PRACTICA

EXTRACCION DE ARN METODO TRIZOL

1. INTRODUCCIÓN

En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la síntesis de

proteínas, pues aunque el ADN es el que contiene la información que determina la
estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta información y
producir las proteínas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula. La mayor
dificultad en la extracción del ARN es evitar la contaminación con RNAsas, enzimas muy
estables que no requieren cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las
soluciones y los materiales con Dietil-piro carbonato (DEPC), el cual inactiva las
ribonucleasas por modificación covalente

La mayoría de protocolos para extracción de ARN están basados en el método descrito por
Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este ácido nucleico
empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe
realizarse una etapa de homogenización de la muestra con el (los) reactivo (s) que
contengan la solución fenol-isotiocianato, donde este último se encarga de conservar la
integridad del ARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adición
posterior de cloroformo separa la solución en fase acuosa y orgánica, donde la primera de
estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para
recuperar por precipitación el ARN. La metodología que se va a utilizar en esta práctica,
permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencionó, igualmente el ADN y las
proteínas pueden ser recuperados de la fase orgánica por precipitación secuencia, así con
etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitación adicional pueden
recuperarse las proteínas de la fase orgánica. Esta técnica permite obtener ARN a partir de
pequeñas cantidades de tejido y células en cultivo o suspensión de origen humano, vegetal,
animal o bacteriano. Así mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con
precaución está libre de contaminación con ADN y proteínas y finalmente puede ser
utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripción reversa,
ensayos de protección de RNAsas PCR y clonaje molecular

2. OBJETIVOS

• Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extracción de ARN

• Adquirir conocimiento básico para el manejo y cuidado de ARN extraído

• Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtención de ARN

3. PRECAUCIONES

Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante
el procedimiento de manipulación del ARN para obtener la segunda cadena o cadena
complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos cuando se
trabaja con ARN:

- Siempre deben utilizarse guantes de látex, ya que la piel contiene algunas bacterias que
poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer.

- Utilizar pipetas y micro pipetas estériles, reservadas para trabajo de ARN, evitando así
contaminaciones cruzadas.

- Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas)

-El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben utilizarse
elementos de protección como guantes y gafas, evitando completamente el contacto con
piel y ropa, así como evitando inhalar el reactivo o los vapores de este. Otras precauciones
son:

- Utilizar siempre tubos de polipropileno

- Utilizar material resistente al cloroformo y altas velocidades de centrifugación

- Equilibrar los tubos previos a la centrifugación

- Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugación y durante la incubación

para evitar la evaporación.

4. MATERIALES Y REACTIVOS

- Reactivo TRIzol (Gibco) - Eppendorf estériles de 1.5 mL

- Micro pipetas - Puntas estériles
- Centrífuga y micro centrífuga - Guantes
- Agua desionizada estéril - Cloroformo
- Agua libre de ARNasas - Isopropanol
- Etanol al 75% en agua libre se RNAsas
5. PREPARACIÓN DE REACTIVOS

- NaCl al 0.9%

-Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estéril

Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC con el
agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina de extracción y con
todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y almacenar a
temperatura ambiente O SOLUCIÓN AL 0.5% DE SDS

- Etanol al 75% 100mL de agua libre de RNAsas Etanol grado biología molecular Mezclar
cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en un frasco estéril
hasta homogenizar completamente

- Reactivo BTE 10x; 121.1 g Tris base 1M, 61.8 g ácido bórico 1M, EDTA (disodium salt)
7.4 g 0.02 M para 1L, preparara con agua estéril libre de RNasas

6. PROCEDIMIENTO
I. HOMOGENIZACIÓN
1. Pesar entre 30-35 mg de tejido y le agregamos la cantidad adecuada de Trizol
(considerando 0.5 mL Trizol por 35 mg de tejido).
2. En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el tejido con 0,5 mL de reactivo TRIzol.
3. Mezclar suavemente con micro pipeta.

II. FASE DE SEPARACIÓN

4. Incubar la muestra homogenizada durante 15 minutos a temperatura ambiente,
permitiendo así la completa disociación de los complejos de nucleoproteínas.
5. Adicional 100ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo
6. Agitar fuertemente durante 15 segundos
7. Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical
8. Centrifugar las muestras a 14000rpm por 10 minutos preferiblemente a temperatura de 4
a 8°C
9. Luego de centrifugar, la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol
cloroformo, en una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene
exclusivamente el ARN
III. FASE DE PRECIPITACIÓN

10. Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo (aquí puede
separarse igualmente la fase orgánica para posterior purificación de ADN o proteínas)
11. Adicional 0.5 mL de isopropanol para precipitar el ARN de la fase acuosa
12. Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posición vertical
13. Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a temperatura de 2
a 8°C
14. El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugación como un pellet parecido a un
gel o botón blanco.

IV. FASE DE LAVADO

15. Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo

16. Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo
17. Mezclar por agitación
18. Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2- 8 °C
19. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante

V. FASE DE DISOLUCIÓN

20. Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de
papel estéril
21. Disolver (con pipeta cuidadosamente) el RNA en agua MQ (50 ul) e incubar por 10 min
a 55-60 °C.
22. Centrifugar a 7500 g por 5 min.
23. Trasvasar y fraccionar en tubos nuevos, etiquetar y Guardar a -70°C

VI. CUANTIFICACION ARN NANODROP

- Las muestras de RNA parcialmente disueltas tiene una relación Abs 260nm/ Abs
280nm < 1,8. Si tu muestra es menor a este valor se considera impura o que
contiene restos proteínicos por lo que es considerada una muestra contaminada, si el
valor es cercano a 2 indica un alto grado de pureza de tu muestra.
 - Encender nanodrop, calibrarlo con H2O estéril
- Colocar 1 ul de la muestra y cuantificar absorbancia 260-280 nm
- Tomar datos de concentración en ul/ng y grado de pureza

VII. REVELADO EN GEL DE AGAROSA

- Pesar 0.75g de agarosa en vidrio de reloj (1.75%)

- Disolver en 50 ml solución BTE 10x
- Disolver completamente
- Calentar en horno de microondas por 2 min (Dependiendo la potencia)
- Agregar 1 ul de bromuro de etidio y disolver
- Agregar la solución caliente en el molde de la cámara de electroforesis y colocar los
peines y esperar a que polimerice (solidifique)
- Retirar los peines
- Mezclar 10ul de muestra con 2ul de azul de bromofenol
- Inyectar la muestra en cada pocillo
- Correr el gel a 100 voltios 20 min
- Retirar gel y observarlo en fotodocumentador

7. RESULTADOS (PROCEDIMIENTO DE EXTRACCION, CUANTIFICACION Y

DOCUMENTACION (FOTOS) Y TABLA DE RESULTADOS DE CUANTIFICACION
Y GRAFICA DE RESULTADOS (CONCENTRACION)

8. DISCUSION

9. CUESTIONARIO

1. Durante la extracción de ARN se emplea sales de guanidinium. ¿Cuál es su función y

que tipo de sales son las más utilizadas?

2. ¿Cuál es la función del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extracción del ARN?

3. ¿Mediante el método de TRIzol se puede aislar simultáneamente ADN, ARN y

proteínas?

4. ¿Se obtiene la misma cantidad de ARN que de ADN en la extracción con TRIzol?

5. ¿Qué tipo de ARN se obtiene en este tipo de extracción?

6. Porque se requiere agua milliQ, ultrapura o tipo I en este procedimiento?

7. ¿A qué factores puede deberse la obtención de baja cantidad o pérdida total del ARN
extraído con esta metodología?

8. ¿Qué otras técnicas comerciales existen para extraer ARN?

9. ¿El ARN obtenido aquí puede utilizarse directamente para realizar una determinación
específica a través de PCR? ¿Por qué?

10. ¿Qué inhibidores de nucleasas existen y en que procedimientos deben utilizarse?

BIBLIOGRAFIA

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