Universidad Centroccidental

“Lisandro Alvarado”
Decanato de Ciencias de la Salud
Sección de Anatomía Microscópica
Asignatura: Biología Celular

GUÍA DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS

Barquisimeto, Abril 2017

DATOS GENERALES

Departamento: Ciencias Morfológicas

Sección: Anatomía Microscópica

Asignatura: Biología Celular y Molecular

Semestre: I

Profesores:
Alba Ibarra
Osbert Rosales

Preparadores docentes:
Freddy Torrealba
Michael Parra
Oriana Pacheco
Mario Gemmato

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I. INTRODUCCIÓN

APRECIADO(A) ESTUDIANTE

Te damos la bienvenida a las actividades prácticas de nuestra asignatura, Biología Celular.

Es muy importante que puedas recordar que las actividades prácticas de nuestra asignatura
tienen como objetivo principal que el estudiante integre sus conocimientos básicos morfológicos,
funcionales y bioquímicos, que sobre las células se han desarrollado durante las actividades
teóricas, de allí la importancia que el estudiante domine el contenido teórico a desarrollar en la
práctica a objeto de obtener una comprensión verdadera de lo observado.

II. ACTIVIDADES PRÁCTICAS Y EVALUACIÓN CONTINUA

Primer Bloque
Exámenes Pre-laboratorio Puntaje %
Microscopia Óptica 20.0
Microscopia Electrónica y Microscopía Fluorescencia 5.0
Técnica histológica de rutina hematoxilina y eosina y 5.0
técnicas especiales.

Segundo Bloque
Exámenes Pre-laboratorio Puntaje
Observación de Células I 12.5
Observación de Células II 12.5
Extracción de ácidos nucleicos 5.0

Tercer Bloque
Exámenes Pre-laboratorio Puntaje
Ciclo celular y mitosis I 10.0
Ciclo celular y mitosis II 10.0
Meiosis 10.0

Nota: Los exámenes pre-laboratorio versaran sobre los prerrequisitos de cada práctica, tendrán una
duración de 10 minutos y se realizarán dentro del horario, antes de comenzar las actividades
prácticas.

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 PRÁCTICA Nº 01
MICROSCOPIA ÓPTICA

I. INTRODUCCIÓN:

El desarrollo de la biología celular y molecular se produce en forma paralela a la invención de

instrumentos y técnicas biofísicas y bioquímicas que extienden los sentidos a nuevos límites y
acrecientan el conocimiento de la estructura y funcionamiento de la célula. El acceso a este tipo de
conocimientos resulta dificultoso pues las células son pequeñas y transparentes. El ojo humano no
logra distinguir objetos menores a 50 micras (µm) de diámetro ni consigue resolver dos líneas
separadas por menos de 100 µm (es decir, se ven como una sola línea). Se necesita del microscopio
óptico cuyo límite de resolución es de 0,2 µm y para estructuras más pequeñas, que midan entre 0,4
y 200 nanómetros (nm), se requiere del microscopio electrónico.

En esta práctica de Microscopia Óptica, es importante que reconozcas que el microscopio es la

principal herramienta de trabajo para el estudio de la célula y los tejidos. De aquí, que los primeros
conocimientos teóricos y prácticos de la Biología Celular deben estar dirigidos a conocer y utilizar
correctamente el microscopio óptico.

El microscopio es un instrumento básico para el estudio de la Biología, ya que nos permite

percibir detalles de organismos y estructuras que no podrían ser observados directamente, por
simple inspección ocular. Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de
aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se
comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon. La utilidad de cualquier
tipo de microscopio, no solo depende de su capacidad de aumento sino, más importante, de su
capacidad para resolver detalles. Para el estudio del material biológico se disponen de varios tipos
de microscopios, lo cuales se pueden clasificar básicamente de acuerdo al tipo de fuente luminosa
que usan, siendo el microscopio óptico de campo claro, de uso común.
Este es un microscopio compuesto que utiliza dos sistemas de lentes; el primero produce una
imagen amplificada del objeto, y el segundo agranda la imagen formada por el primero. Para formar
una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante
fina como para que el haz de luz pueda atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las
necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.

El microscopio compuesto de uso común también se conoce con el nombre microscopio óptico en
base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes ópticas. Está constituido por cuatro grupos
de dispositivos o sistemas articulados de tal manera que garantizan un funcionamiento óptimo y
ergonómico.

• Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes: pie o base, columna,
mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).

• Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución (objetivos y
ocular).

4
• Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y transmiten,
reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espécimen
(lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma).

• Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras
fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).
El campo del microscopio está intensamente iluminado, mientras que los objetos observados
aparecen más oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos
(100X), pudiéndose llegar, con ciertas modificaciones, a 2000 y 3000 aumentos (200 X-300 X).

Partes de un microscopio.

Trayectoria de la luz en el microscopio

El condensador proyecta un cono de luz sobre el espécimen que está siendo examinado en el
microscopio. Después de atravesar la muestra, ese haz luminoso, en forma de cono, penetra en el
objetivo y éste a su vez proyecta una imagen aumentada en el plano focal del ocular, que
nuevamente amplía dicha imagen siendo la que se percibe por la retina del ojo como una imagen
situada a 25 cm de la lente ocular. La ampliación total dada por un microscopio es igual al aumento
del objetivo multiplicado por el aumento del ocular.
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  Sistema óptico: El lente que se encuentra más cercano al espécimen se denomina objetivo,
tiene una distancia focal corta y, forma una imagen real y aumentada que es el objeto del
segundo sistema de lentes denominado ocular. El condensador tiene la función de condensar
la luz sobre el espécimen.

- Objetivo: Tomando en cuenta el grado de corrección de las aberraciones hay dos categorías de
objetivos para el microscopio, los objetivos acromáticos y los objetivos apocromáticos. En cada
categoría se distinguen aún dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersión

Los objetivos difieren entre sí por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la
lámina histológica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el
aire cuyo índice de refracción (n=1) es muy diferente del índice del vidrio porta y cubre-objeto
(n=1,5). Por el contrario, en los objetivos de inmersión el medio que separa al cubre-objeto de la
lente frontal del objetivo es un líquido cuyo índice de refracción es lo más próximo al del vidrio. Este
líquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor aún aceite de cedro, que posee un índice de
refracción (n=1,515) casi idéntico al del vidrio.

La ventaja de los objetivos de inmersión consiste en la disminución o eliminación de la refracción

de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen está
aumentada, mientras que en los objetivos secos, está disminuida. El empleo de la inmersión
aumenta el ángulo de apertura del objetivo y permite mayor resolución gracias a la captura de una
mayor cantidad de rayos luminosos refractados y solo puede utilizarse con objetivos de mayor
aumento (100 X).

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 Objetivos

Nomenclatura de los objetivos

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilíndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las
diversas lentes colocadas en serie y alineada. En la parte externa posee grabadas las
especificaciones y características.

Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromático que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b)
objetivo semi-apocromático o fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromático que
contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esférica frontal.
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 -.Ocular: Es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la
superior se denomina lente ocular (produce el aumento de la imagen real del objetivo) y la inferior
lente colectora (aplana y aclara el campo).

 Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen
del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo endereza la
imagen.

- Campo del microscopio: Se denomina campo del microscopio al círculo visible que se observa en
el ocular. También podemos definirlo como la porción del plano visible observado a través de las
lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es
inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo está determinada por el
diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el campo puede ser
cuadrado y esta forma es muy útil al realizar estudios de coprología o hematología, en donde se
requiere reconstruir la totalidad del campo de observación de la preparación, lo cual se dificulta con
un campo circular clásico al quedar zonas superpuesta.

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de

este aumento está inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o
25x. Otro valor es el número de campo que consiste en el diámetro en milímetros de la apertura fija
del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus características.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificación o medición de estructuras del
espécimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el número, tamaño o dimensiones de
las células y demás elementos del tejido.

Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio
con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece enfocada y superpuesta a la imagen del
espécimen al encontrarse en el plano de formación de la misma. Los oculares para la medición
poseen un mecanismo de enfoque mediante rotación. Se debe calibrar la escala de medición del
ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algún software de
computación para realizar mediciones sobre las imágenes digitales y obtener datos muy precisos, no
obstante, el método más económico y de uso más generalizado es la medición con los oculares.

En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre,

pestaña, cerda) denominada señalador, con la finalidad de indicar de manera específica alguna
estructura en particular en el campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura
que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.

Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte
colocar los ojos a la distancia correcta de observación y por otra, impedir la formación de reflejos
luminosos que dificulten la visualización. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo
de enfoque del ocular que ajusta las dioptrías en caso que el observador posea una disminución de
su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el
izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55
y 75 mm).

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Microfotografía de un frotis de sangre periférica en la que se observa un campo rectangular con una escala de divisiones
precisas, que en este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamaño de una célula se cuenta el número de
divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que
corresponde al tamaño de la misma. Si la célula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es
100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7µm. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2ª
ed.

Propiedades de los objetivos

- Escala de reproducción: Es la relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por
ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1.

- Poder de definición: Es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos

- Límite de resolución: Es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan
visualizarse por separado.

- Poder de resolución: Es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en
relación inversa con el límite de resolución.

Comparación entre límites de resolución del microscopio óptico, electrónico y ojo humano.
Las principales unidades de medidas usadas en biología celular son el micrómetro y el nanómetro.
Como se aprecia, las principales unidades de medida que se emplean corrientemente en
microscopia no son las de uso cotidiano. En la siguiente tabla se expresan aquellas unidades y sus
equivalencias:

Unidad Símbolo Equivalencia Utilización principal en citología

metro (m)
(M) (m)
Centímetro Cm 0,01 m Objetos macroscópicos a simple
Vista. Huevos grandes.

Milímetro mm 0,001 m Objetos macroscópicos a simple vista.

-6
Micrómetro μm 10 m Microscopía de luz (óptica)
Casi todas las células y organelas grandes
9
 -9
Nanómetro nm 10 m Microscopía electrónica.
Células, organelas, macromoléculas.
-10
Angstrom Å 10 m Microscopía electrónica. Métodos de
difracción de rayos X. Moléculas y
átomos.

 Sistema iluminación.

- Condensador: Concentra el haz de luz sobre el plano del espécimen que se encuentra en la
platina. Debajo de él se encuentra el diafragma que regula la cantidad de luz que llega al
condensador.
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con aperturas
mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento.
El condensador está conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina del
microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espécimen.

Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y también
producen aberraciones, sin embargo, éstas también pueden corregirse.

Tipos de condensadores de acuerdo al grado de corrección de aberraciones ópticas:

• Condensador de Abbe: Es el más simple, sin corrección de aberraciones y el más económico.

Compuesto de dos o más lentes. Puede llegar a tener una apertura numérica de 1.4 en modelos de
tres lentes. Se emplea para observación de rutina y con objetivos de modesta apertura numérica y
amplificación. Una de las ventajas es el amplio cono de iluminación que puede producir.

• Aplanático: Corrige aberraciones de esfericidad.

• Acromático: Corrige aberraciones cromáticas. Contiene tres o cuatro lentes corregidas para el azul
y el rojo. Este condensador es útil para observaciones de rutina con objetivos secos y para
microfotografía (blanco y negro o color).

• Aplanático-Acromático: Poseen el más alto nivel de corrección y es el condensador de elección

para microfotografía a color con luz blanca. Puede contener ocho lentes y su uso es óptimo con
inmersión y objetivos de mayor aumento.

El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada para
optimizar la intensidad y el ángulo de apertura. Cada vez que se cambia un objetivo se debe realizar
un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la apertura numérica del nuevo objetivo. A
menudo no es práctico utilizar el mismo condensador para un amplio rango de objetivos (2x hasta
100x). Para objetivos de bajo poder de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una
lente frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante un
mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercándolo o no a la platina donde está
colocado el espécimen.

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- Fuente de Luz: Es el bombillo que está ubicado en la parte inferior del aparato, en caso de no
poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (bombillo incandescente común) aproximadamente
a 30 cm.

- Diafragma o iris: Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe

permitir cambios en la apertura y con diámetros variables cuya finalidad es la de obtener conos
luminosos cada vez más estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los primeros diafragmas
consistían en un disco de metal con agujeros de diferente diámetro, el cual se rotaba según la
necesidad. Estos discos fueron substituidos por el iris, otro dispositivo más elaborado y con un
diseño que le permite cambiar de diámetro. La apertura del diafragma se regula en relación con el
tipo de objetivo que se esté utilizando. El diafragma o iris está pintado de negro con la finalidad de
eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminación del objeto.

 Sistema mecánico: Este sistema soporta al sistema óptico y aloja los elementos necesarios
para la iluminación y enfoque del preparado. Toda montura, por complicada que sea posee los
siguientes elementos: pie o base, mecanismo de enfoque (tornillos macro y micrométrico), la platina,
el revólver y el tubo del ocular.

- Pie: Brinda apoyo y estabilidad al aparato.

- Vástago o brazo: Soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico.

- Mecanismo de enfoque: Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se

coloca el espécimen o ya sea el revólver donde están colocados los objetivos, de modo que se
pueda centrar el punto focal del objetivo que se está utilizando es ese momento. Se logra mediante
dos mecanismos, primero uno rápido del tornillo macrométrico y segundo, otro lento del tornillo
micrométrico.

- Tornillo de ajuste macro y micrométrico: Provocan el desplazamiento del tubo o la platina

(según el modelo de microscopio) en sentido vertical, lo que contribuye a realizar el enfoque. El
movimiento rápido del tornillo macrométrico posee dientes que se engranan y producen un
movimiento tosco para lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de
poco aumento y para subirlos rápidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el
preparado histológico. El tornillo micrométrico por el contrario posee una graduación tal que cada
división de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm. Esta
disposición permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos, considerando el
número de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte más superficial y luego la más profunda.

El movimiento del tornillo micrométrico tiene una extensión de 5mm aproximadamente y está
limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los objetivos de mayor aumento.

- Tubo ocular: Soporta la porción óptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable,
cuyo interior está pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la formación de reflejos
y facilitar la observación. El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio
binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la microfotografía, hay un tercer
tubo accesorio, generalmente más largo y vertical que sirve para conectar una cámara fotográfica sin
necesidad de lente ocular.

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- Platina: Es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca el preparado a observar, tiene un
orificio central que permite el paso de luz y un vernier que posibilita la relocalización de los detalles
de interés.
Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijación e inmovilización de la lámina
porta-objeto compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro.
Este dispositivo permite el examen metódico y completo de la preparación al proporcionar un
desplazamiento hacia adelante o hacia atrás y de derecha a izquierda y viceversa.

- Otra pieza, el vernier (denominado así gracias al nombre de su inventor en 1631), también
llamado nonius, consiste en dos pequeñas reglas graduadas en milímetros cuya finalidad es la de
obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura
determinada en la preparación. En la práctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco
complicado anotar las cifras y más difícil aún colocarlas en las reglas y localizar la estructura en
cuestión. Además, estas cifras solo son válidas para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay
otros procedimientos más simples para tal fin.

- Subplatina: Soporta al condensador y se ubica por debajo de la platina.

- El revólver: Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que
permite el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento de rotación. El revólver está
constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los
objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que está colocado en la parte inferior del tubo. Puede
ser de diversas formas y de igual manera, alojar un número variable de objetivos (dos, tres, cuatro o
más).

- Accesorios del microscopio

Habiéndose familiarizado con la estructura y funcionamiento del microscopio óptico, hay que
considerar aquellos accesorios que conducen a una excelente práctica microscópica y que facilitan el
trabajo, haciéndolo más rápido y efectivo o ampliando las capacidades del instrumento. Dentro de las
actividades o posibilidades se pueden citar:

• Medir y cuantificar: Consiste en la micrometría (morfometría) aproximada de los especímenes

observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades (conteo de células,
núcleos, partículas), ángulos. Se emplean oculares de medición con retículos o gradillas en
combinación con micrómetros especializados, láminas calibradas, cámaras de conteo y el
vernier. En la actualidad se han desarrollado instrumentos para morfometría que emplean
tecnología digital y los datos obtenidos pueden ser transmitidos a un computador, permitiendo
así la automatización, el almacenamiento de los datos y la obtención de variables estadísticas
a partir de ellos.

• Dibujar: Dibujar las preparaciones microscópicas es una actividad de las más completas
precisas que permite obtener una representación fiel del espécimen en estudio tal y como el
observador la percibe y representa la suma de detalles que se observan al cambiar el plano
de enfoque, obteniéndose la sensación de relieve y profundidad. Se emplean las cámaras
claras y otros dispositivos para dibujar que están concebidos con una serie de espejos y
prismas que hacen coincidir en la retina o en una pantalla tanto el campo observado como el
plano en el cual se debe dibujar. Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen
observada al mismo tiempo que se dibuja con un lápiz.

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  Fotografiar: Las imágenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones científicas y
presentaciones con fines docentes y banco de datos. Se necesitan adaptadores para conectar
la cámara a un tubo semejante al tubo del ocular en microscopios trinoculares. Se emplean
desde las cámaras fotográficas clásicas hasta las cámaras digitales especializadas para
acoplar al microscopio y las cámaras fotográficas digitales de uso común. Actualmente la
fotografía clásica resulta complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido
desplazada por la fotografía digital que es de más fácil y práctica ejecución. Con las cámaras
digitales de alta resolución se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden
ser archivados en el computador para su posterior análisis y procesamiento.

 Filmar: La captura de imágenes en movimiento se realiza mediante cámaras de video

(digitales o no) que registran la actividad de especímenes vivos, células en cultivo, cámaras
de perfusión, dispositivos con motor y automatizados, entre otros, para la demostración y
análisis de procesos fisiológicos en videomicroscopía.

 Incrementar el contraste: Para facilitar la observación de especímenes con una estructura

particular y células vivas se emplean filtros, condensadores y otros dispositivos que
transforman al microscopio de campo claro en un instrumento para tal fin, lográndose la
microscopia fotónica especial (campo oscuro, contraste de fases, polarización, entre otras).

• Procesamiento de imágenes: Con el empleo del computador y de software especializados

para captura, administración y procesamiento de las microfotografías, en la actualidad se ha
llegado a nuevos niveles en facilidad de uso y sofisticación que simplifican la investigación
científica

Principios físicos aplicados al microscopio:

- Poder de penetración: Es la propiedad que permite la observación simultánea de varios planos

del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento.

- Distancia focal: Es la distancia de la lente frontal al preparado colocada en la platina, cuando está
enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo.

- Aumento total: Se debe notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento
total de la imagen que se observa es el producto entre el aumento del objetivo y el ocular. Ejemplo:
si se tiene colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y el ocular tiene un aumento de
10X, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400X.

- Apertura numérica (AN): Este valor corresponde a la capacidad de un lente objetivo de utilizar
más o menos los rayos luminosos para formar la imagen. Este valor se encuentra grabado en la
manga del lente, siendo de 0,25 para el objetivo de 10X, de 0,65 para el de 40X y de 1,25 para el de
100X.

AN = n x sen α

Donde, n es el índice de refracción del medio que atraviesa el haz y α es el ángulo de apertura.

- Poder y límite de resolución: El poder de resolución (PR) es la capacidad de un instrumento para

producir imágenes distintas de puntos situados muy cerca el uno del otro en el objeto. Depende de la
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longitud de onda (λ) de la luz utilizada y de la AN del objetivo utilizado. El límite de resolución (LR) es
la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales.
Viene dado por:

LR= 0,61* λ
AN
En donde 0,61 es una constante, λ es la longitud de onda de la luz utilizada y AN es la apertura
numérica del objetivo en uso.

El LR es el inverso del PR, de manera que cuanto mayor sea el poder de resolución de un
instrumento menor será el límite de resolución.

LR= 1_
PR

El máximo PR de un microscopio óptico es aproximadamente 0,15 μm, con lo cual puede deducirse
que para aumentar el PR de un instrumento o disminuir el LR, se puede:

- Disminuir λ

- Aumentar la AN

Consideraciones para el uso del microscopio óptico

- Imagen: Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se encuentra

siempre “cabeza abajo” y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en
sentido opuesto, estas características se encuentran siempre presentes en un microscopio óptico.

- Enfoque: El enfoque de una preparación se realiza de la siguiente manera:

1. Utilizando el tornillo macrométrico desplazar la palatina completamente hacia abajo.

2. Tomar el preparado (lámina portaobjeto con la muestra o corte histológico) y colocarlo sobre la
platina, teniendo en consideración que la lámina cubre-objetos quede dispuesta hacia arriba y
el objeto de estudio ubicado sobre el orificio de la platina.
3. Colocar el objetivo de menor aumento (2X, 4X ó 10X) ya que estos quedan siempre más
alejados de la platina y así evitar que topen el lente objetivo con la preparación.
4. Subir la preparación con el tornillo macrométrico hasta el tope siempre mirando por un lado
del microscopio para evitar que choque el objetivo con la preparación.
5. Mirando a través del ocular se empieza a bajar lentamente la platina hasta localizar el foco, es
decir donde la preparación se observa nítidamente y por último utilizando el tornillo
micrométrico se define la imagen.

NOTA: La mayor parte de los microscopios actuales están parafocalizados, lo que indica que al
quedar en foco la lupa, los demás objetivos quedaran también enfocados, y solo se requiere de un
pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver nítidamente la imagen en el momento que se
cambie de objetivo.

Empleo del objetivo de inmersión en aceite (100X): Se deben utilizar preparaciones teñidas
completamente secas. Para esto se pone una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción
que se va a examinar. Preferencialmente se deben utilizar aceites sintéticos que no se secan, en vez
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de aceite de madera de cedro que se seca rápidamente.

Determinación de la posición de los objetos observados: El círculo luminoso que se observa a

través del ocular se denomina campo microscópico y los objetos que se observan en él se pueden
localizar en relación con las manecillas del reloj.

Inversión de las imágenes: Las imágenes son invertidas por los lentes. De esta manera los objetos
que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte mas alta y
los objetos que se encuentran en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente
en el lado derecho.

Preparación de la muestra: Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos

con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir.

Observación microscópica: Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrir a:

- Preparación húmeda: Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos

entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente.

- Preparación fijada: Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de

agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se
colorean mediante diferentes técnicas. Éstas preparaciones se observan sin cubreobjetos y,
habitualmente, con objetivos de inmersión.

- Coloraciones: Son técnicas que permiten observar microorganismos y tejidos en función de la

capacidad de éstos para reaccionar (o no) con determinadas sustancias colorantes, de
acuerdo con su naturaleza química.

II. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe poseer conocimientos sobre:

-. Partes mecánicas del microscopio y sus funciones.

-. Partes ópticas del microscopio y sus funciones.

-. Principios físicos aplicados al microscopio, tales como apertura numérica, poder y limite de
resolución, aberraciones (cromáticas y esféricas) y aumentos.

-. Función de cada parte del microscopio óptico.

III. OBJETIVOS:

- Identificar las partes mecánicas, ópticas y sistema de iluminación de un microscopio óptico.

- Precisar la función de cada componente mecánico, óptico y de iluminación del microscopio óptico.
- Manejar el microscopio óptico, observando una lámina de un tejido preparado.
- Comprender los principios físicos aplicados al microscopio óptico.

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IV. ACTIVIDADES:

1. Identificar las diferentes partes de un microscopio óptico:

1.1 Mecánicas
- Pie o base
- Brazo
- Platina

- Tornillos macro y micrométrico

- Tornillo del condensador
- Tornillo de lente frontal

1.2. Ópticas:
- Ocular
- Objetivos secos y de inmersión

1.3. Sistema de iluminación:

- Condensador
- Fuente de luz
- Diafragma
- Mando del diafragma

2. Realice las siguientes actividades:

2.1. Observe un lente ocular, examínelo y precise el significado de los números que muestra su
superficie ocular.

2.2. Observe cada uno de los objetivos, comenzando por el de bajo aumento y realice la operación
anterior. Reconozca los números impresos en su moldura. Complete el siguiente cuadro,
considerando que lambda = 0.5 μm.

Tipo de lente Aumento AN LR

Objetivo
Aumento bajo

Aumento medio

Aumento alto

Inmersión

2.3. Mueva los tornillos macro y micrométrico y observe el grado de desplazamiento de la platina
o del tubo ocular. ¿En cuál es notoriamente visible?
______________________________________________________________________________

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 2.4. Con una mano mueva los tornillos macro y micrométrico y con la otra mueva el carro. Anote lo
que observa:
______________________________________________________________________________

2.5. Ahora encienda la fuente de luz. Coloque el condensador en su posición más alta. Abra
completamente el diafragma y en el microscopio que se pueda desplazar el lente frontal muévalo
utilizando el tornillo del condensador. Anote lo que observa:
______________________________________________________________________________

2.6. Mirando por el ocular con el objetivo de menor aumento, abra y cierre el diafragma. Anote lo
que observa:

2.7. Calcule el aumento total que puede lograr con cada uno de los objetivos de su microscopio.

OCULAR OBJETIVO AUMENTO TOTAL

3. Observación de la lámina Nº 73 correspondiente a un corte de páncreas, coloreada con

Hematoxilina-Eosina.
3.1. Constate que esté puesto en el objetivo de menor aumento.
3.2 Coloque la lámina con suavidad, con el cubreobjetos hacia arriba sobre la platina y sujétela
con las pinzas correspondientes.
3.3. Enfoque el tejido utilizando primero el tornillo macrométrico y luego el micrométrico.
3.4. Recorra el preparado utilizando los tornillos del carro.
3.5. Localice una estructura, dibújela y anote el aumento con el que observó.
3.6. Repita la operación con los otros aumentos.

4. Localización de una estructura utilizando los vernieres.

4.1. El vernier latitudinal muestra una escala de 0 a 85mm y el vernier longitudinal una escala de
90 a 130mm. Ambas escalas están acompañadas de una pequeña escala de 0 a 10mm. Para
precisar la ubicación de una estructura, previamente ubíquela en el centro del campo. El cero de
la escala pequeña determina la unidad en la escala mayor. En la figura, el cero se encuentra entre
el 36 y 37 para precisar las décimas que acompañan al 36, se debe identificar la línea de la escala
pequeña que coincida con cualquier línea de la escala mayor. En la figura, es la octava línea de la
escala pequeña. Por tanto, el valor latitudinal es de 36,7mm

17
 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48

4.2. Localice una estructura. Precise su ubicación en la lámina utilizando el vernier longitudinal y
latitudinal. Muévase a otro campo de la lámina e intente volver a la misma estructura poniendo
previamente los valores de referencia en lo vernier. Repita hasta lograr buenos resultados. Intente
con los otros objetivos.
Ejemplo:
Aumento 100 X; Lo=103,3; La=24,1

18
 PRÁCTICA Nº 02
MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA Y
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

I. INTRODUCCIÓN:

Espectrofotometría. Energía Electromagnética.

La espectrofotometría es una técnica analítica que consiste en medir la absorción o la transmisión de
luz de un compuesto. Esta técnica es muy útil en bioquímica debido a que permite realizar
numerosos estudios, entre los cuales se encuentran los siguientes: (1) identificación de un
compuesto desconocido a través de sus características del espectro de absorción en ultravioleta,
visible o infrarrojo; (2) determinación de la concentración de un compuesto conocido mediante la
absorción de luz de una o más longitudes de onda; y (3) medición de la aparición de un producto o la
desaparición de un sustrato durante el curso de una reacción catalizada por una enzima. La
absorción de luz ocurre cuando los electrones, de la molécula que absorbe luz, son promovidos a un
nivel de energía mayor, debido a que la frecuencia de la oscilación electrónica de la molécula es
exactamente igual a la frecuencia de la luz que irradia la molécula. La longitud de onda
correspondiente a esta frecuencia (λmáx) es aquella a la cual el compuesto absorbe más luz y está
determinada por la estructura de la molécula.

El fenómeno físico que subyace a la absorción de luz en varias regiones de la radiación

electromagnética se muestra en la tabla siguiente.

Región Rayos γ Rayos UV Visible Infrarrojo Microondas TV y Radio AM

X y Radio
Radar

Longitud 10-5 a 10-2 10-1 a 102 a 400 a 800 10-6 a 103 10-3 a 10-1 10-1 a 102 102 a
De onda nm 102 400 nm 105 metros metros metros
nm nm metros
Efecto
Sobre la Transiciones Vibración Giro y
Molécula nucleares Transiciones brotación spin
Electrónicas molecular
nuclear

Microscopía de Fluorescencia
La microscopía de fluorescencia fue descubierta en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se fundamenta
en que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es
estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayos luminosos.

La técnica más versátil y poderosa para la localización de proteínas dentro de una célula por
microscopía óptica es la emisión fluorescente de las células y la observación con el microscopio de
fluorescencia. En éste microscopio los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud
de onda, y un químico fluorescente, los fluorocromos, que son sustancias que tienen la propiedad de
emitir un fotón de una longitud de onda determinada, son excitados y emiten luz (fluorescente) a una
longitud de onda específica más larga.

La mayoría de los colorantes fluorescentes, o fluorocromos, emiten luz visible, pero algunos como la
19
indocarbocianina Cy5, los cuales son colorantes fluorescentes pertenecientes a la familia de las
cianinas que emiten luz desde el infrarrojo al ultravioleta (UV).

Las moléculas fluorescentes absorben luz de una dada longitud de onda y emiten luz de otra longitud
de onda, más larga. Si un componente de este tipo es iluminado a su longitud de onda absorbente y
visualizado a través de un filtro que sólo permita pasar la luz de longitud de onda igual a la de la luz
emitida, el componente aparece brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el color de la luz es
una propiedad característica de la molécula fluorescente utilizada.

Fluorescencia

La fluorescencia es un tipo de luminiscencia, en la que seguidamente a la absorción de la energía de

la luz, se produce una emisión de una longitud de onda mayor por un corto periodo de tiempo.

En los microscopios de fluorescencia modernos, solo la luz fluorescente emitida por la

muestra se usa para formar una imagen, la imagen observada es el resultado de la radiación
electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una
luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar solo la emisión secundaria deseada, se deben
colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usan para detectar
sustancias con autofluorescencia vitamina A o sustancias marcadas con fluorocromos.

Funcionamiento del microscopio de fluorescencia

La fluorescencia es uno de los fenómenos físicos más utilizados en microscopía biológica y

analítica, sobre todo por su alto grado de sensibilidad y especificidad.

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador que
solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta radiación es
reflejada por el filtro dicroíco o dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las
moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por fluorescencia) de una longitud de
onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro
dicromático y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de
la radiación de excitación.

20
Microscopio óptico para fluorescencia

Cubo de filtros de fluorescencia

21
 Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz incidente que
procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de
excitar al fluorocromo antes de incidir sobre la muestra. La luz emitida por la muestra (reflejada y
fluorescente) atraviesa un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del
fluorocromo. Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la
formación de la imagen. En este sentido, la microscopía de fluorescencia difiere de la microscopía
óptica convencional en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación. En el esquema se
sitúan los tres elementos característicos del microscopio de fluorescencia:

1. Primer filtro de corte o filtro de excitación. Es el filtro que selecciona la luz de la longitud de
onda incidente que se va utilizar para excitar la muestra. En el esquema está seleccionando la luz
de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul).
2. Espejo de ranuras ordenadas o espejo dicroico. Se trata de un espejo que tiene la
propiedad de reflejar la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En este caso
refleja luz de longitud de onda menor de 510 nm (por ello refleja la luz incidente azul) y deja pasar
la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz verde emitida por el
fluorocromo presente en la muestra.
3. Segundo filtro de barrera o filtro de emisión. Es el filtro que selecciona la luz de longitud de
onda fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda de 520 a 560 nm y elimina
la parte del espectro reflejado y permite visualizar el espectro de emisión correspondiente al
fluorocromo.

En el esquema los filtros que se han indicado serían los que emplearíamos en la fluorescencia
asociada al isotiocianato de fluoresceína, molécula fluorescente ampliamente utilizada en
microscopía de fluorescencia acoplada a anticuerpos.

Inmunofluorescencia

Consiste en conjugar colorantes fluorescentes con anticuerpos, exponiendo después este conjugado
a los anticuerpos o antígenos correspondientes en cortes histológicos, frotis de microsorganismos o
de células, o cultivos de tejidos en capas únicas, con la intención de visualizar la distribución de una
proteína o antígeno específico en células o secciones de tejido utilizando la especificidad de los
anticuerpos por su antígenos para dirigir marcadores fluorescentes a las biomoléculas dianas de
forma específica.

Antígeno: es una molécula capaz de producir una respuesta del sistema inmune adaptativo mediante
la activación de linfocitos. Esta definición amplía el concepto de antígeno más allá del concepto clásico
que definía antígeno como la sustancia que desencadena la producción de anticuerpos. Así dentro de
esta definición de antígeno se incluyen las moléculas que, previa presentación antigénica, son capaces
de desencadenar la activación de células T citotóxicas capaces de destruir las células diana sin la
participación de anticuerpos.

Anticuerpo: también conocidos como inmunoglobulinas, abreviado Ig, son glicoproteínas del tipo
gamma globulina. Pueden encontrarse de forma soluble en la sangre u otros fluidos corporales de
los vertebrados, y son empleados por el sistema inmunitario para identificar y neutralizar elementos
extraños tales como bacterias, virus o parásitos.

Microscopia de Inmunofluorescencia para detección de proteínas en células fijadas.

Los colorantes químicos como el bromuro de etidio, DAPI (4',6- diamidino -2- fenilindole), Azul de
22
Cromassie G-250, Rojo Ponceau, colorean los ácidos nucleicos o una extensa variedad de
proteínas. No obstante, a menudo los investigadores desean detectar la presencia y localización de
proteínas específicas. Un método muy utilizado con este propósito emplea anticuerpos específicos
unidos en forma covalente a los fluorocromos. Los fluorocromos utilizados incluyen la rodamina y el
rojo Texas, que emite luz roja, Cy3, que emite luz anaranjada y la fluoresceína que emite luz verde.
Estos fluorocromos pueden ser combinados químicamente con anticuerpos específicos purificados
para casi cualquier macromolécula deseada. Cuando un complejo de anticuerpo-fluorocromo se
agrega a una fracción celular o tisular permeabilizada, el complejo se unirá al antígeno
correspondiente, que luego emitirá luz cuando se lo ilumine con la longitud de onda de excitación,
una técnica denominada microscopía de inmunofluorescencia.

Técnicas de Inmunofluorescencia

Directa o primaria: Es una técnica que consiste en demostrar la presencia de un antígeno mediante
reacción directa con un anticuerpo específico marcado con colorante fluorescente. El anticuerpo es
obtenido a través de la inoculación del antígeno (glicoproteína, proteína) en un modelo animal
generalmente conejos y cabras.

Indirecta o secundaria: Un anticuerpo secundario marcado con un fluorocromo se utiliza para

reconocer un anticuerpo primario.
El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un portaobjetos los antígenos que
constituyen el sustrato conocido específico (células que contienen virus, Streptococcus piogenes,
Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, entre otros), sobre él se coloca el suero de quien se
sospecha la presencia de anticuerpos específicos, si la reacción es positiva habrá formación de un
complejo antígeno-anticuerpo no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado. Para la segunda
etapa previamente se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana marcada, que reaccionará con
el anticuerpo del complejo producido en la primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene así: de
una mezcla de varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas (anticuerpos), estas
globulinas son inoculadas a un organismo (conejos, cabras, chivos y llamas), el organismo producirá
anticuerpos humanos que se marcan con fluoresceína o cualquier otro de los fluorocromos. Este
23
anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en este
momento se puede considerar como un antígeno, dando reacción positiva de fluorescencia
solamente si en la primera etapa se produjo unión entre el antígeno fijado en la muestra y el
anticuerpo presente en el suero humano que estamos evaluando.

Aplicaciones:
-. La Inmunofluorescencia, como técnica, puede ser utilizada en cortes de tejidos, líneas celulares
cultivadas, células individuales y secreciones que contengan células en suspensión (por ejemplo
esputo) con la finalidad de analizar proteínas, glúcidos y moléculas pequeñas tanto de origen
biológico como no.
-. Es una técnica analítica (cuali- cuantitativa) en química y bioquímica.
-. Métodos inmunológicos de diagnóstico clínico de diferentes enfermedades cutáneas-
-. Procedimientos microscópicos en microbiología, genética, histología, histoquímica, biología celular
y molecular, biología del desarrollo, patología (sondas vitales, ensayos de viabilidad, indicadores,
-. Análisis poblacionales de células (citometría de flujo).
Diagnósticos de neoplasias.
Detección de virus, bacterias, hongos, parásistos.

Limitaciones:
Al igual que la mayoría de las técnicas de fluorescencia, un problema significativo con la
Inmunofluorescencia es el fotoblanqueo., es decir la pérdida de actividad puede ser controlada
reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, incrementando la concentración de
fluorocromo, o empleando fluorosforos más robustos que sean menos propensos al fotoblanqueo.

24
Ventajas:
-. Alta sensibilidad.
-. No es necesaria la esterilidad.
-. Se pueden obtener resultados rápidos.
-. No es necesario realizar cultivos.
-. Se puede identificar microorganismos específicos en un grupo mixto.
-. Determina la identidad de un organismo muerto.

Desventajas:
-. Es una técnica costosa.
-. Deber ser aplicada por un personal altamente especializado.
-. Los resultados no son 100% específicos.
-. Generalmente no son posibles los análisis in vivo

Microscopia Electrónica

El objeto de esta de técnica es la interacción de los electrones con la materia y la forma de

obtener información tanto estructural como de caracterización de defectos. En muchos sentidos, el
microscopio electrónico ME ofrece una solución ideal a los problemas que presentan los
microscopios ópticos es la longitud de onda (λ ~ 0.5 µm) que no pueden obtener resolución atómica
ya que dicha longitud de onda de la radiación incidente es demasiado grande. Con el ME se pueden
obtener electrones acelerados con λ asociada bastante menor de 1 Å, y por tanto se puede obtener,
al menos teóricamente, resolución atómica. Con las lentes adecuadas se puede transformar los
electrones difractados en la imagen real. Además de usarse para difracción e imagen, el ME tiene
otros usos.

El Microscopio Electrónico no es más que uno de los muchos aparatos cuyo fundamento es la
óptica electrónica. No hay posibilidad de estudiar la óptica electrónica sin enfrentarse con una de las
consecuencias aparentemente paradójicas de la física teórica moderna: la dualidad onda-corpúsculo,
cuando los electrones inciden como paquetes de ondas sobre los átomos de una muestra, las
colisiones pueden representarse, y a veces con gran precisión como colisiones del tipo bola de billar.
Sin embargo, Si la muestra contiene un cristal en una cierta orientación, los electrones deberán
representarse por ondas para dar cuenta de las reflexiones.
Un microscopio electrónico utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes
de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento
muy superior a los microscopios convencionales debido a que la longitud de onda de los electrones
es mucho menor que la de los fotones "visibles". Para un voltaje de 100 kV, la longitud de onda
asociada a los electrones es 0.037 Å (0.01 Å para 1 MV)

El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst, Max Knoll y Jhener entre 1925 y
1930, quienes se basaron en los estudios de Louis acerca de las propiedades ondulatorias de los
electrones. Un microscopio electrónico, funciona con un haz de electrones generados por un efecto
térmico-iónico por un cañón de electrones provenientes de un filamento (cátodo) que es
generalmente wolframio, y se monocromatizan acelerándolos a través de un potencial (E) en un
sistema sometido a vacío. Éste haz de electrones es acelerados por un alto voltaje y focalizados por
medio de lentes magnéticas (todo ello al vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los
25
electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce por un
conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una
pantalla sensible al impacto de los electrones que transfieren la imagen formada a la pantalla de un
computador. Los microscopios electrónicos solo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no
utilizan la luz, pero se le puede dar color a la imagen en el computador, su funcionamiento es
semejante a un monitor monocromático.

Con el microscopio electrónico se puede alcanzar una resolución de aproximadamente 40.000

veces más que el poder de resolución del microscopio de luz y 2 x 106 veces el poder de resolución
del ojo humano.

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos: Microscopía Electrónica de Transmisión.

TEM del inglés “Transmission Electron Microscopy” y Microscopía Electrónica de Barrido. SEM del
inglés “Scanning Electron Microscopy”.

SEM y TEM

26
Microscopio Electrónico de Transmisión (TEM).

En el campo de la física moderna es primordial entender el comportamiento tanto del haz de luz
como el de los electrones. El TEM no explora superficies, por el contrario el haz de electrones
incidente atraviesa la muestra o espécimen observado y la sombra da detalles finos o ultra-
estructurales que son capturados en una pantalla fosforescente con propiedades de emisión de luz,
ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada preparación de la muestra da lugar
a una excelente definición. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no
mayores de un par de miles angstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden
aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces.

Un esquema clásico de estos aparatos está representado en la figura que se anexa. Algunos
instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen dos, mientras otro grupo de
aparatos posee solamente una lente proyectora.

La fuente de electrones está constituida por un hilo de volframio o tunsgteno en forma de horquilla,
rodeado por una pantalla cilíndrica polarizada negativamente respecto al filamento. Después de
atravesar el ánodo conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz se pierden en las
paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa el diafragma del condensador.
La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa, como para variar la
abertura de iluminación relativa en el objeto.

Voltaje de Longitud de onda Limite de resolución

Aceleración (kV) (Å) teórico (Å)
10 0.122 (0.122nm) 3.7 (0.37nm)
20 0.086 (0.0086nm) 2.9 (0.29nm)
50 0.054 (0.0054nm) 2.1 (0.21nm)
100 0.037 (0.0037nm) 1.7 (0.17nm)
200 0.025 (0.0025nm) 1.3 (0.13nm)
500 0.014 (0.0014nm) 0.9 (0.9nm)
1000 0.009 (0.0009nm) 0.7 (0.07nm)
Relación del voltaje de aceleración, la longitud de onda del haz de electrones y el poder de resolución en el microscopio electrónico de
transmisión expresadas en kilovoltios (kV), angstroms (Å) y nanómetros (nm).

Partes y Funcionamiento

1. Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espécimen
(dependiendo del microscopio electrónico), creando una imagen aumentada.
2. Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las
lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones.
3. Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico.
Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer
un vacío casi total (operar a bajas presiones, típicamente en el orden de 10 - 4 a 10 - 8 kPa) en
el interior de un microscopio de estas características. La necesidad de esto se debe a dos
razones: primero, permitir una diferencia de voltaje entre el cátodo y tierra sin que se produzca
27
 un arco voltaico. Segundo, reducir la frecuencia de las colisiones de los electrones con los
átomos del aire a niveles despreciables.
4. Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para
registrar la imagen aumentada.
5. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una
computadora.

Preparación de las muestras

El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido libre de agua y
preservado en una matriz de resina.
Existen muchos caminos para la preparación de tejidos para TEM, pero los métodos son
básicamente los siguientes:

1. Fijación primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autolíticos.
Se realiza con glutaraldehido, cuya penetración es lenta, específicamente 1 mm de tejido es
atravesado en una hora por el glutaraldehido.
2. Lavado: normalmente se hace con un buffer que mantiene el pH fisiológico (7,2 a 7,4). Los
sistemas buffer más comunes son: fosfatos-collidine, tris-maleato y cacodylato.
3. Fijación secundaria: es llevada a cabo por la acción del tetróxido de osmio, el cual reacciona
principalmente con los lípidos. El tetróxido de osmio generalmente no penetra más de 0,5 mm en una
hora.
4. Deshidratación: La finalidad de la deshidratación es el reemplazo del agua usando etanol en
series 70-85-95% y etanol absoluto.
5. Infiltración: Es realizada con solventes transicionales y en el procedimiento hay gradualmente
transmisión de fluidos reemplazados por soluciones intermediarias altamente miscibles con los
agentes deshidratantes. La mayoría de los protocolos emplean un solvente transicional entre el
deshidratante y la resina.
6. Infiltración con resina: mezclas de propileno oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando
los espacios que ocupaba el agua dentro del tejido previo a la deshidratación.
7. Inclusión: Consiste en sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerización de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerización aumentando la
temperatura.
9. Inclusión de las muestras para TEM: las muestras se marcan con un trozo de papel indicando
algún tipo de convención que ilustre posteriormente su contenido.
10. Microtomía: los tejidos debidamente incluidos son cortados con el micrótomo, dependiendo del
tipo de micrótomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la más común)

28
 Posteriormente se realiza la coloración negativa con una solución de fosfotungstato de potasio
al 2% a pH 6,8. Para ello se coloca una gota del contrastante sobre el papel parafinado y luego la
rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella durante cinco minutos. Las rejillas se observan en un
microscopio electrónico de transmisión. Después del proceso de deshidratación en concentraciones
ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina. Se realizan cortes ultrafinos de 40 nm
que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo para su posterior observación en el
MET.

Algunas aplicaciones del Microscopio Electrónico de Transmisión:

• Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos.

• Realización de estudios de histoquímica e inmunohistoquímica para identificar compuestos

específicos.

• Reconocimiento de virus y sus características ultraestructurales.

• Estudios de citoquímica.

• Estudios de estructuras moleculares.

• Determinación de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.

• Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.

• Determinación del tamaño de partículas.

• Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

29
 Micrografías de MET

Microscopio Electrónico de Barrido (SEM).

En el Microscopio Electrónico de Barrido (SEM), un campo magnético permite enfocar los rayos
catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, para el examen de la superficie de las
estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos.

Descripción del Equipo

El SEM consta de las siguientes partes:

1. Cañón de electrones (e-).

2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB6.
3. Ánodo.
4. Columna de vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen el haz de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
30
11. Colector de electrones (electrones se atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía cinética de los electrones en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.

Funcionamiento:
La muestra es colocada en un pequeño espacio, al cual se le hace vacío después de cerrada la
puerta. La puerta tiene tres palancas que el operador usa para: subir y bajar la muestra, rotar la
muestra y acercarla o alejarla.

Un haz delgado de electrones, es producido en la parte superior del microscopio por medio del
calentamiento de un filamento metálico (10-30 KV). El haz de electrones primarios sigue un recorrido
a través de la columna de vacío del microscopio, esto, con el propósito, de evitar la dispersión de los
electrones. El trayecto del haz de electrones es enseguida modificado por un conjunto de bobinas
deflectoras que lo hacen recorrer la muestra punto por punto y a lo largo de líneas paralelas
(barrido), y a su vez atraviesa las lentes condensadoras o electromagnéticas que le permiten ser
reenfocado o centrado hacia la muestra.

Posteriormente, el diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes
objetivos que controlan la cantidad de electrones dentro de este. Cuando los electrones primarios
golpean la muestra, son emitidos electrones secundarios por el propio espécimen. Estos electrones
secundarios son atraídos por un colector donde se aceleran y se dirigen al escintilador, allí la energía
cinética es convertida en puntos de mayor o de menor luminosidad, es decir, en luz visible. Esta luz
es dirigida a un amplificador donde se convierte en señal eléctrica, la cual pasa a una pantalla de
observación en la cual la imagen es formada línea por línea y punto por punto. Los circuitos que
dirigen las bobinas de barrido (que obligan al haz a barrer la muestra), son las mismas que dirigen la
parte de colección de electrones y que producirán la imagen.

Resolución del Equipo: El SEM tiene un aumento de 20.000X y una resolución que puede llegar a
los 5nm 10nm y una profundidad de foco de 10 μm, mucho menor que el MET.
31
Preparación de las muestras: Se debe tener en cuenta el material a observar y guiarse por
parámetros específicos para cada muestra. Los siguientes pasos son utilizados en general y guían
acerca de lo necesario en cada uno.

1. Limpieza: se utiliza solución salina con el objetivo de remover contaminantes de la muestra. En

casos específicos como muestras como dientes y huesos es necesario limpiar la muestra con una
bomba de aire. Para epitelio intestinal se utilizan enzimas (quimiotripsina) que degradan el moco
intestinal. En esperma es necesario lavar con solución salina y posteriormente centrifugar
suavemente.

2. Relajación: se emplea cloruro de magnesio, cloretano, hidrato de cloral y anestésicos locales

como lidocaína con el objetivo de permitir que organismos marinos o de agua fresca, que utilizan el
encogimiento y extensión para movilizarse, no se contraigan y pueda observarse toda la superficie
de éste.

3. Fijación: es realizada con glutaraldehído, formaldehído, permanganato y acroleína con el

propósito de permitir que cese la actividad biológica de la célula y preservar la estructura celular.
Además mantener la integridad de la superficie y evitar cambios autolíticos, debido a que al haber
remoción del organismo se presentan cambios en temperatura, pH, concentración de oxígeno y
nutrientes.

4. Corte: Algunos especímenes no ameritan ser rebanados, pues se observará la superficie del
mismo

4. Deshidratación: Mediante varios métodos, pero uno de los más utilizados es el de deshidratación
por punto crítico en CO2, en el cual el agua pasa rápidamente de estado líquido a vapor sin
ebullición. La deshidratación por alcoholes (etanol) o acetona produce artefactos en el espécimen
por lo que es poco utilizada.

5. Secado: para este paso se emplea CO2 líquido y gaseoso (el CO2 a temperatura baja es líquido y
a temperatura alta es gaseoso) para remover totalmente el agua de la muestra. Cuando la muestra
sale deshidratada por el etanol, es colocada en el secador de punto crítico (SPC), allí, la muestra se
purga con CO2 líquido hasta que el etanol haya sido reemplazado. Posteriormente es sellada la
cámara y se calienta hasta que la temperatura se eleve a 31ºC, de esta forma el CO 2 líquido se
evapora y la muestra queda totalmente seca. Este procedimiento reduce de tamaño la muestra.

6. Montaje de la muestra: Esta fase se efectúa utilizando portaobjetos.

7. contraste o recubrimiento con oro (sputter) o grafito: se utiliza oro, paladio o carbono para
permitir que el Caz de electrones primarios choquen contra la muestra recubierta con un material
conductor para que estas sean eléctricamente conductivas.

8. Almacenamiento: es empleada una cámara libre de humedad con el propósito de mantener la

muestra totalmente seca para su posterior observación.

9. Observación y toma de micrografías.

32
Algunas aplicaciones de la Microscopía Electrónica de Barrido.

• Obtención de imágenes 3D

• Morfología de células y tejidos animales, humanos o vegetales.

• Morfología interna de células y tejidos.

• Morfología superficial de minerales.

• Formas de cristalización de minerales.

• Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.

• Estudio de moléculas.

• Reconocimiento de fósiles.

• Interacción de microorganismos con células eucariotas.

Micrografías de SEM

33
Diferencias entre los microscopios ópticos y electrónicos.

34
Comparación del microscopio óptico, MET y SEM

35
Formación de la imagen en los microscopios electrónicos

Los pasos básicos de la formación de la imagen en el microscopio electrónico, tanto de

transmisión como de barrido son:

1. Un haz de electrones se forma en el cátodo y es acelerado hacia el espécimen gracias a un

potencial eléctrico positivo.

2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes electromagnéticas.

3. En la muestra irradiada ocurren interacciones las cuales afectan el haz de electrones.

4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen.

5. La imagen es formada en un dispositivo (pantalla fluorescente, monitor de televisión, placa

fotográfica).

Representación esquemática del sistema óptico del microscopio electrónico de transmisión, en el cual se
aprecia un proceso de aumento en tres etapas y la formación de la imagen.

36
Esquema que muestra de manera simplificada la formación de la imagen en el microscopio electrónico de transmisión

Esquema que muestra de manera simplificada la formación de la imagen en el microscopio electrónico de barrido

37
 Interpretación de las micrografías electrónicas:

Con el empleo de técnicas más recientes como inmunofluorescencia y microscopía confocal

muchas estructuras presentes en la célula han sido estudiadas, corroborando su aspecto
morfológico observado previamente en las micrografías electrónicas.

El contraste observado en las micrografías electrónicas de transmisión depende de ciertas

propiedades del espécimen, del sistema óptico del microscopio y de las condiciones de
iluminación y reproducción fotográfica.
Las regiones del espécimen que contienen metales pesados empleados en la obtención del
preparado, aparecen como regiones oscuras (electron-densas) debido al poder que poseen los
átomos del metal pesado en dispersar los electrones que inciden sobre la muestra. Las regiones
del espécimen (por ejemplo cristales) que poseen una mayor densidad aparecerán más oscuras
que las regiones vecinas amorfas. A mayor cantidad de metal depositado, mayor
electrondensidad, lo cual permite un marcado contraste, el cual es revelado en una amplia gama
que va desde el negro, pasando por los tonos de gris hasta llegar al blanco; esto último
representa las zonas en las que no se depositó el metal. Variaciones en el espesor del
espécimen afectan la interpretación debido a la superposición de elementos; a mayor espesor,
mayor contraste, de allí que el espesor del corte debe ser mínimo (alrededor de 100 nanómetros).

Los cortes son colocados en una rejilla (portaobjeto) de cobre revestida de una película
plástica y este material puede incrementar la granulosidad en la imagen y puede interferir
seriamente con el contraste de la micrografía.

Las micrografías electrónicas de barrido muestran una imagen 3D (tridimensional) del

espécimen analizado. En la micrografía las zonas más oscuras corresponden a los planos más
profundos y las zonas más claras a los planos más superficiales del espécimen, a partir de los
cuales se originó una mayor cantidad de electrones secundarios. Al componerse la imagen de
zonas claras y oscuras se puede apreciar el relieve y las depresiones, que en conjunto,
conformarán el aspecto tridimensional.

Microfotografía electrónica de una mitocondria al Microscopio electrónico de transmisión. Las zonas más oscuras son
denominadas electron-densas y las zonas claras son denominadas electron-lúcidas. Nótese la variada electrondensidad,
la cual depende del grado de afinidad de las estructuras por los metales empleados para el contraste. Aumento 60.000x.
38
 Limitaciones de la Microscopia Electrónica.

1. El limitado diámetro de la apertura no permite que la información detallada alcance la

imagen, limitando de este modo la resolución.

2. El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe

al contraste de difracción, provocado por la pérdida de electrones del haz. Es un contraste
dominante en especímenes gruesos.

3. El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al

contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las
porciones del haz. Es un contraste dominante en especímenes finos.

4. Existen también distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmática, esférica y
cromática

5. El problema de la función de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta

de un sistema óptico a una imagen descompuesta en ondas cuadráticas.

6. El material biológico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vacío y la

transferencia de energía. Para resolverlos, se utilizan distintas técnicas dependiendo del
tamaño de la muestra:

Para muestras grandes como órganos, tejidos o células, se utilizan tres técnicas:

a) La fijación química o la criofijación

b) La inclusión en resinas (criosustitución)
c) La réplica metálica.

Para muestras pequeñas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes técnicas

a) La tinción negativa: los agentes de tinción más usados son el molibdato amónico, el
fosfotungstato sódico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las
siguientes propiedades: interactúan mínimamente con la muestra y son estables en la
interacción con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad
que favorece el contraste, tienen alto punto de fusión, tienen un tamaño de grano pequeño.

b) La réplica metálica: para construir la réplica metálica se evapora el metal (estaño) que se
deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vacío, se disuelve.

39
II. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe poseer conocimientos sobre:

- Bases físicas del microscopio electrónico y de fluorescencia, técnicas de rutina en microscopía

electrónica (ME) y de fluorescencia.

- Preparación de mezclas y las medidas lineales utilizadas en microscopia electrónica.

- Principio físicos aplicados al microscopio electrónico y de fluorescencia, tales como: apertura

numérica, poder y limite de resolución, aberraciones y aumentos, longitud de onda de excitación y
emisión, fluorocromos.

III. OBJETIVOS:

- Reconocer e interpretar micrografías electrónicas.

- Aplicar las medidas lineales reales a varias micrográficas electrónicas.

- Discutir con el docente los pasos a seguir en el procesamiento de las muestras para ME y
Microscopía de Fluorescencia.

- Identificar las diferentes partes mecánicas y ópticas de un microscopio de fluorescencia.

- Precisar la función de cada componente mecánico y óptico de un microscopio de fluorescencia.

-. Discutir algunas aplicaciones biomédicas de la microscopía de fluorescencia.

IV. ACTIVIDADES:

1. Observe las micrográficas electrónicas incluidas en unas carpetas, identificando las

ultraestructuras celulares observadas.
2. Mediante una plantilla de una regla especial utilizada en ME calcule las dimensiones de las
diversas ultraestructuras indicadas en las micrográficas electrónicas.
3. Comparar las observaciones al microscopio óptico de un corte grueso de Epon (técnica ME) con
uno de parafina (técnica MO)

V. ANEXO.

Unidades lineales

- Micra: μm
- Nanômetro: nm
- Angstrom: Aº

Conversiones

- 1 mm = 1.000 μm 1 μm = 0,001mm
- 1μm = 1.000 nm 1 nm = 0,001 μm

40
-1nm = 10 Å 1Å = 0,1 nm
1Å = 0,0001 μm
1Å = 0,000000 1mm

.
Aplicación:

El nanómetro y el Angstrom son empleados a nivel molecular o supramolecular:

Ejemplo: a. Molécula de mioglobina: 45 Aº x 35 Aº x 25 Aº

b. Ancho de DNA: 20 Aº

La micra (micrómetro) es usado para organelas celulares:

Ejemplo: a. Mitocondria esférica puede medir 2 μm (ME)
b. Núcleo esférico puede medir 10 μm (MO).

VI. EJERCICIOS.

- Convertir 0.035 micrómetros en nanómetros ___________________________________

- ¿Cuántos Ángstrom son 0,20 micrómetros? ____________________________________

- Expresar 679 nanómetros en micrómetros ______________________________________

- Convertir 703 Angstrom en milímetros __________________________________________

- Transformar 8 centímetros en micras ___________________________________________

- A cuánto equivalen 120 micras en Angtrom _____________________________________

- Represente 4 centímetros en nanómetros ______________________________________

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 PRÁCTICA Nº 03
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS DE RUTINA Y ESPECIALES.

I. INTRODUCCIÓN:

Sabemos en la actualidad que se pueden encontrar células de una enorme variedad de

tamaños y formas, que representan su adaptación evolutiva a distintos ambientes o a diferencias
funcionales especializadas. El tamaño de las células oscila entre unas pocas décimas de micra
hasta las de algunas algas marinas y yema del huevo de ave, con dimensiones de centímetros.
Entre estos dos extremos, encontramos que la mayoría de las bacterias miden un par de micras,
los glóbulos rojos humanos tienen dimensiones alrededor de 8 micras y que la mayoría de las
otras células humanas caen dentro del rango de 6 a 20 micras.

Algunas células, como las amebas y leucocitos cambian frecuentemente de forma, otras como
las células nerviosas y la mayoría de las vegetales, poseen una forma típica que es más o menos
específica para cada grupo celular.

Además de la variedad de formas y tamaños, las células varían debido a la complejidad de su

organización interna. Al respecto podemos distinguir células procarióticas, que comprenden todas
las bacterias, las algas verdes-azuladas y el orden de hongos actynomycetales; se caracterizan
por presentar un solo cromosoma, carecer de organelas como por ejemplo mitocondrias, retículo
endoplasmático y lisosomas, como secuencia de esto último, el contenido nuclear se encuentra
en contacto con el citoplasma. Por otro lado, tenemos un tipo celular más desarrollado, las
células eucariotas que a diferencia del nivel de organización anterior, poseen un núcleo
delimitado por una envoltura nuclear y organelas membranosas. Este tipo de células constituyen
otros tipos de algas, el resto de los hongos, protozoarios, vegetales y animales.

La mayoría de las descripciones anteriores son el resultado de observaciones realizadas con

el microscopio óptico y electrónico. Al respecto se han ideado varios métodos que permiten el
empleo directo del microscopio para el estudio de las características estructurales, químicas y
metabólicas.

Los métodos de preparación para las observaciones microscópicas de las células pertenecen
a dos grupos: métodos de observación directa de las células vivas y métodos empleados con
células muertas (fijadas).

La técnica para la observación de células vivas nos muestra células sin deformaciones
artificiales provocadas por la técnica de coloración, dándonos información valiosa acerca de
tamaño, contorno y la forma celular. Además, si consideramos que las células vivas son
entidades dinámicas que se mueven y cambian continuamente, podemos obtener información
acerca de la dinámica celular, tal como movimiento celular, ingestión de partículas extrañas y
división celular. Sin embargo, su empleo tiene limitaciones tales como su actividad por períodos
breves y la carencia relativa de color del material biológico.

La técnica más corriente para estudiar histología es emplear cortes, que son preparaciones
más o menos permanentes, permitiéndonos observar con mayor nitidez estructuras celulares. Sin
42
 embargo, nos proporciona una información “instantánea” de la dinámica celular y puede introducir
artefactos (aspectos deformes y equívocos) producto de las técnicas de fijación y coloración.

Técnicas para el estudio de las células:

Cultivos celulares:

El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX,
como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones
sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un
experimento. Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los
cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento. Después se
realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento
celular en cultivo ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una
explosiva expansión en esta área desde los años 50 (Morgan, 1995).

El cultivo de células tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en 1866, mantuvo vivas
células sanguíneas de anfibio, pero fue la utilización de bloques de agar con plasma coagulado
(soporte y alimento) el inicio del cultivo de células in vitro (Freshney, 1987).

El desarrollo del cultivo de células de vertebrados se inició con las observaciones de Roux
(1885), en cultivos de células de embrión de pollo; posteriormente Harrison (1907), cultivó tejido
nervioso de rana el cual más adelante fue reemplazada por plasma de pollo (Burrows, 1910);
posteriormente, se aplicó esta técnica para el estudio en animales de sangre caliente (Carrel, 1912).
Una serie de innovaciones como el desarrollo de medios de cultivo (Eagle, 1955), el uso de
antibióticos, las técnicas de tripsinización para el pasaje de células (Moscona y Moscona, 1952) y la
suplementación del medio con suero fetal bovino, permitieron el desarrollo y aplicabilidad de los
cultivos de células de origen vertebrado. El empleo de técnicas de fusión celular (Barski, 1960;
Littlefield, 1964) estableció las bases de la genética de células somáticas para el análisis de especies
animales (incluyendo al hombre); igualmente la técnica de anticuerpos monoclonales (Kohler y
Milstein, 1975) ha permitido estudios en inmunología y su aplicación a nivel terapéutico. En la
actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y
organismos diferentes. En un principio, el objetivo principal era el estudio de las propias células,
cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuándo dejan de crecer. Este tipo de
estudios tiene hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre el
ciclo celular, el control del crecimiento de células tumorales, modulación de la expresión genética y
en el área de la biología del desarrollo.

Los esfuerzos para explicar cómo el gran número de células presentes en los organismos
maduros derivan de una sola célula a partir de la fertilización han llevado a la búsqueda de modelos
experimentales. El cultivo celular es muy adecuado como modelo para el estudio del desarrollo y la
diferenciación, por lo que las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro
son objeto de un intenso estudio. Por último, hay cierto tipo de investigaciones que no pueden
realizarse sin el cultivo de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, conduce a que
organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular
para la inserción de genes extraños en las células receptoras. Así mismo, la tecnología de la fusión
celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido
diseñadas para sustituir a la metodología in vivo (Cohen, 1995).

43
Microscopía:

Microscopio óptico:

Observación sin coloración: Los organismos unicelulares y a veces las células libres de
organismos complejos pueden estudiarse directamente con el microscopio mientras están vivas, sin
el empleo de colorantes que puedan tener efectos tóxicos sobre las células. Debido a que las células
sin teñir son incoloras y las estructuras carecen de contraste, al usar el microscopio óptico
convencional podemos aumentar el contraste cerrando el diafragma o bajando el condensador.

Coloraciones supravitales: Son las técnicas de coloración empleadas para células vivas, en estos
procedimientos los colorantes empleados penetran a las células sin provocar grandes trastornos.
Como ejemplo podemos mencionar la coloración de las mitocondrias con verde de Jano y de los
lisosomas con rojo neutro.

Microscopios especiales: Las células vivas pueden ser observadas con microscopios de contraste de
fases, microscopio de interferencia, microscopio de polarización y microscopio de fluorescencia.

Técnica histológica de rutina (Hematoxilina-Eosina).

La técnica histológica es el conjunto de procedimientos aplicados para preservar la estructura

de células y tejidos, a fin de observar una preparación microscópica que permite su examen con un
microscopio óptico. Si bien existen técnicas para el estudio de células vivas, en muchos casos es
necesario interrumpir los procesos vitales para hacer posible su estudio microscópico. El conjunto de
técnicas de preparación indispensables para el estudio de los tejidos normales es el mismo que se
utiliza para el análisis de tejidos patológicos.

Los pasos seguidos para la técnica histológica de rutina H-E son: toma de muestra, fijación,
inclusión, corte, tinción y montaje.

1. Toma de muestra: Es la obtención del material biológico a ser procesado, para lo cual es
necesaria la manipulación delicada para evitar su deformación. La muestra puede obtenerse de un
individuo vivo (biopsia) o de un cadáver (necropsia).

2. Fijación: Es el procedimiento destinado a preservar la estructura y composición química de la

célula, lo más cercano a su estado vivo, se trata de utilizar soluciones químicas que minimicen las
alteraciones estructurales y químicas que normalmente se producen como consecuencia de la
muerte celular.

Mecanismo de acción: La mayoría de los fijadores precipitan las proteínas, para que el aspecto
celular no se modifique. Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo, o el organismo
muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis (acción de enzimas intracelulares) y
descomposición (acción bacteriana). Además, el procesamiento histológico posterior del tejido para
poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodología que puede
degradar las estructuras tisulares. Así, los fijadores deben proteger frente a ataques bacterianos,
evitar autolisis, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y
retracciones tisulares, penetrar y modificar el tejido para poder llevar a cabo tinciones específicas
posteriores, si es necesario.

La desventaja de éste mecanismo de acción molecular, es que puede extraer sustancias químicas
44
vitales para los estudios histoquímicos por ejemplo, el glucógeno de las células hepáticas, en este
caso esto se obvia eligiendo otra solución fijadora. El fijador comúnmente usado en preparaciones
para microscopia óptica (MO) es el formol o formalina, la cual reacciona con los grupos amino y
carboxilo de las proteínas.

Características de un fijador:
- El fijador penetra por difusión al corte de tejido, lo cual depende de varios factores: capacidad
de penetración del fijador, grosor del tejido (0,5 cm para MO y 0,5 mm para ME), proporción
volumétrica fijador versus tejido (óptimo 40/1).
- El pH del fijador es una de las constantes que debe mantenerse dentro de un rango muy
estrecho para mantener las propiedades de las moléculas. Para obtener un fijador con pH
óptimo se usan buffer o amortiguadores que tiene la propiedad de mantener un pH en un
rango determinado.
- La solución fijadora debe tener una osmolaridad adecuada con respecto al tejido que se
estudiará, es decir, la solución fijadora debe tener una concentración muy similar a los líquidos
que bañan los tejidos y esto evita deformaciones de las células.
- Hay dos formas de aplicar la solución fijadora, la inmersión que consiste en sumergir el tejido
por un determinado tiempo y la perfusión que consiste en hacer circular la solución fijadora
por los vasos sanguíneos de un animal anestesiado, es un procedimiento que fija in situ.
- Algunos fijadores utilizados son:
En MO: formaldehido, alcohol etílico, ácido acético, ácido pícrico y cloruro de mercurio.
En Microscopía Electrónica: glutaraldehído, tetróxido de osmio, paraformaldehído y
permanganato de potasio.

3. Deshidratación: Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una
serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor concentración de un agente deshidratante,
por ejemplo, Alcohol Etílico comenzando con solución al 70%, luego 80%, 96 %, alcanzando de
manera paulatina el alcohol al 100% para eliminar el agua. Esto se hace porque si se colocara el
tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se
deformaría.

4. Clarificación: Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución que es miscible tanto con el
alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio
de inclusión parafina líquida). La sustancia comúnmente empleada como medio de aclaramiento es
el Xileno o Xilol, aunque también se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo. La muestra de
tejido se coloca en un recipiente con Xilol, el cual solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama
clarificación ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su
índice de refracción.
NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos.

5. Inclusión en parafina: A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser
observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de
consistencia firme. La sustancia corrientemente usada para este fin es la parafina.
Los propósitos de la inclusión son:
- Distinguir las células superpuestas en un tejido.
- Tener un objeto lo suficientemente rígido para su manejo y corte.

La inclusión se logra al infiltrar la parafina en estado líquido al tejido, para esto, por lo general se
coloca la muestra en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60ºC, colocando la muestra
45
en una estufa durante 30-60 minutos ó 20 horas según la naturaleza y dimensiones de la muestra
manteniendo la temperatura a 60ºC.
Debido al calor, el xilol se evapora y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora
ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de
papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un
bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.

6. Microtomía: se realiza con un instrumento de precisión llamado micrótomo, a fin de obtener

cortes muy delgados (8 a 10μm) y uniformes que permitan visualizar estructuras muy pequeñas.
Para realizar los cortes para su estudio por microscopía óptica se utilizan cuchillas de acero.

7. Montaje del corte sobre un portaobjetos: los cortes se depositan en la superficie de un

recipiente con agua y luego se montan sobre un portaobjetos y se dejan secar.

8. Desparafinación: para permitir la penetración de los colorantes, que en su mayoría están en

solución acuosa, la muestra se trata con Xilol para desparafinar.

9. Hidratación: luego es pasada por alcohol en concentraciones decrecientes 100%, 90%,80%, 70,
%, agua de chorro).

10. Coloración: el uso de colorantes es necesario porque el contraste de los tejidos es insuficiente
para su observación con un microscopio común. Los colorantes tienen grupos químicos que le
otorgan propiedades iónicas al colorante, los cuales se pueden clasificar en colorantes básicos
(catiónicos) por la presencia del grupo amino (-NH2), como la hematoxilina, y colorantes ácidos
(aniónicos) por la presencia del grupo carboxilo (-COOH), por ejemplo, la eosina. El método de
coloración convencional más utilizado en histología e histopatología se conoce como Hematoxilina-
Eosina. La hematoxilina es un colorante básico que tiñe los componentes ácidos de los tejidos; por
ejemplo, los núcleos celulares, por su contenido de ADN, se observa de color azul-violáceo. La
eosina es un colorante ácido, que tiñe los componentes químicamente básicos de los tejidos; por
ejemplo, el citoplasma de distintas tonalidades de rojo. Luego de pasar la muestra por cada
colorante, se debe lavar con agua.

10. Deshidratación: Debido a que el medio de montaje no es miscible con el agua, ésta se debe
eliminar mediante inmersiones del portaobjetos con el corte histológico en soluciones de alcohol que
van de menor a mayor concentración 70%, 80%, 90%,100 %).

11. Clarificación: Los reactivos utilizados (xilol o benceno), además de eliminar el alcohol, facilitan la
penetración de la resina del medio de montaje y otorgan transparencia al corte del tejido.

12. Montaje del cubreobjetos: A fin de obtener una preparación permanente, el corte se cubre con
un vidrio delgado, adherido con un medio de montaje natural (bálsamo de Canadá, permount o
martex).

Artefactos de la técnica: Son alteraciones que se producen por fallas en alguna etapa da la técnica
citohistológica y que se reflejan en la preparación microscópica. Defectos en la fijación, la
deshidratación, y la inclusión pueden ser causas de desgarre y retracción en los tejidos, que llevan a
la aparición de espacios que no tienen existencia real. Así mismo si la acidez del formol no se
neutraliza, pueden aparecer gránulos coloreados por interacción del ácido fórmico con sustancias
como la hemoglobina, Igualmente, durante la sección con el micrótomo pueden aparecer rayas
producidas por melladuras de la cuchilla. También, si el corte no se extiende perfectamente sobre el
46
portaobjetos, puede haber pliegues y arrugas. Los defectos por la coloración pueden ser provocados
por la calidad y preparación de las mezclas colorantes o por una fijación insuficiente. Es importante
saber discriminar los artefactos de la técnica de las estructuras normales en una preparación
microscópica, ya que de lo contrario se pueden comenten errores al momento de la descripción o
diagnóstico.

TÉCNICAS ESPECIALES:

Las técnicas especiales de coloración o técnicas citoquímicas proporcionan información química

localizada sobre la célula o tejido en estudio. Además son muy específicas y proporcionan datos
cualitativos, por lo cual permiten obtener resultados analíticos y funcionales más completos que las
técnicas empíricas. No son coloraciones como tal sino más bien reacciones fisicoquímicas cuyo
producto final es coloreado, con lo cual se identifica y localiza un compuesto o su actividad en la
célula o tejido observado. Los siguientes son ejemplos de éste tipo de técnicas.

1. Lámina de hígado teñido con Carmín de Best:

El Carmín de Best es una técnica útil para demostrar la presencia de glucógeno y es

frecuentemente empleado para teñir los depósitos del mencionado polisacárido, en especial los
existentes en las células del hígado llamadas hepatocitos. Producto de la técnica el glucógeno se
tiñe de un color rojo intenso.

El Carmín, en forma de ácido carmínico, se extrae de un insecto (Dactylopius coccus) y se

precipita con aluminio. En la preparación de la solución de Carmín de Best se utilizan el ácido
carmínico (Carmín), cloruro y carbonato de potasio e hidróxido de amonio. La solución de hidróxido
de amonio proporciona un pH entre 10 y 11 a la solución para ayudar a reducir las uniones
electrostáticas del Carmín con el tejido, además de servir como solvente para el ácido carmínico. Las
sales de potasio se utilizan para inhibir la acción de cualquier otro colorante no específico para la
técnica, mediante la formación de puentes electrostáticos entre el carmín y las proteínas básicas del
tejido. Producto de todo lo anterior, químicamente solo se presenta el establecimiento de puentes de
H entre los grupos OH del glucógeno y los átomos de H del ácido carmínico.

Este método es más selectivo que especifico, puesto que puede teñir también algunas mucinas y
fibrinas de color rojo suave. En esta técnica los núcleos se tiñen de azul, ya que se suele emplear la
hematoxilina para ese propósito.

2. Lámina de extendido vaginal

La citología exfoliativa estudia las células que normalmente se desprenden de un epitelio, que
pueden ser recogidas mediante un suave raspado de la superficie del mismo. Los propósitos de esta
técnica citológica en el campo de la ginecología son: detectar lesiones malignas (cáncer), aún
cuando la mujer es asintomática; confirmar la función hormonal, ya que los cambios en los niveles
hormonales se reflejan en cambios en el epitelio vaginal y cervical (cuello de útero) e identificar
infecciones vaginales del tipo tricomonas y candidas

El epitelio escamoso que limita la superficie de la vagina y el cuello uterino está conformado por
varios estratos celulares, destacándose las siguientes capas celulares:

Células basales: Se encuentran adosadas a la membrana basal del epitelio. El citoplasma es

escaso y muy basófilo (color azul verdoso oscuro: cianofilia) y el núcleo es central, grande, esférico,
47
cromatina fina con algunos cromocentros. Normalmente no se exfolian, de aquí que su aparición en
los extendidos indica una patología.

Células parabasales: Su citoplasma es más abundante que el de las células basales pero es menor
que el de las superficiales, se tiñen de verde azulado claro transparente y el núcleo es esférico u
ovoidal, menos voluminoso que el de las células basales y con cromatina granular distribuida
homogéneamente.

Células intermedias: Su citoplasma es amplio, transparente, poligonal y algunas de ellas presentan

un borde plegado; su tinción es verde azulado pálido (algunas pueden ser eosinófilas) y el núcleo es
esférico u ovoidal, de menor diámetro que el de las parabasales.

Células superficiales: El citoplasma es fino, ancho y poliédrico; sus bordes son irregulares pero
bien definidos, su reacción tintorial es eosinófilo y el núcleo es pequeño, esférico u ovoidal con una
cromatina muy condensada, se dice que es picnótico.

Las propiedades tintóreas del citoplasma de estas células dependen del grado de maduración
de las mismas, las eosinófilas que se tiñen de rojo son más maduras que las basófilas que se tiñen
de azul. La maduración se aprecia mejor en las variaciones del diámetro del núcleo y en el aspecto
de la cromatina. Las más inmaduras (células basales) poseen un núcleo grande (más o menos 12
μm) con cromatina laxamente dispuesta, en cambio las maduras (células superficiales) poseen un
núcleo pequeño (más o menos 6 μm) con una cromatina muy condensada.

Bases Tintóreas: Los precursores de la queratina que son proteínas ácidas y la abundancia de
ribosomas libres con ARN son los responsables de la basofilia mostrada por las células inmaduras;
en cambio, el paso de los precursores de queratina a queratina en forma de tonofibrillas y la
disminución en la cantidad de ribosomas son los responsables de la eosinofilia mostrada en las
células maduras.

NOTA: Para orientación, ver nuevo atlas de histología de Mariano Di Fiore, Manzini y De
Robertis (1976). Páginas 280 a 283.

3. Impregnación Argéntica

La impregnación con plata se remonta al año 1843 cuando Krause preparó trozos pequeños de
tejido fresco con nitrato de plata (AgNO3). Golgi, en 1872 había fijado tejido nervioso por un largo
período de tiempo en una solución de dicromato (Cr 2O7), entonces, trató el mismo tejido embebido
en AgNO3 y encontró que el dicromato de plata (AgCr 2O7), fue depositado selectivamente, dejando
los componentes impregnados en sobresaliente relieve, contrastando con un fondo casi incoloro.
Ramón y Cajal (1903, 1910), vieron las posibilidades del método de plata y lo experimentaron
nuevamente, incluyendo formas de reducirlo.

A principios de los años 1900 (Método Bodian), otros componentes de Ag orgánica fueron
introducidos como sustitutos para el AgNO 3. La fracción de albúmina en el componente orgánico se
considera que actúa como coloide protector que evita una rápida reducción por formaldehído, y
producto de esto se induce la formación de depósitos de plata de gránulos más finos. Experimentos
posteriores con plata en cortes de tejido llevaron a muchas modificaciones de los métodos de Ramón
48
y Cajal, Bielschowsky.

La plata amoniacal es un complejo molecular, el cual cuando es reducido por formaldehído a

plata metálica forma una solución coloidal conteniendo partículas cargadas negativamente. De ésta
forma, la plata cargada negativamente es depositada sobre superficies cargadas positivamente y
permite la impregnación selectiva del tejido nervioso, así como del tejido conectivo, por ejemplo:
reticulina. El pH de la solución de plata es un factor determinante en las cargas que adquiere el
tejido. (Métodos de Ramón y Cajal y del Río Ortega).

Como resultado de la Impregnación Argéntica las fibras de reticulina aparecen de color negro.
Los métodos para identificar reticulína se utilizan con gran frecuencia en el estudio de los tejidos. Los
estudios de microscopia electrónica parecen demostrar que la reticulina no es más que colágeno
joven. La reticulina, generalmente posee un componente (carbohidrato) que permite su coloración
por medio del PAS. Es posible que este mismo componente hidrocarbonado sea el responsable de la
afinidad de la reticulina por la plata (Ag).

De acuerdo con Baker (1958), la reacción bioquímica que da lugar a la coloración de reticulina
depende de la formación local de una sustancia coloreada que no es un colorante. La impregnación
se efectúa cuando un metal oxidado, plata (Ag) es reducido por una solución salina u otro
componente y depositado en un estado coloidal sobre un elemento del tejido. En la impregnación
subsiguiente, el tejido es removido con una solución reductora de tipo fotográfico y el metal es
reducido al estado elemental, probablemente en la formación de un depósito negro. Por lo tanto, el
mismo tejido no reduce el metal, pero algún reductor extrínseco es requerido para darse la reacción.

Aplicación:
Esta técnica es utilizada para el estudio de tejido nervioso, ya que permite impregnar las membranas
plasmáticas de las neuronas, lo que no puede hacerse con otras técnicas, en patología, permite
identificar fibras de reticulina para evaluar la normalidad de un tejido. Por medio de dicha técnica se
pueden identificar y tipificar tumores benignos o malignos, y algunas lesiones inflamatorias
granulomatosas, por ejemplo la Sarcoidosis para las lesiones inflamatorias y las neoplasias de tejido
conectivo; de allí su importancia en el campo de la investigación

4. Reacción de P.A.S:

Las siglas P.A.S., significan Ácido Periódico de Shiff. En este tipo de coloración se utiliza primero el
ácido periódico (HIO4) para oxidar los grupos alcohólicos (-CHOH-CHOH-) y convertirlos en grupos
aldehídos (-CHO). La presencia de estos grupos aldehídos colorea de fucsia el reactivo de Schiff
incoloro. Este último se prepara tratando la fucsina básica, que es un colorante rojizo, el cual se
decolora al tratarse con HCI y bisulfito de sodio o bien con el empleo del acido sulfuroso.

Este método permite evidenciar la presencia de la glicoproteína mucina. Ésta glicoproteína es

producida por las células caliciformes, las cuales son glándulas unicelulares que elaboran
mucinógeno, cuya forma hidratada es la mucina, componente de moco, y una capa protectora que
reviste la luz del intestino.

49
I. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe tener conocimientos sobre:

-. Los pasos a seguir a fin de realizar un buen enfoque de la muestra a observar, importancia del
estudio de las células in vivo y sus limitaciones, descripción de células típicas animales, vegetales y
bacterianas, niveles de organización de la materia viva y diferencias entre células procariotas y
eucariotas.

-. Además, el estudiante deberá poseer conocimientos sobre los mecanismos moleculares que
fundamentan las técnicas especiales de coloración: Carmín de Best, Papanicolaou, Impregnación
Argéntica, P.A.S, así como los compuestos que se evidencian con cada una de estas técnicas.

II. OBJETIVOS:

- Comprobar la importancia del estudio de las células in vivo, mediante observaciones a través del
microscopio óptico.

- Analizar la diversidad celular en base a muestras celulares, animales, vegetales y bacterianas.

- Comparar la información obtenida a través del microscopio óptico, en células vivas no teñidas y
células fijadas y coloreadas.
- Evidenciar la presencia de compuestos químicos mediante la observación de láminas coloreadas
con técnicas especiales.

-Evidenciar la presencia de estructuras celulares específicas mediante la observación de láminas

coloreadas con técnicas especiales

- Reconocer células de acuerdo a su grado de maduración mediante la observación de láminas

coloreadas con Papanicolaou.

IV. ACTIVIDADES:

1. Observación de células sanguíneas en frotis de sangre humana. En una lámina de frotis de

sangre periférica, observe al microscopio los diferentes tipos celulares. Dibuje lo observado y anote
sus conclusiones.

Esquema de un extendido de sangre periférica.

50
2. Observación de células epiteliales en mucosa bucal. Con una paleta haga un raspado de
mucosa bucal y colóquelo en el portaobjetos con solución salina (NaCl 0.9%). Coloque el
cubreobjetos y observe al microscopio. Determine la forma de las células, aspecto del citoplasma, la
forma y posición del núcleo. Tome otras muestras de raspado y coloree con azul de metileno. Dibuje
las células observadas y anote sus conclusiones.

----------------------------

Raspado de la mucosa bucal Extendido de células de la mucosa bucal

al microscopio óptico.

3. Observación de células fijadas y teñidas con técnicas especiales. Observe al microscopio

óptico las siguientes láminas:

- Corte de Hígado coloreado con Carmín de Best.

Microscopía óptica de un corte histológico de hígado coloreado con la técnica especial, Carmín de Best, donde se
observan grumos de color rosado que corresponden a depósitos de glucógeno y núcleos esféricos de color morado.

51
- Extendido vaginal coloreado con Papanicolaou.

Microscopía óptica de extendido vaginal coloreado con la técnica de Papanicolau.

- Corte de bazo. Impregnación Argéntica.

Corte histológico de bazo visto al microscopio óptico, fibras de reticulina de color negro.

- Corte de intestino delgado coloreado con P.A.S.

Microscopía óptica del epitelio del intestino delgado, células en forma de cáliz invertido donde se observa glicoproteína,
mucina de color fucsia.

52
4. Demostración de la técnica histológica de rutina (Hematoxilina-Eosina).

V. ANEXOS.

Cuadro 1. Etapas de la técnica histológica de rutina H-E

Etapas Fundamento/precauciones Producto/instrumento

Toma de la muestra Pequeño tamaño (2-3mm) Bisturí, hoja de afeitar
Fijación Detiene procesos vitales, evita la Formol 10%,12-
autólisis 24h,vol.40/l
Deshidratación Facilita la filtración del solvente Etanol en graduación
ascendente
Aclaración Favorece la filtración de la Xilol, benzol
parafina
Inclusión en parafina Otorga dureza para poder Parafina (45 a 6°C, estufa
realizar cortes
Preparación del taco Soporte para el montaje en el Bloque de madera o
micrótomo plástico
Corte Permite la visualización de Micrótomo
estructuras pequeñas
Montaje del corte sobre Soporte para su observación al Portaobjetos
un portaobjetos microscopio
Desparafinación Facilita la filtración del alcoholXilol, benzol
Hidratación Permite la filtración al tejido deEtanol en graduación
colorantes acuosos descendente hasta el agua
destilada.
Coloración Otorga colores diferentes a la Hematoxilina/eosina
muestra
Deshidratación Facilita el montaje con medios Etanol en graduación
hidrofóbicos ascendente.
Aclaración Otorga transparencia a los Xilol, benzol
tejidos
Montaje de cubreobjetos Permite obtener una preparación Cubreobjetos mas resina
permanente

53
Técnica histológica. Desde la toma de la muestra hasta el montaje del corte.

54
Técnica histológica. Desde la desparafinación hasta la preparación microscópica permanente.

55
 PRÁCTICA Nº 04
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS I

I. INTRODUCCIÓN:

La observación y descripción de células en forma sistemática y con el lenguaje adecuado,

constituye un elemento fundamental para estudios histológicos. Al realizar la descripción celular, se
deben tener en cuenta, además de la forma de las células otros aspectos como límite celular, el
número, forma, y localización del núcleo; las características tintóreas del mismo y del citoplasma,
presencia de nucléolos y de algunas especializaciones celulares, como la presencia de
microvellosidades, cilios, flagelos, entre otros.

El límite celular puede ser definido, es decir, claramente delimitado; o difuso, es decir, mal
definido.

Las células en medio líquido son esféricas, sin embargo, cuando están unidas formando
tejidos, adquieren otras formas por la presencia de células vecinas.

Al observar en cortes las células pueden ser piramidales, cilíndricas, cúbicas y poligonales.
Con relación al tamaño, la mayoría de las células humanas varían entre 6 y 20 micras y pueden
utilizarse como patrones comparativos, células como los eritrocitos que miden alrededor de 7.2
micras de diámetro.

La matriz citoplasmática es eosinófila (color rosado). La presencia de gran cantidad de

mitocondrias hace que el citoplasma de algunas células se observe mas rosado, igual sucede con
algunas células que secretan hormonas o algunas otras que tienen gran cantidad de gránulos de
secreción. La presencia de grandes cantidades de ARN o de ribosomas, es responsable del color
azul del citoplasma (basofilia), es decir, el citoplasma es basófilo. En algunos casos está restringido
en algunas zonas celulares que aparecen como manchas (basofilia basal, corpúsculos de Nessi).

Por efecto de técnicas de fijación y coloración, lípidos y glicoproteínas pueden ser disueltos,
en cuyo caso quedan espacios óptimamente vacíos denominados vacuolas. Los depósitos de
glucógeno se observan como concentraciones de material de límites difusos y los depósitos de calcio
aparecen como estructuras concéntricas; además, en el citoplasma se pueden ver también
pigmentos como la melanina y la lipofucsina.

La mayoría de las células son mononucleadas, aunque existen anucleadas, binucleadas hasta
polinucleadas. Según la posición, el núcleo puede ser céntrico, excéntrico, periférico y basal. Las
formas de los núcleos son variadas: esféricos, ovoidales, plurilobulados y aplanados (pignóticos). El
aspecto de la cromatina permite clasificarlos en heterocromaticos o eucromaticos, observándose al
microscopio óptico en el primer caso el nucleoplasma oscuro; mientras que en el segundo caso se
observa el nucleoplasma claro). En el núcleo se puede observar a una estructura esferoidal llamada
nucléolo, el cual se hace más evidente cuando el núcleo es eucromático.

56
II. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe tener conocimientos sobre:
- Mecanismos de acción de los colorantes hematoxilina y eosina; basofilia y acidofilia de la célula;
forma celular, disposición de la cromatina, identificación de estructuras celulares: núcleo, nucleolo
y citoplasma.

- Los pasos a seguir para el buen enfoque del preparado.

III. OBJETIVOS:

- Analizar la diversidad celular en base a observaciones microscópicas de diversos tejidos.

- Describir células de diversos tejidos en base a su forma.

- Diferenciar la afinidad del citoplasma y el núcleo por los colorantes: eosina y hematoxilina.

- Describir células de diversos tejidos en base a la posición, número y forma del núcleo.

- Clasificar el núcleo de acuerdo al aspecto de su cromatina.

IV. ACTIVIDADES:

1. Lámina: FROTIS DE CUELLO UTERINO. (Atlas Di Fiore: Pag. 5 y 283).

1.1. Con objetivo de 10X, ubique una zona con tejido.

1.2. Con objetivo de 40X localice una de las células de gran tamaño.

1.3. Dibuje varias células que difieran en la coloración del citoplasma y aspecto nuclear.

2. Lámina No. P-73-1: PANCREAS: (Atlas Di Fiore: Pag. 203).

2.1. Con objetivo de 10X, ubique acinos pancreáticos.

2.2. Con objetivo de 40X, ubique:

a) Células acinares con basofilia basal

b) Núcleos de células acinares con nucléolos.
c) Núcleos heterocromáticos alargados extra-acinares

2.3. Dibuje cada una de las estructuras observadas y describa cada una de las células
estudiadas.

3. Lámina No. P-59-1. ESOFAGO (Atlas Di Fiore: Pag. 151)

3.1 Con objetivo de 10X, ubique un borde más oscuro: es un epitelio estratificado, formado por
varias capas de células.
3.2. Con objetivo de 40X, diferencie 3 tipos de núcleos presentes (aplanados, esféricos y
ovoidales) en el epitelio y clasifíquelos de acuerdo a la posición con respecto a la superficie
epitelial, a su forma y a la tinción de su cromatina.
57
 3.3. Aprecie debajo del epitelio, con objetivo de 40X, unos grupos celulares claros: son acinos
de glándulas mucosas. En ellos, precise: límites celulares, posición, forma y características
tintóreas del núcleo y del citoplasma.

4. Lámina No. P-61-6: ESTOMAGO (Atlas Di Fiore: Pag. 159)

4.1. Con aumento de 10X, ubique un borde irregular con abundantes pliegues: Es el epitelio
gástrico.
4.2. Con objetivo de 40X, precise:

a. Forma de las células y sus núcleos en la superficie de los pliegues.

b. En los grupos celulares (células parietales y principales). Ubicados por debajo de los
pliegue. Describa forma y tinción de las células, forma, tinción y posición de sus
núcleos.

5. Lámina No. 2: EXTENDIDO DE SANGRE (coloración de Giemsa, Atlas Di Fiore: Pag. 131)

5.1. Con objetivo de 40X, identifique los elementos más abundantes: son los eritrocitos
(células anucleadas).
5.2. Con objetivo de 40X, diferencia los leucocitos, el aspecto y forma de su núcleo;
establezca la relación núcleo-citoplasma, determine su tamaño de acuerdo a las dimensiones
del eritrocito (patrón de medida), la presencia de gránulos y su coloración.
5.3 Dibuje cada una de las estructuras apreciadas y describa cada una de las células
observadas.

V. ANEXOS

Descripción de una célula:

Célula de forma cilíndrica mas angosta en la base, superficie luminal más amplia que la base,
citoplasma apical más abundante que el basal, núcleo ubicado en la región basal de la célula, de
forma ovoidal, cromatina dispersa (eucromático), y presencia de dos nucléolos.
58
 PRÁCTICA No.05
OBSERVACIÓN DE CÉLULAS II

I. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe tener conocimientos sobre:

-. Mecanismos de acción de los colorantes hematoxilina y eosina.

-. Basofilia y acidofilia de la célula.
-. Forma celular.
-. Disposición de la cromatina.
-. Identificación de estructuras celulares: núcleo, nucléolo y citoplasma, región basal y sus
especializaciones en la adhesión célula-matriz extracelular, membrana basal, lámina basal,
lámina externa.
-. Pasos a seguir para el buen enfoque del preparado.

NOTA: Documentarse sobre todos los tópicos incluidos en los pre- requisitos.

II. OBJETIVOS:

- Analizar la diversidad celular en base a observaciones microscópicas de diversos tejidos

-. Describir células de diversos tejidos en base a su forma y tamaño.

- Diferenciar la afinidad del citoplasma, por los colorantes: eosina y hematoxilina.

- Describir células de diversos tejidos en base a la posición, número y forma del núcleo.

- Clasificar el núcleo de acuerdo al aspecto de su cromatina.

III. ACTIVIDADES.

1. Lámina No. 3: PIEL (Atlas Di Fiore: Pag. 289)

1.1 Con objetivo de 10X, enfoque la posición profunda de la piel (hipodermis), que se reconoce
por su aspecto de red con grandes espacios ópticamente vacíos.

1.2. Identifique un adipocito y observe las siguientes características: núcleo pequeño,

heterocromático, periférico y el citoplasma reducido a un halo eosinófilo periférico.

1.3. Dibuje lo observado y describa las células observadas

2. Lámina No. 74: HIGADO (Atlas Di Fiore: Pag. 192)

2.1. Con objetivo de 40X, identifique los hepatocitos y describa los límites celulares, forma de
las células, núcleos esféricos, céntricos y eucromaticos.

2.2. Observe hepatocitos binucleados.

2.3. Observe hepatocitos poliploides (núcleos de mayor tamaño)
2.4. Dibuje las estructuras observadas y describe cada una de las células indicadas.
59
3. Lámina No. P-64-1: INTESTINO DELGADO (Atlas Di Fiore: Pag. 169).

3.1 Observe con el objetivo de 40X, la luz contiene numerosas formaciones irregulares que
representan cortes en diferentes incidencias de evaginaciones de la mucosa del órgano, éste
epitelio irregular corresponde a las vellosidades intestinales.

3.2 Identifique células en forma de copa (células caliciformes)

3.3 Dibuje las estructuras observadas y describa cada una de las células indicadas.

4. Lámina No. 51: TRAQUEA (Atlas Di Fiore: Pag. 213).

4.1 Con objetivo de 40X, identifique las células epiteliales ciliadas. Dibuje y describa la célula
señalada.

5. Lámina No. 01-L: MAXILAR FETAL (Atlas Di Fiore: Pag. 67)

5.1 Con objetivo de 40X, localice la zona de reabsorción (Trabéculas) y ubique células
multinucleadas (osteoclasto). Dibuje y describa éstas células.

60
 ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 06
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN

I. INTRODUCCION

Como material genético, el ADN proporciona un patrón que dirige todas las actividades
celulares y determina el plan de desarrollo de los organismos multicelulares. Por lo tanto, entender la
estructura genética y su función resulta fundamental para obtener una visión de la biología molecular
de las células. El desarrollo e implementación de técnicas para la clonación de genes ha constituido
un gran paso hacia este objetivo, permitiendo a los científicos estudiar genomas eucariotas
complejos y comprobar las funciones de los genes eucarióticos. Los continuos avances en la
tecnología del ADN recombinante nos conducen hasta el inquietante momento de determinar las
secuencias de genomas completos, acercándonos a descifrar las bases genéticas del
comportamiento celular.

En un principio las aplicaciones iniciales del ADN genómico en consonancia con la tecnología
del ADN recombinante estuvieron dirigidas al aislamiento y análisis de genes individuales.
Recientemente, se ha conseguido secuenciar genomas enteros no solo en bacterias y levaduras,
sino también en los genomas complejos de plantas y animales, incluyendo a humanos. Las
secuencias de estos genomas celulares completos aportan una rica fuente de información,
incluyendo la identificación de muchos genes desconocidos hasta ahora. El resultado de estos
proyectos de secuenciación de genomas se espera que estimulen muchos años de investigación en
la biología celular y molecular, y por consiguiente se logre tener un profundo impacto sobre nuestra
comprensión y tratamiento de enfermedades.

La estructura tridimensional del ADN, deducida en 1953 por James Watson y Francis Crick, es
sin duda, la base de la biología molecular actual. En la época de los trabajos de Watson y Crick se
sabía que el ADN era un polímero compuesto de cuatro nucleótidos dos purinas (adenina [A] y
guanina [G]) y dos pirimidinas (citosina [C] y timina [T]), unidas a azúcares fosforilados. Dado el
papel central del ADN como material genético, la elucidación de su estructura tridimensional era
crítica para entender su función. En este sentido, el análisis de la información experimental obtenida
por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin. Sobre la estructura del ADN con los estudios de
cristalografía por refracción de rayos X, reveló que el ADN es una hélice que da un giro cada 3,4 nm,
y que la distancia entre bases es de 0,34 nm por lo que en cada vuelta de la hélice hay diez bases.

Un dato importante es que el diámetro de la hélice es de 2 nm, sugiriendo que está compuesto
no de una sino de dos cadenas de ADN. El análisis de estos resultados y otros históricamente
importantes, permitió la construcción del modelo tridimensional de la molécula de ADN, cuya
principal característica es que está constituida por una doble hélice con el esqueleto azúcar-fosfato
en el exterior de la molécula y las bases nitrogenadas embebidas en el interior de la doble hélice.
Las dos cadenas de nucleótidos que constituyen una molécula de ADN se mantienen unidas entre sí
porque se forman enlaces entre las bases nitrogenadas de ambas cadenas que quedan apareadas
(Figura 1).

61
 Figura 1: Estructura del ADN

La unión de las bases nitrogenadas se establece mediante puentes de hidrógeno,

interacciones hidrofóbicas o apareamiento de las bases nitrogenadas e interacciones de Van der
Waals. Este apareamiento está condicionado químicamente de forma que la adenina (A) sólo se
puede unir con la timina (T) y la guanina (G) con la citosina (C). La estructura en doble hélice del
ADN con el apareamiento de bases específico (A-T; G-C), implica que el orden o secuencia de bases
de una de las cadenas delimita automáticamente el orden de la otra, por eso se dice que las cadenas
son complementarias. Una vez conocida la secuencia de las bases de una cadena, se deduce
inmediatamente la secuencia de bases de la complementaria.

La estructura de un determinado ADN está definida por la "secuencia" de las bases

nitrogenadas en la cadena de nucleótidos, residiendo precisamente en esta secuencia de bases la
información genética del organismo. El orden en el que aparecen las cuatro bases a lo largo de una
cadena en el ADN es, por tanto, crítico para la célula, ya que este orden es el que constituye las
instrucciones del programa genético de los organismos. Conocer esta secuencia de bases, es decir,
secuenciar un ADN equivale a descifrar su mensaje genético.

Extracción de ADN.

La extracción y purificación de ácidos nucleícos constituye la primera etapa de la mayoría de

los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. El método
clásico de purificación de ácidos nucleícos se basa en el uso de disolventes orgánicos tóxicos,
siendo la extracción mediante fenol/cloroformo la más conocida.

62
 No obstante, recientemente se han desarrollado métodos alternativos que emplean una alta
concentración salina en vez de disolventes orgánicos. Con ello se consigue el mismo objetivo de
desproteinizar la muestra, sin los inconvenientes de toxicidad antes mencionados. Este sistema es
conocido también con el nombre de “purificación salina” (del inglés, “salting out”).

A la hora de poner en práctica un protocolo de extracción de ADN, la calidad y la pureza del

ADN deben ser dos de los elementos importantes en ese tipo de análisis, ya que en gran medida de
esto dependerá el éxito de su utilización y la obtención de resultados confiables. En la búsqueda de
optimización de éste tipo de técnicas, es cada vez más común el uso de kits comerciales en biología
molecular, dada la garantía de calidad que ofrecen, además de la significativa reducción de precios
que han experimentado en los últimos años, debido a la competencia entre diferentes casas
comerciales. Todo ello los convierte en una alternativa a tener en cuenta en el laboratorio de biología
molecular.

En la actualidad, la disponibilidad de diversos protocolos de aislamiento de ADN han permitido

el desarrollo de la genómica, ya que es a través de este abordaje experimental que se hace posible
el obtener ADN purificado a partir de diversas fuentes y así poder realizar análisis específicos de
interés, por ejemplo:

1. Identificar mutaciones.
2. Estudiar características propias de los tipos de ADN (Polimorfismos).
3. Clonar Genes específicos o fragmentos de cromosomas.
4. Aislar ADN afectado y compararlo con uno normal.
6. Identificar resistencia microbiana.
7. Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, inmunológicos.
8. Identificar personas en casos de Medicina Forense.
9. Realizar pruebas de paternidad.
10. Diagnosticar molecularmente enfermedades como Hepatitis. VPH, VIH, entre otras.

En esta práctica demostrativa de aislamiento de ADN emplearemos un protocolo sencillo

(artesanal) basado en la purificación salina.

Principio del Protocolo de Extracción de ADN

El primer paso consiste en la lisis de las células cuyo ADN se desea purificar. Este paso se
realiza mediante la ruptura mecánica del tejido (trituración) que homogeniza los componentes
celulares. Dicha ruptura celular se lleva a cabo en presencia de “preservantes”, que garanticen la
integridad del ADN esto es, que impiden o limitan la acción de las ADNasas presentes en las células
o contaminantes del medio. El ARN presente se elimina mediante tratamiento con ARNasas. A
continuación se eliminan las proteínas y otros contaminantes celulares, mediante precipitación salina
(que sustituye el tratamiento clásico con disolventes orgánicos tóxicos). Finalmente, el ADN
genómico se aísla mediante precipitación en presencia de alcohol y se disuelve en agua o en una
solución tamponada que puede contener agentes que mantengan la integridad del ADN.

Cuantificación de ADN

Existen diversos métodos para determinar la concentración de DNA de una muestra. Entre
ellos se encuentran:

63
Sistemas semi-cuantitativos: a) visualización en gel de agarosa; b) comparación de microlitros (µl) de
ADN, conteniendo diferentes cantidades de muestra con un patrón de DNA conocido, en presencia
de Bromuro de etidio.

Sistemas cuantitativos: métodos fluorométricos y espectrofotométricos. Los primeros tienen la

ventaja de su sensibilidad y la desventaja de su puesta a punto. Además, requieren sustancias
tóxicas. Los métodos espectrofotométricos son los más comunes porque son fáciles de ejecutar y
proporcionan resultados fiables.

Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría: para cuantificar ácidos nucleicos se utiliza
el espectrofotómetro.

Fundamentos del espectrofotómetro:

El espectrofotómetro se fundamenta en la transmisión de la luz a través de una solución para
determinar la concentración de un soluto presente en la misma.
El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiación
de luz de longitud de onda conocida y se mide la energía luminosa transmitida con una célula
fotoeléctrica situada detrás de la muestra.

Tal como muestra la figura 2, el espectrofotómetro de haz único consta de una fuente de luz,
un prisma, un recipiente con la muestra y una célula fotoeléctrica. Los distintos elementos están
conectados a los sistemas eléctricos o mecánicos adecuados para controlar la intensidad de la luz y
la longitud de onda y para convertir en variaciones de tensión la energía recibida en la célula
fotoeléctrica. Las variaciones de tensión se miden en un contador o se registran en un ordenador
para su posterior análisis.

Figura 2. Representación esquemática de la transmisión de la luz.

Cada molécula absorbe la energía radiante a una longitud de onda específica, a partir de la
cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en una solución.

Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relación lineal entre la absorbancia A
(también denominada densidad óptica, DO) y la concentración de la macromolécula, conforme a la
ecuación siguiente:

A = DO = εlc (1)

Donde ε es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración y l es el paso de luz de la

cubeta. Las proteínas y los ácidos nucleicos absorben la luz en el intervalo ultravioleta, a longitudes
64
de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha señalado anteriormente, la
absorbancia máxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones
de proteínas, a 280 nm.

Cuantificación de ADN por espectrofotometría.

Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 260 nm y las que
contienen proteínas hacen lo propio a 280 nm, entonces de debe tomar una lectura a longitudes de
onda de 260 nm 280 nm, la lectura a 260 nm permitirá calcular la concentración de ácidos nucleicos
en la muestra. El cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona
una estimación del grado de pureza de los ácidos nucleícos. Los cocientes A260/A280 respectivos
del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Si hay contaminación con proteínas o
fenol u otras soluciones empleadas durante la extracción, el valor de la proporciones es menor a
menor a 1, 8.

El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mono-nucleótidos pueden cuantificarse

directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o
densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra
es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o
agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es
sencillo y exacto. En este método, los tampones acuosos con escasas concentraciones iónicas
resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleícos suele determinarse midiendo a 260 nm y
comparando con un blanco. Una absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con
hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente
A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente.

II. PRE-REQUISITOS:

Para el buen aprovechamiento de la práctica, el alumno debe tener conocimientos previos

sobre la estructura y composición del ADN, métodos de extracción de ADN rutinarios y los
comerciales (kits), principios básicos de la espectrofotometría (usos y aplicaciones).

II. OBJETIVOS:

-. Ejemplificar a través de un video, un protocolo sencillo de extracción y visualización de ADN.

-. Realizar en el laboratorio el protocolo de extracción de ADN mostrado en el video.

III. ACTIVIDADES

Materiales, soluciones y protocolo a seguir

Materiales:
 2 tubos de ensayo grandes
 1 vaso de precipitado pequeño
 1 baño de María
 1 embudo

65
  Gasas
 1 agitador de vidrio
 1 gradilla
 1 pipeta Pasteur con émbolo o un gotero
 1 licuadora

Soluciones a utilizar
 Material biológico fresco: hígado
 Acido tricloroacético al 15%
 Solución salina con NaCl al 10%
 Alcohol absoluto o isopropilico frío

Protocolo experimental:
1. Macerar el hígado con un poco de agua destilada.
2. Colocar una pequeña muestra (10 ml) en un vaso de precipitado y agregarle 10 ml de solución
ácida (fijador). Mezclar con el agitador.
3. Filtrar la muestra a través de un papel filtro. Desechar el líquido remanente.
4. Recuperar la muestra (coágulo seco) del papel, pasándola nuevamente al vaso.
5. Agregar 10 ml de solución salina (NaCl), mezclar. Poner en baño María durante 3 minutos sin
agitación.
6. Filtrar decantando la fase líquida. Desechar el coágulo y recuperar el filtrado en otro tubo de
ensayo.
7. A la muestra CALIENTE, agregar lentamente de 1 a 2 ml de alcohol absoluto o isopropilico frío.
8. Observar las hebras de ADN que se forman en la interfase entre el alcohol agregado y la muestra.

Discutir y Resolver las siguientes preguntas:

1. ¿Para qué se realiza el macerado de la muestra biológica?

2. ¿Cuál es la función del Acido tricloroacético?

3. ¿Cuál es la función de la solución de NaCl?

3. ¿Cuál es la función del alcohol frío en la muestra caliente?

66
 ACTIVIDAD PRÁCTICA N° 07
MITOSIS Y CARIOTIPO

I. INTRODUCCIÓN

La característica principal de las células y de los organismos es la capacidad para

reproducirse. El tipo de reproducción más simple implica la división de una célula progenitora en dos
células hijas, esto lo logra duplicando primero su contenido y luego dividiéndose en dos. Esta división
ocurre como parte del ciclo celular que se puede definir como una serie ordenada de
acontecimientos macromoleculares que preparan a la célula para dividirse seguido por el proceso
real de división, denominado mitosis.

El ciclo de división es la forma fundamental a través del cual todos los seres vivos se propagan. En
especies unicelulares como las bacterias y las levaduras, cada división de la célula produce un
nuevo organismo. En especies pluricelulares se requieren muchas secuencias de divisiones
celulares para crear un nuevo individuo; la división celular también es necesaria en el cuerpo adulto
para reemplazar las células perdidas por desgaste, deterioro o por muerte celular programada. Así,
un humano adulto debe producir muchas células nuevas simplemente para mantener el estado de
equilibrio y, si el control sobre el ciclo celular se altera puede inducir patologías (por ejemplo: cáncer)
o si se detiene el individuo moriría en pocos días.

El ciclo celular de las eucariotas se divide en cuatro fases principales (fig 1): M Mitosis o de
división celular y una etapa previa de no división que comprende las fases G1, S y G2 que en
conjunto se conocen como interfase.

Figura 1. Ciclo celular

Este ciclo comprende un conjunto de procesos que una célula debe llevar a cabo para cumplir la
replicación exacta del ADN y la segregación de los cromosomas replicados en dos células distintas.
La gran mayoría de las células también doblan su masa y duplican todos sus orgánulos
citoplasmáticos en cada ciclo celular: De este modo durante el ciclo celular un conjunto complejo de
procesos citoplasmáticos y nucleares tienen que coordinarse unos con otros. El ciclo celular puede
ser esquematizado de la siguiente forma:
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 M = Mitosis

G1 = Período que sigue la mitosis y precede a la síntesis de ADN, las células sintetizan
ARN y proteínas durante esta fase.

S = Período durante el cual ocurre la síntesis de ADN y de histonas

G2 = Período posterior a la síntesis de ADN y precede a la mitosis. Ocurren procesos de

reparación del ADN recién replicado y la célula prepara toda la maquinaria celular para
la Mitosis.

La mitosis es un tipo de división donde las células hijas tienen exactamente la misma información
genética que la célula progenitora, este proceso también es conocido como reproducción asexual, y
lo realizan todas las células eucariotas (en procariotas ocurre un proceso parecido conocido como
bipartición). Los organismos pluricelulares y algunos eucariontes unicelulares más desarrollados,
llevan a cabo adicionalmente un proceso de reproducción sexual, en el cual, la fusión de dos células
producen una tercera célula que contiene información genética proveniente de cada una de las
células progenitoras. Debido a que tal fusión causaría un número de cromosomas cada vez mayor,
los ciclos de reproducción sexual emplean un tipo especial de división celular denominado meiosis,
que reduce el número de cromosomas de la célula que va a efectuar la fusión. Las células con un
juego completo de cromosomas son conocidas como diploides (2n). Durante la meiosis, una célula
diploide replica sus cromosomas como usualmente se haría en la mitosis, pero luego se divide dos
veces sin duplicar nuevamente su material genético dando origen a cuatro células hijas, cada una
con la mitad de la carga genética (cromosomas) que la célula originaria, es decir, son haploides (n).
Las células que realizan este tipo de división son células especializadas de los organismos que
utilizan la reproducción sexual y se conocen como Gametos.

Los gametos son formados a partir de células precursoras diploides de la línea germinal, que en los
seres humanos contienen 46 cromosomas, 22 pares diferentes conocidos como autosomas y un par
llamado sexual, que en el caso de las mujeres está constituido por los cromosomas XX, mientras que
en los hombres los cromosomas XY.

Los cromosomas (fig. 2) de cada especie poseen una serie de características, como la forma, el
tamaño, la posición del centrómero y las bandas que presentan al teñirse.

Figura 2. Micrografía Electrónica de un cromosoma

Este conjunto de particularidades, que permite identificar los cromosomas de las distintas especies,
recibe el nombre de cariotipo, (fig. 3) y su representación gráfica, ordenada por parejas de
cromosomas homólogos, se denomina cariograma.

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 Figura 3. Cariotipo Humano

MITOSIS

Es la división celular a partir de la cual, de una célula se obtienen 2 células hijas, genéticamente
idénticas a la madre. El hecho de que las células somáticas (células de un organismo eucariótico que
no van a convertirse en células sexuales) se reproducen mediante mitosis, garantiza el
mantenimiento del estado diploide de una generación a la siguiente, como consecuencia de ello, las
células que se reproducen por mitosis tienden a ser genéticamente iguales.

Las plantas y los animales están formados por miles de millones de células individuales organizadas
en tejidos y órganos que cumplen funciones específicas. Todas las células de cualquier planta o
animal han surgido a partir de una única célula inicial (el óvulo fecundado) por un proceso de
división. Una célula mitótica se divide y forma dos células hijas idénticas, cada una de las cuales
contiene un juego de cromosomas idéntico al de la célula parental, después cada una de las células
hijas vuelve a dividirse de nuevo, y así continúa el proceso. Todas las células crecen antes de
dividirse hasta alcanzar el doble del tamaño inicial, en este proceso se duplica el número de
cromosomas (es decir, el ADN) y cada uno de los juegos duplicados se desplaza sobre una matriz
de microtúbulos hacia un polo de la célula en división, y constituirá la dotación cromosómica de cada
una de las dos células hijas que se forman.

Durante la mitosis existen cuatro fases:

1. Profase

Los cromosomas se condensan por enrollamiento. Conforme se hacen visibles los cromosomas
adoptan una apariencia de doble filamento denominadas cromátidas, resultantes de la duplicación
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del ADN en la etapa S. Estas se mantienen juntas en una región llamada centrómero, que es la
región de constricción primaria en los cromosomas humanos y es el sitio en donde las cromátidas
hermanas se unen durante la mitosis y meiosis; es una estructura constituida por secuencias
repetidas de ADN a las cuales se unen proteínas denominadas centroméricas.

Figura 4. En torno al centrómero se va a situar un complejo multiprotéico llamado cinetocoro al que se le unen
los microtúbulos cinetocóricos del huso mitótico para que los cromosomas se puedan separar. Posteriormente
desaparecen los nucleolos, la envoltura nuclear empieza a fragmentarse y el nucleoplasma y el citoplasma se
hacen uno solo. En esta fase puede aparecer el huso mitótico y tomar los cromosomas. Cada uno de los
centrosomas se dirige hacia los polos opuestos del citoplasma y se hacen evidentes las fibras de huso.

1.1 Profase temprana: Los cromosomas se hacen visibles y el nucleolo desaparece

progresivamente entre el principio y la mitad de la profase. Se evidencian los microtúbulos
cinetocóricos

Figura 5. Los dos centros de origen de los microtúbulos (en verde) son los centrosomas. La cromatina ha
comenzado a condensarse y se observan las cromátidas (en azul). Las estructuras en color rojo son los
cinetocoros. (Micrografía obtenida utilizando marcajes fluorescentes).

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 1.2 Profase tardía (Prometafase): Los cromosomas se acortan y engruesan. Desaparece la
envoltura nuclear. Ausencia del nucléolo. Se evidencia las diferentes fibras del huso mitótico.

Figura 6. La membrana nuclear se ha desaparecido, y los microtúbulos (verde) invaden el espacio nuclear.
Los microtúbulos pueden anclar cromosomas (azul) a través de los cinetocoros (rojo) o interactuar con
microtúbulos emanados por el polo opuesto.- (Micrografía obtenida utilizando marcajes fluorescentes).

2. Metafase

Los cromosomas se condensan más fuertemente y aparecen como estructuras bien definidas,
situadas en el plano ecuatorial de la célula, formando la llamada “placa metafísica”, los cromosomas
se fijan mediante su cinetocoro a las fibras del huso mitótico. En esta fase el huso presenta fibras
continuas de polo a polo y fibras cinetocóricas.

Figura 7. Imagen de un neumocito de tritón teñido con colorante fluorescente durante la metafase. El huso
mitótico puede verse teñido en azul claro. Todos los cromosomas excepto uno se encuentran en la placa
metafásica.

3. Anafase

Las cromátidas se separan y migran hacia los polos opuestos del huso. Durante este periodo
las fibras cinetocóricas se acortan.

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 Figura 8. Los microtúbulos anclados a cinetocoros se acortan y los dos juegos de cromosomas se
aproximan a cada uno de los centrosomas. (Micrografía obtenida utilizando marcajes fluorescentes).

4. Telofase

Todos los eventos morfológicos y moleculares ocurridos en profase, son revertidos durante esta
fase. Los cromosomas hijos alcanzan los respectivos polos de la célula comienzan a desenrollarse,
se forma la envoltura nuclear y reaparece el nucleolo a nivel de los organizadores nucleares. De
manera simultánea, el citoplasma se divide (citocinesis) en dos partes aproximadamente iguales. De
esta forma se constituyen dos células hijas con dotaciones cromosómicas idénticas a la célula
madre.

4.1 Telofase temprana: Comienza la reconstrucción de la envoltura nuclear. El surco de

división se evidencia progresivamente. (fig. 9)

Figura 9

4.2 Telofase tardía: Se reconstruye la envoltura nuclear. Los cromosomas se dispersan y se

reorganiza el nucléolo, lo cual significa la regeneración de núcleos interfásicos (fig 10). Aumenta el
volumen del núcleo. Los cromosomas se descondensan y adquieren gradualmente el aspecto
interfásico. Se presenta el surco de división y ocurre separación de las células hijas. Los
cromosomas de especies diferentes varían en longitud, tamaño, número y otras características, sin
embargo, la mitosis es muy similar en las células animales y vegetales.

Figura 10

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II. PRE-REQUISITOS: El estudiante debe tener conocimientos sobre:

Los cambios morfológicos y fisiológicos que se presentan en las células en división.

III. OBJETIVOS

-. Analizar los eventos morfológicos y moleculares ocurridos durante los procesos de división celular.

-. Observar bajo el microscopio óptico (láminas) y en fotografías cortes del meristema apical de la
raíz de cebolla (Allium cepa) cada una de las fases y estadíos de la mitosis.

-. Relacionar los procesos de división celular con la morfología característica de los cromosomas
humanos.

-. Establecer la importancia del cariotipo.

IV. ACTIVIDADES

1. Observe al microscopio, láminas preparadas del meristema apical de la raíz de cebolla, coloreada
con Eosina-Carmín férrico e identifique células en las diferentes fases de la mitosis. Especifique para
cada fase si se trata de un estadío temprano o tardío. Anote las características observadas y realice
los esquemas respectivos.

2. Utilice las fotos de mitosis suministradas en una carpeta e identifique las diferentes fases y
estadíos presentes utilizando la imagen anexa al final de ésta actividad práctica.

3. Según lo descrito en el texto responda:

a) Las células a lo largo de su vida pasan por varias fases que en conjunto constituyen el:
________________________________________________________________________________

b) El estado habitual de una célula es con su cromatina descondensada, con genes en actividad y
con una actividad fisiológica más o menos intensa. Esta situación corresponde al periodo de:
________________________________________________________________________________

c) En tejidos en crecimiento o en regeneración una célula se divide para formar dos células hijas
genéticamente iguales, es decir con el mismo número de cromosomas e idéntica información
genética. Este tipo de división se denomina: _____________________________________________

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