Tome dos tubos de ensayo y márquelos como A y B. Pipetee 3 mL de glucosa en
cada uno. Agregue al tubo A 5 mL de suspensión de levadura en solución de
Na2HPO4 alcalina (verifique con papel indicador que el pH aproximadamente 8) y
al tubo B 5 mL de suspensión de levadura en solución de NaH 2PO4 ácida
(verifique pH aproximadamente 4). Mezcle bien ambos tubos, protéjalos con papel
de aluminio y póngalos a incubar a 37oC durante 2 días.
PROCEDIMIENTO A CARGO DE SU GRUPO DE LABORATORIO:
Consulte bibliografía útil para elaborar una bebida fermentada en su casa y llévela
el día del laboratorio( aproximadamente 20 ml)

5
(1)Formación de piruvato a partir de glucosa.

Mida el PH de las soluciones en los tubos A, B y bebida fermentada con papel

indicador universal
Al cabo de este tiempo a los tubos que le entregará la monitora (A y B) y a un
tubo con 8 ml de bebida fermentada preparada por usted, agregar 2 mL de
solución de ácido tricloroacético, mezclar vigorosamente y centrifugar durante 10
minutos a 2500 rpm. Separar los sobrenadantes para la identificación de piruvato.

a) Reconocimiento del piruvato con 2,4 dinitrofenilhidrazina.

Tome 2 mL de los sobrenadantes que se obtuvieron en (1) en tubos de ensayo

diferentes(3 tubos). Añada a cada tubo 1 mL de la solución de 2,4
dinitrofenilhidrazina y mezcle vigorosamente cada tubo. En tres tubos de ensayo
limpios, saque 3 ó 5 gotas de las mezclas anteriores y adicióneles a cada una 1
mL de NaOH, 10% y 2 ml de agua destilada. Observe la formación de un color rojo
lo cual indica la presencia de piruvato.

Repita el ensayo pero esta vez utilizando el reactivo puro de ácido pirúvico como
control positivo y agua como control negativo

(2)Formación de acetaldehído y etanol a partir de glucosa.

Procedimiento a cargo del auxiliar de laboratorio:

Tome dos tubos de ensayo y márquelos como C y D. Adicione a cada uno de ellos
3 mL de glucosa y 5 mL de suspensión de levadura en agua. Al tubo D añada 0.5
g de sulfito de sodio. Mezcle ambos tubos vigorosamente y póngalos a incubar a
37oC durante 1 día, protéjalos con papel de aluminio.

A los tubos C y D añadir 2ml de ácido tricoro acético (ATA), mezclar y centrifugar
durante 10 minutos a 2500 rpm y separe los sobrenadantes para el
reconocimiento de etanol y acetaldehído.

a) Reconocimiento de acetaldehído:

Tome tres tubos de ensayo, agregue a cada uno 0.5 mL del reactivo de Schiff, al
primero de ellos añada 100µL (6 gotas) del sobrenadante del tubo C , al segundo
100µL (6 gotas) del sobrenadante del tubo D y al tercero 6 gotas de su bebida
fermentada, a la que previamente adicionó ATA y centrifugó (1). La aparición de
un color fucsia o púrpura es prueba positiva para aldehídos.
6
Repita el procedimiento utilizando el reactivo de benzaldehído como patrón
positivo y agua como patrón negativo

b) Reconocimiento de etanol (Vanadato – oxina).

Disolver 10 gotas del sobrenadante del tubo B en 1 mL de benceno, adicione 0.5

mL de solución de vanadato de amonio y 2 ó 3 gotas de solución de oxina, mezcle
bien y deje reposar por 20 minutos. La formación de un color rojo en la capa de
benceno es prueba positiva para el alcohol.

Disolver 10 gotas del sobrenadante del tubo C en 1 mL de benceno, adicione 0.5

mL de solución de vanadato de amonio y 2 ó 3 gotas de solución de oxina, mezcle
bien y deje reposar por 20 minutos. La formación de un color rojo en la capa de
benceno es prueba positiva para el alcohol.
Repita el mismo procedimiento de vanadato oxina en otro tubo de ensayo, pero
para su bebida fermentada( 10 gotas).

Realice nuevamente el procedimiento, pero esta vez utilizando etanol como

patrón.

PREINFORME E INFORME/ PRODUCCIÓN DE PIRUVATO ACETALDEHÍDO Y

ETANOL POR FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA CON LAS ENZIMAS DE LA
LEVADURA

PREINFORME Nombre____________________________ Grupo____

1. Consulta

a) ¿Qué tipo de organismos son las levaduras? y explique de acuerdo con su

metabolismo si se consideran de caracter aerobio, anaerobio, o anaerobio
facultativo.

b) Describa brevemente dos procesos de fermentación industrial en los que se

utilizan las levaduras, incluyendo ejemplos de especies de estos microorganismos.

7
 C) Describa brevemente el procedimmiento que empleó para elaborar su
bebida fermentada.

2. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio

Nombre Fórmula Aspecto Peligrosidad* Primeros auxilios

Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O),

inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo
(C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).

3. Bibliografía

4. Procedimiento

8
Guía para elaborar y calificar resultado de
reconocimiento de piruvato y acetaldehído
1)compuesto que va a reconocer ( en cada tubo) y en qué no se transforma en la
ruta metabólica?
2)por qué se acumula o no este intermediario en cada tubo?
3)Reactivo de reconocimiento, fundamento químico
4)Observación por tubo
Guía para elaborar y calificar resultado de
reconocimiento de etanol:
1) Tubos en los que reconocerá el metabolito
2)Por qué se completa la fermentación?
3)Fundamento químico de reactivo reconocimiento
4)Observación de reactivo de reconocimiento

4.1 Formación de piruvato a partir de glucosa y reconocimiento del piruvato

con 2,4 dinitrofenilhidrazina.
Resultado
espeardo:__________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

4.2 Formación de acetaldehído y reconocimiento con reactivo de Schiff

9
Resultado
espeardo:__________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
DIAGRAMA DE FLUJO

4.3 Formación de etanol y reconocimiento con vanadato – oxina

Resultado
espeardo:__________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

DIAGRAMA DE FLUJO
10
INFORME
Debe contener:
 Datos y observaciones debidamente tabulados para cada prueba,
incluyendo los controles, aclarando si la prueba es positiva o negativa.
 Análisis de las observaciones de la práctica con citas en normas APA y
usando la información de su preinforme y guía (introducción y resultados
esperados) :
-Explique el propósito de agregar en cada tubo (A,B,C, o D) según
corresponda: levadura, Na2HPO4, NaH2PO4, glucosa, 2,4-dinitrofenilhidrazina,
sulfito de sodio, Schiff, vanadato-oxina.
-Interprete por escrito los resultados obtenidos en cada tubo,use le
fundamneto químico de las prebas realizadas, explique el pH medido en cada
tubo( A, B y fermentado).
-Realice la ecuación de la reacción química del acetaldehído y piruvato con
cada reactivo de reconocimiento( no use R).
-Para la ruta metabólica de la fermentación etanólica desde la glucosa hasta el
etanol, especifique hasta que reacción pudo evidenciar en cada tubo ( A,B,C,D
y bebida fermentada) gracias a los reactivos de reconocimiento.
-De acuerdo con la guía explique la importancia de detectar los intermediarios
metabólicos.
- Explique el propósito de los pasos que realizó para elaborar su bebida
fermentada.

 Redacte la bibliografía correspondiente en normas APA

VI. BIBLIOGRAFÍA
11
BOYER, Rodney. Conceptos de Bioquímica. México: International Thomson
Editores, 2000.

CHAMPE, Pamela. C; HARVEY, Richard, A. y FERRIER, Denise. R. Bioquímica. 4

ed. España: Lippincott, 2008.

DIAZ, Juan C y HICKS, Juan José. Bioquímica. 2 ed. México: Interamericana,

McGraw – Hill, 1995.

HICKS GOMEZ, Juan José. Bioquímica. 2 ed. México: McGraw – Hill

Interamericana, 2007.

MELO, Virginia y CUAMATZI, Oscar. Bioquímica de los procesos metabólicos.

España: Reverté, 2006.

RODNEY, Boys. Conceptos de Bioquímica. México: International Thomson

Editores, 2000.

PARÉS, Ramón y JUARÉZ, Antonio. Bioquímica de los Microorganismos. España:

Reverté, 1997.

VOET, Donald; VOET, Judith y PRATT, Charlotte. Fundamentos de Bioquímica.

La vida a nivel molecular. 2 ed. México: Médica Panamericana, 2007.

12