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Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco saldrán de la columna
cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones menos polares, que son por lo general las
que se retienen poco o nada en el absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio,
las sustancias más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es
necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su polaridad para que
sean arrastradas por estos.
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se conoce con el nombre
de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo característico de cada compuesto en una
condiciones cromatográficas determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la
presión, el diámetro que tenga la columna utilizada, etc.
El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el gel de sílice. A veces,
en sustitución del gel de sílice, cuando éste es incompatible con la mezcla a cromatografiar, se
utilizan la alúmina o el florisil (silicato magnésico). La cromatografía en columna puede realizarse
por gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la cabeza de la
columna a un compresor o a una línea de aire comprimido.
Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena con
partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de
las columnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación
más fácil.
Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la
fase estacionaria cubriendo las paredes interiores.
En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial,
inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento
varían, entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG),
alúminas, resinas de intercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo,
éste debe de someterse a un tratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado
sin problemas. Es característico que el tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo
más uniforme posible.
El procedimiento del empaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos:
2.Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del
cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia.
Pico: El pico es la porción del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un
componente individual eluye de la columna. El pico puede ser definido por su área, altura y ancho
a la mitad de la altura, o altura y ancho en la línea de base. Si la separación es incompleta, se
puede registrar la elución de dos o más componentes como un pico no resuelto.
Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (también conocido como volumen de demora
en elución a gradiente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la
entrada de la columna.
Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase móvil requerido para eluir un
componente no retenido. Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo
F, en ml/min:
Donde tR2 y tR1 son los tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W1 son los anchos
correspondientes en las bases de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos
de los picos hasta la línea de base. Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser
conveniente determinar la resolución, mediante la ecuación:
Eficacia
En la práctica, se define la eficacia de una columna como el cuadrado del cociente anterior y se
expresa como número de platos teóricos:
Así el número de platos teóricos de una columna puede calcularse utilizando la anchura de uno de
sus picos, normalmente el último que pueda medirse directamente sobre el cromatograma (figura
3), utilizando las expresiones:
El número de platos de una columna cromatográfica, depende lógicamente de su longitud, por lo
que para comparar la eficacia de columnas con diferente longitud, se introduce otro término,
denominado altura equivalente de un plato teórico, que relaciona la eficacia de una columna con
su longitud y que se define como el cociente entre la longitud de la columna y su número de platos
teóricos:
Es de destacar que al considerar la eficacia, solamente se han tenido en cuenta los efectos propios
de la columna, aunque existen otros parámetros del sistema (anchura de banda inicial,
velocidad de la fase móvil, etc.) que contribuyen al ensanchamiento de las bandas cromatográficas.
Referencias
https://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-columna
http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/AB482S05.htm
http://www.anmat.gov.ar/webanmat/mercosur/ACTA01-14/AGREGADO_XVI/2-
14/uni_XIV/Anexo_2_Cromatograf%C3%ADa_V7.pdf