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Dinâmica do Trafego

vesicular
Mecanismos que regem o tráfego

Isabel Martins
DMC 2017- 2018
As vesículas são o Fedex das células
Etapas essenciais na vida de
uma vesícula:

3) Na membrana do compartimento alvo:


fusão com a membrana do compartimento
alvo para entrega do “cargo” (6)

2) Perda da cobertura proteica (4, 5)

1) Na membrana do compartimento onde


se formam:
adquirir o conteúdo (ou cargo) + adquirir
uma cobertura proteica e destacar-se do
organelo (1-3)

Spang, Cell Mol. Life Sci 2008


Constituição das vesiculas após a sua formação na membrana do
compartimento dador

1) Proteínas de revestimento/cobertura ou coating


2) Proteínas cargo
3) GTPases
4) Proteínas que serão úteis numa fase posterior para a fusão com a membrana do
organelo alvo como por exemplo a v-SNARE
Papel das GTPases: aquisição e perda da cobertura protéica
Exemplo da proteína da família Arf

Guanine nucleotide Exchange Factor (GEF) media troca de GDP por GTP.

A Arf-GTP tem um papel fulcral na etapa inicial da formação das vesículas –


medeia o recrutamento da cobertura
GTPase activating proteins (GAPs) media hidrólise de GTP

A hidrólise do GTP tem um papel fulcral na libertação da cobertura das


vesículas – essencial para posterior fusão das vesículas com membranas alvo
Arf-GTP
1) Ativação da Arf por uma GEF

Arf-GTP:

2) Recruta e mantém a
cobertura/coating na membrana

3) Facilita captação e
associação da cobertura ao
cargo

4) Complexos proteicos
formados pelas proteínas da
cobertura polimerizam e
induzindo curvatura da
membrana

Nie & Randazzo, J Cell Sci 2006


Hypothetical model:
Controlled by membrane curvature

• Hidrólise do GTP estimulada pela


GAP associada à Arf induz
dissociação da cobertura/coating

Nie & Randazzo, J Cell Sci 2006


Os diferentes tipos de cobertura das vesículas

COP- “COat Protein”

D) Retrómeros

Figure 13-4 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)


Função do revestimento

Nível físico induz curvatura/bending da membrana


Seleção das moléculas (cargo) que têm que ser transportadas

Distinct coat complexes recognize


distinct structural determinants of various
cargoes, coat
assembly is cargo-specific.

Borgese, J Cell Sci 2016


Montagem da cobertura das vesículas de transporte do
início da via de secreção
Cobertura COPII medeia recrutamento de moléculas do RE destinadas ao Golgi

Cobertura COPI medeia recrutamento de moléculas do Golgi destinadas ao ER ou destinadas a


diferentes compartimentos do Golgi
Gomez-Navarro & Miller, Current Biology 2016
ESTRUTURA DA COBERTURA COPII

A cobertura COPII formada por 2 camadas:


• Interna que interage com a membrana, constituída por Sar1 (GTPase), Sec23 (liga o
cargo – ER export signals) e Sec24
• Externa uma estrutura esférica que leva á curvatura da membrana, constituída por
Sec13–Sec31

Gomez-Navarro & Miller, Current Biology 2016


Fath et al., Cell 2007
MONTAGEM DA COBERTURA COPII

• Uma GEF (Sec12) embebida na • Sar1 ligada à membrana recruta as


membrana do RE liga-se ao Sar1 subunidades da camada interna (Sec23–
citosólico e medeia troca de GDP por Sec24) e posteriormente da camada externa
GTP). (Sec13/31) para a membrana

• Sar1-GTP insere-se no folheto • Este recrutamento leva à formação de um


citoplasmático da bicamada lipídica da “gomo” que incluem proteínas
membrana do RE transmembranares específicas que entretanto
se ligaram

D’Arcangelo et al., Biochim Biophys Acta 2013


Problemas mais importantes:
Defeitos na absorção de gorduras
Hematológicos - defeitos na coagulação

Russo et al., Am J Hematol 2013


KATP-Canal potássio acopla o metabolismo do glucose com o controlo
da secreção de insulina. Disfunção/mutações no canal levam a
hiperexcitabilidade das células β do pâncreas.

Canal é formado por subunidades de Kir6.2 que tem sinal de


exportação di-acídico reconhecido pela cobertura COPII.

Mutação no sinal de exportação di-acídico impede o seu


recrutamento ficando retido no ER
ESTRUTURA DA COBERTURA COPI

A cobertura COPI é constituída:


• Arf1 (GTPase)
• Complexo heptamérico designado por coatomer-constituído por 2 subcomplexos:
• α-β’-COP (liga o cargo - retrograde signal K(X)KXX) no recetor KDEL)
• γ-ζ-β-δ-COP

Os 2 subcomplexos do coatomer contêm regiões que interagem com a membrana


formando uma estrutura em forma de “triada”

Gomez-Navarro & Miller, Current Biology 2016


Donova et al., Sci 2015
Montagem da cobertura das vesículas de transporte que
atuam numa fase avançada da via de secreção
As vesículas de clatrina e o retrómero

Robinson et al., Traffic 2015


ESTRUTURA DA COBERTURA DE CLATRINA

O componente proteíco principal é a própria clatrina


• Cada subunidade de clatrina consiste de três cadeias polipeptídicas grandes (pesadas) e
três pequenas (leves) formam uma estrutura com três “pernas” designada de “triskelion” -
trímeros ndividuais
• Os vários “triskelion” juntam-se numa estrutura hexagonal e pentagonal em forma de cesto
convexo
Proteínas Adaptadoras (AP)

As proteínas adaptadoras ( 2 famílias - AP e GGA) formam um segunda camada entre a camada de


clatrina e a membrana.
• A função das proteínas adaptadoras:
• Ligar a cobertura de clatrina à membrana da vesícula
• Capturar várias proteínas transmembranares, incluindo receptores transmembranares (receptores
cargo) que por sua vez capturam moléculas cargo solúveis no interior da vesícula

Canagarajah et al., Protein Sci 2013


A clatrina associa-se a diferentes proteínas adaptadores de acordo com a direção do
transporte

GGA (Golgi-localizing, gamma-adaptin ear homology domain, ARF-binding proteins; GGA 1, GGA 2 e GGA
3) constituem uma segunda família de proteínas adaptadoras da clatrina.
Os retrómeros são estruturas de revestimento, montadas nos endossomas e que
formam vesículas que devolvem recetores específicos ao Trans-Golgi e à MP.

Reciclagem de recetores
dos endossomas para o
trans-Golgi

Reciclagem de recetores dos


endossomas para a
membrana plasmática

Liu J Genetics and Genomics, 2016


ESTRUTURA DA COBERTURA FORMADA PELO RETROMERO

O retrómero é um complexo proteíco composto por 5 proteínas


- trímeros VPS
- dímeros SNX

Bonifacio & Hurley, Curr Opin Cell Biol 2008


No retrómero o trímero VPS35-VPS26-VPS29 é responsável
pela ligação ao cargo (recetores e transportadores)

Os dímeros SNX têm papel estrutural


de ligação à membrana (a PIP3 via os
domínios PX) e interação com o trímero

Seaman, TRENDS Cell Biol 2005


Destacamento das vesículas

À medida que a cobertura cresce, proteínas citoplasmáticas solúveis,


incluindo a dinamina, juntam-se numa estrutura tipo anel à volta do “pescoço” da vesícula.

A dinamina contém um domínio de ligação a fosfoinositídeos que amarra a proteína à membrana, e


um domínio GTPase que regula a taxa de destacamento das vesículas
O processo de destacamento junta os dois folhetos não citosólicos, levando à sua fusão.

Para a execução desta tarefa a dinamina recruta outras proteínas que conjuntamente com a
dinamina, ajudam a dobrar a membrana:
• Por distorção directa da bicamada lipídica
• Por mudanças na composição lipídica através do recrutamento de enzimas modificadoras de
lípidos.
• A fusão resulta no destacamento das vesículas
Transporte e entrega do conteúdo das
vesículas no compartimento alvo

Proteínas Rab
Complexos SNARE
Bonifacino & Glick, Cell 2004 116, 153-166
Proteínas Rab são pequenas proteínas GTPases

As proteínas Rab existem sob a forma ligada a GDP e


GTP ( proteínas GEFs e GAPs mediam o switch)

- As Rab-GTP interagem com proteínas efetoras


específicas

As proteínas efetoras incluem:


- adaptadores motores
- protéinas de ancoragem/acostagem “molecular tethers”

Yan Zhen, and Harald Stenmark J Cell Sci 2015;128:3171-3176


As proteinas Rab existem sob uma forma solúvel ou ligada à membrana onde são ancoradas ao
folheto citosólico das membranas por âncoras geranilgeranil (prenilação).

No citosol, a Rab (após a sua síntese) associa-


se a REP (Rab escort protein) e a GGT
(geranilgeranil transferase)
• GGT adiciona à Rab-GDP caudas prenil
• REP leva a Rab-GTP para membranas
específicas

Na membrana, Rab-GDP é convertida em Rab-


GTP por uma GEF

Yan Zhen, and Harald Stenmark J Cell Sci 2015;128:3171-3176


Rab-GTP medeia transporte direcionado das vesiculas através de
filamentos de actina ou microtúbulos

- Rab-GTP interage diretamente ou via proteínas efetoras (adaptadores motores) com proteínas as
motoras (miosinas, dineínas e cinesinas).
Yan Zhen, and Harald Stenmark J Cell Sci 2015;128:3171-3176
Papel das Rabs na acostagem e fusão das vesículas com a
membrana do compartimento alvo

- Rab-GTP liga-se a as proteínas efetoras (tethers) da membrana do compartimento alvo facilitando a


acostagem/fixação das vesículas à membrana do compartimento alvo (acceptor membrane)
- As proteínas efetoras (tethers) interagem e ativam a formação de complexos SNARE o que leva à fusão
das vesículas com a membrana do compartimento alvo (acceptor membrane)
Yan Zhen, and Harald Stenmark J Cell Sci 2015;128:3171-3176
Reciclagem das Rab para a membrana do compartimento “dador”

- Após fusão das vesículas, Rab-GTP é convertido em Rab-GDP através da interação com GAP
- Rab-GDP é capturado por GDI (Guanine nucleotide dissociation inhibitor)
- O complexo Rab-GDP/GDI é direcionado de volta para a membrana do compartimento dador (Donor
membrane) via interação com GDF (GDI dissociation factor) que liberta Rab-GDP de GDI
- Rab-GDP é de seguida inserido na membrana
Yan Zhen, and Harald Stenmark J Cell Sci 2015;128:3171-3176
Existem diferentes Rabs localizadas em várias compartimentos intracelulares. Cada Rab
medeia o tráfego intracelular das vesiculas originadas nesse compartimento para outro
compartimento especifico.

Stenmark, Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25


Os complexos SNARE medeiam a fusão das vesículas com as
membranas do compartimento alvo

• A proteína monomérica v-SNARE


(Synaptobrevin) na vesícula interage com os
domínios citosólicos da t- SNARE oligomérica
(Syntaxin e SNAP-25) na membrana alvo

• Forma-se um complexo estável (4 hélices


enlaçadas) entre as duas SNAREs, que
aproxima ambas as membranas levando á
fusão

Reciclagem das SNARE


• Os complexos SNARE são desmontados pela
ação da NSF e da α-SNAP

• A NSF é uma ATPase que usa a energia da


hidrólise do ATP para desenlaçar os domínios
helicais entre as proteínas SNARE
emparelhadas.

Bonifacino & Glick, Cell 2004 116, 153-166