INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Departamento de Farmacia 0

MANUAL DE PRÁCTICAS

PROGRAMA:
INGENIERÍA EN SISTEMAS AMBIENTALES

UNIDAD DE APRENDIZAJE:
LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA GENERAL

Nombre: __________________________________________________________

Equipo: _____________ Grupo: _______________

2018
Las actividades del laboratorio de Toxicología General se desarrollan con apego a:

• La Norma Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la 1

producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.

• La Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud

ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones
de manejo.

• A las disposiciones del Comité de Bioética de la ENCB en esta materia.

 LINEAMIENTOS DE LABORATORIO

Dentro del laboratorio se deberán observar las siguientes normas de higiene:

1. Usar bata para cualquier actividad que se realice.

2. No comer, fumar o tomar bebidas, masticar chicles y golosinas.

3. No maquillarse, ni cepillar el cabello.

2
4. No emplear ningún equipo de laboratorio (e.g. refrigeradores y horno de microondas)
para almacenar o preparar alimentos.

5. No almacenar material biológico vivo.

6. No se permite la entrada de mascotas.

7. El material biológico por analizar se deberá almacenar estrictamente en los espacios

destinados para ello informando al responsable del laboratorio.

8. Limpiar el espacio personal de trabajo antes y después de haber terminado los

experimentos.

9. No dejar destapados frascos que contengan sustancias químicas, tubos, puntas y

cualquier otro material estéril o material potencialmente tóxico.

10. No abandonar el laboratorio con la bata puesta y preferentemente, no usarla de saco o

suéter para salir a la calle y otros espacios públicos.

Dentro del laboratorio se deberán observar las siguientes reglas de seguridad:

1. No correr dentro del laboratorio.

2. No se permiten reuniones o festejos sociales.

3. Vestir zapatos cerrados.

4. Es una obligación de los usuarios preguntar por los riesgos de salud a los que se
expone al trabajar en el laboratorio.
5. Es una obligación de los usuarios leer las etiquetas de todas las sustancias químicas
que utilicen, así como investigar los materiales que han de utilizar en las prácticas con
el fin de que conozcan los riesgos a los que se exponen ellos y los demás usuarios.

6. No utilizar recipientes vacíos de sustancias tóxicas, inflamables o irritantes de mucosas

y piel para almacenar otras sustancias químicas o material biológico.

7. No manejar sustancias tóxicas, irritantes, inflamables, cancerígenas o mutagénicas

fuera de las áreas destinadas para estos usos. 3

8. Mantener libres de obstáculos las salidas normales y de emergencia.

9. Permitir el libre paso entre las mesas de trabajo y las salidas del laboratorio.

10. Mantener en funcionamiento óptimo las regaderas de seguridad, los lavaojos y los
extinguidores.

11. Ante una situación de urgencia mantener la calma y abandonar tranquilamente el

laboratorio, sin correr, empujar o gritar.
 OBJETIVOS GENERALES DEL LABORATORIO DE TOXICOLOGÍA GENERAL

• Mediante bioensayos básicos y la aplicación de diversas técnicas, los alumnos

comprobarán algunos postulados fundamentales de la toxicología.

• Los alumnos adquirirán algunos criterios básicos para la identificación de respuestas

tóxicas producidas por xenobióticos en organismos de prueba.
4

RIESGOS Y PRECAUCIONES GENERALES

Todos los xenobióticos pueden provocar efectos nocivos, dependiendo tanto de la

concentración a la que nos encontramos expuestos, como de la respuesta individual, entre otros
factores. Es por ello que resulta indispensable tomar todas las medidas de precaución en cada
una de las prácticas que se realizarán en el laboratorio.

Debemos recordar que:

ACTO INSEGURO + CONDICIÓN INSEGURA = ACCIDENTE

Cuando tengas dudas sobre la seguridad en alguno de los pasos de las prácticas, consulta con
tus profesores y si identificas una situación de riesgo avisa inmediatamente.
 CONTENIDO

Práctica Título

1A Manejo de animales de laboratorio 5

1B Métodos de distribución de animales de laboratorio
1C Vías de administración de xenobióticos en rata
2 Evaluación cualitativa de la distribución de un xenobiótico e influencia de las vías
de administración

3 Cuantificación de un xenobiótico en orina

4 Identificación de un xenobiótico y sus metabolitos

5 Determinación de la dosis letal media (DL50) de un plaguicida en ratón.

6 Evaluación de la toxicidad subletal producida por un herbicida sobre plantas,

mediante el uso de un biomarcador de efecto.
 Práctica 1A

Manejo de animales de laboratorio

Introducción

El uso de los animales con fines de investigación científica se inició cinco siglos antes de la Era
Cristiana, pero se limitaba a utilizar animales domésticos o de fácil captura. A fines del siglo
6
XIX, se empiezan a utilizar aquellos no domesticados como las ratas, ratones y cobayos. En los
últimos años, se han reconocido los derechos de los animales y se han establecido normas
éticas para la experimentación animal. Ante ello, para cualquier trabajo de investigación, es muy
importante manejar adecuadamente a estos seres vivos.
El manejo apropiado involucra cualquier sistema de cuidado y alojamiento que permita que los
animales crezcan, maduren, se reproduzcan, se comporten normalmente y se mantengan
sanos; con el fin de no interferir en sus ciclos biológicos y así minimizar variaciones que puedan
modificar las respuestas biológicas cuando son utilizados en el laboratorio.
En los protocolos tradicionales de toxicología experimental, se utilizan generalmente animales
pequeños como ratón, rata, hámster, cobayo y conejo, debido a que entre otras características,
son de fácil manejo, presentan periodos frecuentes de reproducción y su mantenimiento es
menos costoso que el de otras especies. Así mismo, es importante resaltar que todos los
animales utilizados en un experimento, deben proceder de un bioterio que cumpla con la
normatividad vigente, asegurando que los ejemplares se encuentran sanos, han recibido la
alimentación adecuada y se han mantenido en condiciones higiénicas.

Objetivo

• Aprender el manejo correcto de rata y ratón en el laboratorio.

Materiales y reactivos

Material:
- Guantes de látex y/o de cirujano
- Franelas
 - Jaulas para rata y ratón
- Bebederos

Material biológico por equipo:

- Ratas de 200 ± 10 g de p.c.
- Ratones de 30 ± 10 g de p.c.

7
Desarrollo de la práctica

• Sujetar de acuerdo a las siguientes indicaciones el número de animales indicado por los
profesores por equipo y colocarlos en la jaula correspondiente.

El animal se debe tomar por el dorso suavemente (pero con seguridad) con la mano derecha y
colocarla en la mesa sin soltarla, o bien, por la cola procurando que solamente las extremidades
anteriores se apoyen sobre la mesa. Con la mano izquierda se sujeta la piel del cuello,
manteniéndola inmóvil; con la mano derecha se puede estirar la cola o las patas posteriores sin
lastimarlas.
Lo animales no se deben sujetar únicamente por la cola, ya que podríamos provocarles daños
físicos.

Bibliografía

1. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,

2009.
2. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. Norma
Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la producción,
cuidado y uso de los animales de laboratorio.
Cuestionario

1) ¿Cuál es la importancia del manejo adecuado de animales de experimentación?

Argumenta desde el punto de vista bioético y científico.
2) ¿Qué tipo de organismos puedes utilizar para realizar la evaluación toxicológica de un
xenobiótico?
3) ¿Cuáles son las especies más utilizadas para realizar experimentación toxicológica?
8
4) ¿Qué características deben tener los organismos empleados en la experimentación
toxicológica?
5) Menciona las normas que regulan el manejo de animales de laboratorio.
 Práctica 1B

Marcado y distribución de animales de laboratorio

Introducción

La respuesta biológica en una población puede ser variable debido a diversos factores
intrínsecos y extrínsecos de los individuos, por lo que en un experimento es común trabajar con 9
un número grande de animales, sin olvidar el principio de las 3 R´s propuesto por Russel y
Burch (1959): reemplazar, reducir y refinar.
Debido a que en muchos experimentos toxicológicos es inevitable el uso de animales de
laboratorio, es importante llevar a cabo un marcaje adecuado que permita identificarlos sin
margen de error entre los investigadores; así como agrupar a los individuos en lotes
experimentales equivalentes en el mayor número de características posibles, para de este
modo, reducir al mínimo la posibilidad de que en alguno se tengan sujetos en los que predomine
alguna característica (peso, edad, temperatura, etc.).
Esta distribución se puede realizar al azar y con el uso de números aleatorios; así como por
algún otro método como el de la culebra japonesa, el cual consiste en ordenar los pesos
corporales de los animales en orden decreciente, acomodándolos posteriormente en una tabla
en dirección horizontal continua del mayor al menor, simulando el movimiento de una culebra.
En cualquiera de los casos, el método elegido debe permitir al investigador corroborar
estadísticamente que no existe diferencia significativa (P ˂ 0.05) entre los lotes.

Objetivo

• Conocer y aplicar el método de manchado para el marcaje de animales de laboratorio.

• Realizar la distribución de animales de laboratorio mediante el método de números
aleatorios y de la culebra japonesa.

Material y reactivos

Material:
 - Marcadores de tinta indeleble de diferentes colores
- Guantes de látex y/o de cirujano
- Franelas
- Jaulas para rata
- Bebederos

Equipo:
10
- Balanza para animales

Material biológico por equipo:

- Ratas de 200 ± 10 g de p.c.
- Ratones de 30 ± 10 g de p.c.

Desarrollo de la práctica

• Distribuir aleatoriamente a los animales mediante el uso de números aleatorios.

• Utilizando el método de manchado, marcar a los animales, pesarlos y anotar los datos
en las tablas 1A y 1B. Las marcas a utilizar son las siguientes: cabeza (Ca), lomo (Lo),
cola (Co), mano derecha (Md), mano izquierda (Mi), pata derecha (Pd), pata izquierda
(Pi) y todas las combinaciones posibles entre ellas, dependiendo del número de animales
por lote. Se puede iniciar con una marca (Ca, Lo) y después combinar 2 (CaLo) y así
sucesivamente.
• Con los datos obtenidos realizar el llenado de las tablas 2A y 2B, siguiendo la
metodología de la culebra japonesa.

Resultados
11
 12

Análisis de resultados

• Calcular los parámetros estadísticos: media, desviación estándar y error estándar para
cada lote y método; y llenar las tablas 3A y 3B con los valores obtenidos.
 13

• Realizar el análisis estadístico para determinar si existen diferencias estadísticas entre

los lotes y los métodos de distribución utilizados.
• Con base en la información obtenida, describir las diferencias entre los métodos de
distribución utilizados.
Bibliografía

1. Delgado NL, Revuelta ME. Guía Práctica para el Manejo de Animales de Laboratorio.
Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F. 1993.
2. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,
2009.
3. Russell WMS y Burch RL. 1959. The Principles of Humane Experimental Technique.
14
Methuen & Co. Londres, Inglaterra.
4. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. Norma
Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la producción,
cuidado y uso de los animales de laboratorio.

Cuestionario

1) Define el término distribución.

2) ¿Cuál es la importancia de la adecuada distribución de organismos de laboratorio?
3) ¿Cuáles son los principales métodos de distribución de organismos de laboratorio?
4) ¿Cuál es la importancia del marcaje adecuado de organismos de laboratorio?
5) ¿Cuáles son los principales métodos de marcaje de organismos de laboratorio?
 Práctica 1C

Vías de administración de xenobióticos

Introducción

Los principales factores que influyen sobre los efectos tóxicos de un determinado xenobiótico
sobre un organismo dependen de las características propias de éste, de la interacción entre 15
ambos, y sobre todo, de la forma en la que el individuo entra en contacto con el xenobiótico.
En un experimento con animales, la elección de la vía se realiza con base en el tipo de
xenobiótico, sus características fisicoquímicas y la posible vía por la que el hombre o población
podrían estar expuestos, de esta forma, podemos diferenciar la vía oral, dérmica o inhalatoria
como las de mayor relevancia en el ámbito toxicológico.

Objetivos

• Identificar y conocer las características de algunas vías de administración.

• Adquirir habilidad para administrar a ratas y ratones por diferentes vías.

Material y reactivos

Material:
- Guantes de látex y/o de cirujano
- Franelas
- Algodón
- Jeringas de 1 mL con aguja desprendible
- Jeringas de 3 mL
- Cánulas para rata y ratón
- Jaulas para rata
- Estuche de disección

Equipo:
 - Balanzas para animales

Material biológico por equipo:

- Ratas de 200 ± 10 g de p.c.
- Ratones de 30 ± 10 g de p.c.

Reactivos:
16
- Éter etílico
- Alcohol 96°
- Solución salina al 0.9 %
- Solución glucosada

Desarrollo de la práctica

• De acuerdo a las siguientes indicaciones y las de los profesores, practicar las diferentes
vías de administración en rata y ratón de laboratorio.

a) Vía oral
Se usa un dispositivo que consta de una aguja hipodérmica doblada con un catéter de material
de plástico sin punta o una cánula. Administrar 0.2 mL de solución glucosada a cada animal,
teniendo cuidado de seguir la ruta del tracto gastrointestinal.

b) Vía intraperitoneal
Se toma al animal firmemente por la nuca ejerciendo presión para inclinar la cabeza y llevarla
sobre su lomo. Manteniendo al animal en esta posición, otra persona sujetará una de las
extremidades inferiores del animal (la misma persona en el caso del ratón) y se administrará en
el área abdominal tomando como referencia la parte superior de la misma extremidad. La aguja
se debe introducir en un ángulo de 45 grados. Administrar 0.2 mL de solución salina a cada
animal.
c) Vía intramuscular
Se sujeta al animal y se limpia la región más alta del músculo bíceps femoral, insertando en esa
zona la aguja. Administrar 0.2 mL de solución salina a rata.

d) Vía subcutánea
Se sujeta firmemente a la rata o ratón, se levanta la piel del cuello y se introduce la aguja
siguiendo la dirección céfalo caudal, asegurándose que la aguja quede bajo la piel. Administrar
17
0.2 mL de solución salina a cada animal.

Bibliografía

1. Delgado NL, Revuelta ME. Guía Práctica para el Manejo de Animales de Laboratorio.
Universidad Nacional Autónoma de México, México, D.F. 1993.
2. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,
2009.
3. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación. Norma
Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la producción,
cuidado y uso de los animales de laboratorio.

Cuestionario

1) ¿Cómo se clasifican las vías de administración en animales de laboratorio?

2) ¿Cuáles son las principales vías por las que los organismos se exponen a los
xenobióticos?
3) ¿Cuáles son los criterios para la selección de una vía de administración en la
evaluación toxicológica?
4) ¿Cuál es la importancia de una adecuada selección de la vía de administración al
evaluar la toxicidad de un xenobiótico?
 Práctica 2

Influencia de las vías de administración en la distribución de un xenobiótico

Introducción

Para que en el organismo se manifiesten los efectos producidos por un xenobiótico, se requiere,
en la mayoría de los casos, que estos compuestos sufran los procesos de absorción y
18
distribución para alcanzar finalmente su sitio de acción.
La libre difusión de los tóxicos a través de las membranas biológicas se relaciona directamente
con su coeficiente de partición y con su grado de disociación (pKa), así como por la unión a
proteínas plasmáticas, la biotransformación y la excreción, entre otros procesos.
Por otro lado, los tejidos con mayor irrigación sanguínea tenderán en primera instancia a
acumular más al xenobiótico, ya que tienen mayor oportunidad de lograr un equilibrio con el
plasma. Sin embargo, ciertos tejidos son menos permeables que otros, por ejemplo el cerebro,
el cual está separado de la circulación general por la barrera hematoencefálica.
Para demostrar la distribución que sigue un xenobiótico en el organismo, se utilizan en el
laboratorio diversos marcadores, entre ellos la solución de fluoresceína sódica. Este compuesto
es un polvo anaranjado-rojizo, que en solución acuosa presenta fluorescencia amarillo-verdosa,
observable bajo luz ultravioleta.

Objetivo

• Evaluar cualitativamente cómo influye la vía de administración en la distribución de la

fluoresceína sódica.

Material y reactivos

Material:
- Estuche de disección
- Jeringa de 1 mL con aguja removible
- Jeringa de 3 mL
- Cánula
 - Cámara de anestesia
- Algodón
- Franela

Equipo:
- Lámpara de luz ultravioleta

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Material biológico por equipo:
- Ratas de 200 ± 10 g de p.c.

Reactivos:
- Solución de fluoresceína sódica al 0.7 % en solución salina isotónica
- Éter etílico

Desarrollo de la práctica

• Distribuir aleatoriamente y pesar a los animales (una rata por equipo).

• Administrar la fluoresceína sódica a la dosis de 17.5 mg/kg por la vía asignada a cada
equipo: oral, subcutánea, intraperitoneal e intramuscular.
• Transcurridos 15 minutos después de la administración, sacrificar a los animales
colocándolos en una cámara saturada con éter etílico.
• Observar la zona de aplicación bajo la luz ultravioleta.
• Efectuar la disección evidenciando bajo la luz ultravioleta la presencia de la fluoresceína
sódica en los diferentes órganos y tejidos.
Nota: Al realizar la disección, evitar la contaminación de órganos y tejidos.

Resultados

• Registrar en la tabla 1 la presencia de la fluoresceína sódica en los diferentes órganos y

tejidos utilizando la siguiente simbología:
+ ligera ++ abundante +++ muy abundante
 • Comparar la presencia de la fluoresceína sódica en los diferentes órganos considerando
la vía de administración.

20

Bibliografía

1. O'Neil MJ. The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals,
2013.
2. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,
2009.

Cuestionario

1) Qué es la distribución como parámetro toxocinético?

2) ¿Cuáles son los factores que determinan la distribución de un xenobiótico?
3) ¿Cómo influye la vía de exposición en la distribución de xenobióticos?
4) ¿Cómo se relaciona la distribución con la respuesta tóxica?
5) ¿Qué es la fluoresceína sódica y cuáles son sus usos?
 Práctica 3

Cuantificación de un xenobiótico en orina

Introducción

Los xenobióticos que se han incorporado al organismo pueden ser evidenciados en los
diferentes fluidos biológicos, siendo esto una prueba contundente de la exposición, ya sea para
21
su identificación, cuantificación y/o confirmación.
Un xenobiótico puede encontrarse en diferentes órganos y tejidos dependiendo de su estructura
química y del tiempo transcurrido desde su exposición; sin embargo, el curso natural es que
éste sea eliminado por las diferentes vías de excreción (orina, saliva, sudor, bilis y aire espirado,
entre otras).
Para demostrar la presencia de un xenobiótico en una matriz biológica, se debe contar con
métodos analíticos específicos y confiables, así como estándares de alto grado de pureza.
Con base en los fundamentos anteriores, en esta práctica se administrará ácido acetilsalicílico
(aspirina) a voluntarios y se realizará la cuantificación de los salicilatos excretados en la orina
mediante un método analítico espectrofotométrico con el reactivo de Trinder. Éste contiene un
ión férrico que al reaccionar con el grupo hidroxilo del salicilato forma la sal fenóxida férrica que
es de color violeta y absorbe en la región visible, debido al estado excitado de los electrones
deslocalizados sobre el átomo de fierro.

Objetivo

• Determinar la concentración de salicilatos excretados en orina de voluntarios previamente

administrados con ácido acetilsalicílico (aspirina).

Material y reactivos

Material:
- Probeta de 1000 mL
- Gradilla
 - Tubos de ensayo
- 5 pipetas volumétricas de 1 mL
- 1 pipeta volumétrica de 5 mL
- 2 vasos de precipitados de 250 mL

Curva Tipo:
- 2 matraces volumétricos de 100 mL
22
- Pipetas volumétricas de 0.5,1, 2, 3, 4 y 5 mL
- 7 matraces volumétricos de 10 mL
- 1 vaso de precipitados de 250 mL

Equipo:
- Balanza analítica
- Espectrofotómetro

Material biológico:
- 1 voluntario sano por equipo

Reactivos:
- Salicilato de sodio
- Ácido acetilsalicílico (tabletas de 500 mg)
- Reactivo de Trinder

Desarrollo de la práctica

a) Obtención de muestras
• Eliminar la primer orina de la mañana y tomar 250 mL de agua.
• Colectar la siguiente orina y etiquetar la muestra como “basal”.
• Ingerir dos tabletas de ácido acetilsalicílico de 500 mg con 250 mL de agua. Anotar la
hora exacta de la ingesta (t = 0).
 • Seguir ingiriendo agua y colectar la orina en intervalos aproximados de 20 minutos
durante las primeras 5 h y las siguientes colectas a libre micción, hasta completar 24 h.
Ingerir al menos 250 mL de agua tras cada micción, registrando los siguientes datos:
• Identificación de la muestra
• Hora exacta de la colecta
• Volumen total excretado
• Refrigerar una muestra de aproximadamente 50 mL por cada tiempo en un frasco limpio,
23
el cual deberá ser etiquetado con los datos registrados.

b) Preparación de la curva tipo

• Pesar 200 mg de salicilato de sodio, colocarlos en un matraz volumétrico de 100 mL y
aforar con agua destilada (solución A).
• Tomar 10 mL de la solución A y llevarlos a 100 mL con agua destilada en un matraz
volumétrico (solución B).
• De la solución B tomar 0.5, 1, 2, 3, 4 y 5 mL con pipetas volumétricas y depositarlos
respectivamente en 5 matraces volumétricos de 10 mL, agregar 5 mL de reactivo de
Trinder y aforar con agua destilada.
• Determinar la absorbancia de estas soluciones en un espectrofotómetro a 540 nm,
utilizando un blanco de reactivos para ajustar el equipo.

c) Cuantificación de salicilatos
• Tomar 1 mL de cada muestra y colocarla en tubos de ensayo, agregar 5 mL del reactivo
de Trinder y agitar.
• Ajustar a cero el espectrofotómetro con la muestra basal.
• Determinar la absorbancia de las muestras.
• Interpolar los resultados en la curva tipo para obtener la concentración de cada una de
las muestras.

Nota: Las muestras que presenten sedimento deberán ser filtradas o centrifugadas antes de
llevar a cabo la reacción de coloración. Guardar el resto de la orina para la práctica 6.
Análisis de resultados

• Determinar las concentraciones de la curva tipo y llenar la tabla 1.

24

• Con estos datos obtener la ecuación de la recta utilizando el modelo de regresión lineal,
considerando como variable dependiente la absorbancia y como variable independiente
la concentración.
• Calcular la concentración de salicilatos excretados (µg/mL) para cada muestra y registrar
los resultados en la tabla 2.
• Realizar los cálculos indicados para completar la tabla 2.
 25

• Trazar una gráfica de tiempo (h) contra cantidad excretada acumulada de salicilatos
(mg).
• Analizar los resultados explicando las posibles variables que influyen en la eliminación
del ácido acetilsalicílico.

Bibliografía

1. Principles and Methods of Toxicology. Hayes A.W. (ed.), CRC Press, Boca Ratón, 2007.
2. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,
2009.
Cuestionario

1. ¿Cuáles son las principales vías de excreción?

2. ¿Qué características debe tener un xenobiótico para poder ser excretado?
3. ¿Cómo adquiere esas características?
4. ¿Cuál es la estructura química del ácido acetil salicílico?
5. ¿Qué metabolitos vamos a cuantificar?
26
6. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de Trinder para la determinación de salicilatos?
 Práctica 4

Identificación de un xenobiótico y sus metabolitos

Introducción

Biotransformación es el término más aceptado en toxicología para nombrar a la suma de las

reacciones bioquímicas, que se llevan a cabo para transformar químicamente a un xenobiótico, 27
favoreciendo su polaridad y su excreción.
Este proceso es influenciado por factores tales como las propiedades fisicoquímicas del
xenobiótico, así como por las características intrínsecas del metabolismo de cada organismo.
El ácido acetilsalicílico (AAS) es un analgésico antipirético y antiinflamatorio, el cual se absorbe
fácilmente en el tracto gastrointestinal y se hidroliza en forma rápida y completa por esterasas
plasmáticas para formar salicilatos.
Su biotransformación se realiza en muchos tejidos, pero principalmente en el retículo
endoplásmico de los hepatocitos, siendo sus principales metabolitos excretados por vía renal.
En la orina humana se han encontrado los siguientes compuestos: ácido salicílico libre (10%),
ácido salicilúrico (50 - 75 %), éter glucurónido de o-hidroxibenzoilo (10 - 30 %) y éster
glucurónido de o-hidroxibenzoilo (10 %).
En esta práctica se llevará cabo la extracción, separación e identificación de los metabolitos del
AAS mediante el uso de disolventes orgánicos y de la técnica de cromatografía en capa fina.

Objetivos

• Extraer los metabolitos del AAS en muestras de orina.

• Separar los metabolitos del AAS mediante cromatografía en capa fina.
• Identificar algunos de los metabolitos del AAS por comparación con estándares de
referencia.

Material y reactivos
Material:
- 2 embudos de separación de 500 mL
- 1 probeta de vidrio de 25 mL
- 1 pipeta volumétrica de 5 mL
- 1 pipeta graduada de 10 mL
- 1 pipeta graduada de 1 mL
- 3 vasos de precipitados de 100 mL
28
- 2 vasos de precipitados de 250 mL
- 1 soporte universal
- 2 anillos
- Papel pH
- Cromatofolios de silica gel HF 254
- Baño María

Equipo:
- Parrilla
- Cámara para cromatografía en capa fina
- Lámpara de luz ultravioleta

Material biológico:
- Muestras de orina

Reactivos:
- Ácido acético glacial
- Ácido acetilsalicílico
- Ácido clorhídrico concentrado
- Ácido gentísico
- Ácido salicílico
- Etanol
- Éter etílico
- Hexano
 - Metanol
- Silicón
- Sulfato de sodio anhidro

Desarrollo de la práctica

• Preparar la mezcla de solventes: ácido acético glacial, hexano, éter etílico, metanol
29
(9:60:40:0.5), agregarla a la cámara y dejarla saturar.
• Colocar 100 mL de la muestra de orina en un embudo de separación y acidificar
agregando gota a gota ácido clorhídrico concentrado hasta un pH aproximado de 1.
• Agregar 25 mL de éter etílico, agitar cuidadosamente, abriendo la llave después de cada
agitación. Esperar a que se separen las fases.
• Pasar la fase inferior (acuosa) a otro embudo de separación y repetir el proceso de
extracción 2 veces más (3 extracciones en total). Recolectar la fase superior (orgánica)
de cada extracción en un vaso de precipitados de 250 mL.
• Añadir al vaso sulfato de sodio anhidro y agitar cuidadosamente.
• Decantar cuidadosamente a un vaso de precipitados de 250 mL y evaporar el éter etílico
hasta sequedad en baño María en la campana de extracción.
• Disolver el residuo en aproximadamente 1 mL de etanol.
• Aplicar sobre el cromatofolio de 2 a 4 gotas de los 3 estándares y la muestra por
duplicado de acuerdo a la siguiente figura:
• Introducir 2 placas por cámara y dejar que ascienda el solvente hasta que falte un cm
para cubrir toda la placa.
• Marcar el frente de solvente, dejar secar las placas y observarlas bajo luz ultravioleta,
marcando las manchas que se encuentren en cada carril.
 30

Análisis de resultados

• Calcular los Rf´s para cada metabolito dividiendo la distancia recorrida por cada muestra
desde su punto de aplicación hasta el centro de la mancha (frente de soluto), entre la
distancia que recorrió el disolvente en cada carril (frente del disolvente).
• Anotar los valores de Rf obtenidos para cada mancha en la tabla 1.
• Comparar los Rf´s de las muestras, con los obtenidos para los estándares.

Bibliografía

1. Principles and Methods of Toxicology. Hayes A.W. (ed.), CRC Press, Boca Ratón, 2007.
2. Repetto JM y Repetto KG. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos, Madrid,
2009.
Cuestionario

1. ¿Qué es la biotransformación?
2. ¿Cuáles son las fases de la biotransformación y en qué consisten?
3. Menciona los diferentes métodos que nos permiten separar, identificar y cuantificar los
metabolitos presentes en una muestra de orina
4. ¿Qué metabolitos del ácido acetil salicílico podemos encontrar en la orina?
31
5. ¿Cómo se van a identificar los metabolitos formados en la práctica?
 Práctica 5
Determinación de la dosis letal media (DL50) de un plaguicida en ratón

Introducción

En los estudios toxicológicos de rutina se somete a los animales de laboratorio a dosis,

concentraciones y tiempos de tratamiento variables, que ponen de manifiesto los efectos 32

producidos por el agente de prueba. Esto constituye la base fundamental de la evaluación

toxicológica e indica el órgano o sistema sensible, así como la naturaleza de la toxicidad,
evidenciando los cambios a seguir para profundizar en estudios posteriores.

Los efectos de los tóxicos son dependientes del tiempo de exposición, el tipo de toxón y la
concentración del mismo. Sin embargo existen diversos factores que pueden modificar la
respuesta tóxica producida por un xenobiótico, entre los que podemos mencionar al sexo,
especie, edad y estado patológico del individuo, entre otros.

Los ensayos de toxicidad aguda son aquellos que se llevan a cabo en una sola exposición del
toxón o bien múltiples exposiciones pero en un período de 24 horas y hasta 96 horas en
organismos acuáticos. La mayor parte de estos ensayos son diseñados para determinar la dosis
o concentración letal media (DL50 o CL50) del xenobiótico, la cual se define como: La estimación
estadística de una dosis o concentración única de un químico que produce la muerte al 50% de
los animales de experimentación. Este estudio permite además determinar el efecto tóxico de
una sustancia, los órganos o sistemas diana, así como el reforzamiento de las bases para
establecer las dosis de los estudios a largo plazo.

Los métodos generalmente usados para la realización de estudios de toxicidad aguda, están
basados en la relación dosis-respuesta o concentración-respuesta para un grupo de animales
de experimentación, en la cual está involucrada la relación entre la dosis o concentración y el
número de individuos que mueren como resultado de la exposición a un tóxico.
A partir de la revolución industrial, con el crecimiento de las zonas urbanas y su dependencia
de las zonas rurales en cuestión de alimentos, se requirió una mayor capacidad de producción,
almacenamiento y protección de éstos. Como resultado, la agricultura que hasta entonces había
sido principalmente de subsistencia, adquirió un carácter más industrial, originando la
fabricación de cantidades considerables de sustancias utilizadas para el combate de plagas.

Objetivo
33

• Determinar la dosis letal media (DL50) de un plaguicida en ratón (Mus musculis).

Material y reactivos

Material:
- Cánulas para administración oral en ratón
- Jeringas hipodérmicas de 1 mL, con aguja removible
- Jaulas para ratón
- Bebederos
- Aserrín
- Alimento para roedores
- Marcadores indelebles
- Balanza para ratones

Material biológico por grupo:

- 80 ratones de 20-25 g

Reactivos:
- Soluciones de plaguicida en un intervalo de concentración por definir, disueltas en aceite de
maíz y sus equivalentes en agua.
- Aceite de maíz
Desarrollo de la práctica

1. Marcar, pesar y distribuir aleatoriamente a los ratones en ocho lotes de diez animales cada
uno.

2. Administrar por vía oral la dosis de plaguicida asignada a cada lote.

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3. Observar a los animales durante las primeras 2 horas posteriores a la administración y
registrar la sintomatología presentada.

4. Transcurridas 24 horas, contar el número de animales muertos.

Resultados

1. Llenar la tabla 1 con los datos de mortandad obtenidos.

1. Trazar la curva con los resultados obtenidos tanto para ratones, relacionando el % de muerte
con el logaritmo de la concentración. Obtener la DL50 directamente de la gráfica.

2. Calcular la DL50 para ratones mediante el método de probits.

4. Registrar los cambios físicos observados en cada concentración de prueba y para cada
especie.

Tabla 1. Número de muertes y concentración.

Concentración/dosis Muertos (ratón)
% PROBIT
Bibliografía

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1. Principles and Methods of Toxicology. Hayes A.W. (ed.), CRC Press, Boca Ratón, 2007.

2. Peña C.E., Carter D.E., Ayala-Fierro F. Toxicología Ambiental: Evaluación de Riesgos y

Restauración Ambiental, Southwest Hazardous Waste Program, Arizona, 2001.

3. Repetto Jiménez M. y Repetto Kuhn G. Toxicología Fundamental. 4ª ed., Díaz de Santos,

Madrid, 2009.

4. Toxicología. Córdoba D. (ed.), 4a ed., Manual Moderno, Bogotá, 2000.

Cuestionario

1. ¿En qué consisten los estudios de toxicidad aguda?

2. ¿Qué información te proporcionan los estudios de toxicidad aguda?
3. ¿Qué es la dosis/concentración letal media?
4. ¿Qué es el LOAEL?
5. ¿y el NOAEL?
6. ¿Qué métodos existen para la determinación de la concentración/dosis letal media?
7. ¿Quéplaguicida usaremos en la práctica? Incluye en tu respuesta usos, características
y mecanismo de acción.
 Práctica 6

Evaluación de la toxicidad subletal producida por un herbicida sobre plantas, mediante

el uso de un biomarcador de efecto

Introducción

Un biomarcador es definido como una medición capaz de explicar o reflejar las interacciones
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entre los sistemas biológicos y cualquier riesgo potencial, es decir, un cambio en la respuesta
biológica (desde el nivel molecular, celular, fisiológica o de comportamiento) que puede estar
relacionado con la exposición a tóxicos dando por resultado, un efecto adverso en la salud del
organismo. Los biomarcadores se usan para evaluar tanto la toxicidad de un compuesto aislado,
como en aquellos organismos ambientalmente expuestos a mezclas de xenobióticos.
La Organización Mundial de la Salud propone tres divisiones en los biomarcadores:

a) Biomarcadores de exposición: Cubre la detección y/o cuantificación de cualquier sustancia

exógena o sus metabolitos en el organismo, derivada de una exposición previa.
b) Biomarcadores de daño: Incluye mediciones biológicas, fisiológicas o cualquier alteración
en el organismo que ponga en riesgo la salud por la exposición a tóxicos.
c) Biomarcadores de susceptibilidad: Son los cambios inherentes o adquiridos que pongan en
riesgo la salud o la integridad del organismo al tener contacto posterior con diferentes
toxones.

En los organismos vegetales una de las respuestas más frecuentes frente a los tóxicos es la
modificación en el contenido de clorofila, por lo que la valoración de su contenido en las plantas
expuestas puede ser empleado como un excelente biomarcador de efecto. La clorofila es uno
de los pigmentos fundamentales para el proceso de la fotosíntesis. Existen dos tipos principales
de clorofila, la a y la b, que se diferencian por la presencia de un grupo CH3 o CHO,
respectivamente, en uno de los anillos C4N. La presencia de este grupo funcional altera
ligeramente la estructura y energía de los dobles enlaces conjugados, dando lugar a espectros
de absorción distintos para cada tipo de clorofila. Así, la clorofila a en disolución alcohólica
presenta máximos de absorción en 430 nm y 662 nm, mientras que la clorofila b los presenta
en 453 nm y 642 nm. La posición exacta de estos máximos depende del disolvente que se
utilice.

Objetivo
• Evaluar los cambios producidos en el contenido de clorofila a y b por la exposición al 2,4-D
a concentraciones subletales sobre plantas.

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Material y métodos
Material por equipo
• 4 tubos de ensayo
• 1 gradilla
• 1 pipeta volumétrica de 10 mL
• 1 mortero
• 1 vaso de precipitados de 100 mL

Equipo
• Balanza analítica
• Espectrofotómetro uv/visible

Reactivos
• 4 plantas pequeñas (hierbabuena, perejil, cilantro, etc.)
• 2,4-D (0.001 mg/L, 50 mg/L y concentración de la presentación comercial)
• Etanol al 80%

Desarrollo de la práctica

• Se contará con 4 organismos de prueba que corresponderán a los siguientes grupos: 1)

testigo (sin herbicida), 2) grupo expuesto a una concentración ambientalmente relevante,
3) grupo expuesto a una concentración equivalente al LMP, NOM-127-SSA1-1994 y 4)
grupo expuesto a una concentración equivalente a la usada por la presentación
 comercial. Una vez etiquetados los organismos se agregará a cada uno 100 mL de la
solución correspondiente y se dejarán expuestos durante 120 h.

• Transcurrido el tiempo de exposición se tomarán 0.5 g de hojas de cada uno de los

grupos, se triturarán en un mortero con 10 mL de etanol al 80% y se macerarán hasta
obtener una solución uniforme y homogénea. Posteriormente se colocará el extracto a
un tubo de ensayo y se centrifugará a 5000 rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se
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leerá en un espectrofotómetro a 645 y 663 nm, usando etanol al 80% como blanco.

• La concentración de clorofilas se realizará mediante las siguientes ecuaciones:

Clorofila a = (12.7 x A663) – (2.69 x A645)

Clorofila b = (22.9 x A645) – (4.68 x A663)

Dónde: A645 = lectura de la absorbancia a 645 nm. A663 = lectura de la absorbancia a 663
nm.

Resultados

1. Calcular y graficar el contenido de clorofilas a y b expresado como µ/g tejido para las
tres concentraciones de prueba.
Tabla 1. Datos problema
Concentración de A A Concentración Concentración
prueba (mg/L) 645 663 de clorofila a de clorofila b
(μg/g) (μg/g)
Testigo
0.001
50
100
Bibliografía

1. Van der Oost, R., Beyer, J., Vermeulen, N.P.E. 2003. Fish bioaccumulation and
biomarkers in environmental risk assessment: a review. Environ. Toxicol. Pharmacol. 13,
57-149.
2. Pazmiño, P.D., Romero-Puertas, M.C., Sandalio, L.M. 2012. Insights into the toxicity
39
mechanism of and cell response to the herbicide 2,4-D in plants. Plant Signaling &
Behavior. 7:3, 425-427.

Cuestionario

1. ¿En qué consisten los estudios de toxicidad subletal?

2. Describe brevemente los tipos de ensayos subletales (en función del tiempo de
exposición)
3. ¿Qué información te proporcionan los estudios de toxicidad subletal?
4. ¿Qué es un biomarcador?
5. Describe brevemente los tipos de biomarcadores que existen.
6. ¿Qué tipo de biomarcador emplearemos en la práctica?
7. ¿Qué herbicida usaremos en la práctica y cuál es su mecanismos de acción?