Objetivo

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar las características físicas, bioquímicas y microscópicas de las muestras de semen y

orina (recolectada post-semen).

OBJETIVO GENERAL

Recolección de las muestras de semen y orina post-semen

Identificar macroscópicamente las propiedades físicas y bioquímicas de las muestras de semen

y orina post-semen

Preparar las muestras para su observación microscópica

Conocer la morfología, movilidad y concentración de los espermatozoides

Describir las características de la muestra

Establecer la lectura y el cálculo de los resultados micro y macroscópicos

Valorar la capacidad reproductiva de un varón

Comprender

Describir

Interpretar

Demostrar

Explicar

Obtener

Concluir

Definir

Establecer

Elaborar

Establecer

Valorar

INTRODUCCIÓN

El semen normal es una mezcla de espermatozoides suspendidos en las secreciones que

provienen del testículo y epidídimo (fotografía), las que se combinan al momento de la
eyaculación con las secreciones de la próstata, vesículas seminales y glándulas
bulbouretrales. Por lo tanto, el análisis del semen provee información sobre la producción
de espermatozoides en los túbulos seminíferos y condición fisiológica de estos tejidos.
-

El espermatozoide es la célula reproductora sexual masculina. Es una célula haploide, por lo

que sólo contiene 23 cromosomas (1n).

ESPERMATOZOIDE

El espermatozoide maduro es una célula altamente diferenciada. Está formado por:

o Cabeza, que contiene el núcleo y aporta la información genética.

o Pieza intermedia, que contiene las mitocondrias, fuente de energía.

o Flagelo, que proporciona la movilidad necesaria para el traslado al lugar de fecundación y

asegura la adecuada orientación de la cabeza para penetrar las cubiertas del ovocito.
A) Cabeza
La cabeza del espermatozoide es de forma oval al observarla frontalmente, y piriforme cuando la
observación es lateral, siendo más gruesa en la base y adelgazando hacia la punta. Su tamaño
aproximado oscila entre 3,7 y 4,7 micras de longitud y 2,5 a 3,2 micras de anchura, por 1 a 1,5 micras de
espesor. La razón longitud/anchura varía entre 1,3 y 1,8. En la cabeza del espermatozoide se sitúan el
núcleo y el acrosoma, recubiertos ambos por la membrana plasmática.
El núcleo ocupa la mayor parte de la cabeza. Es una masa de DNA haploide que se fusionará con el
núcleo del ovocito en el momento de la fecundación. Su cromatina se ha condensado intensamente a fin
de disminuir el volumen de la cabeza, lo que facilita la movilidad del espermatozoide a través de los
diferentes fluidos y estructuras que debe atravesar. Además protege al genoma de daños durante el
trayecto.
o El núcleo está delimitado por una membrana doble, la membrana nuclear.
o A nivel de inserción del flagelo, el núcleo está ligeramente deprimido formando la foseta de
implantación.
El acrosoma es una estructura membranosa, situada entre el núcleo y la membrana plasmática, adopta
la forma de capuchón. Está envuelto por la membrana acrosómica:
o La porción adherida a la envoltura nuclear por su parte interna es la membrana acrosómica interna.
o La membrana plasmática por su parte externa, membrana acrosómica externa.
El acrosoma se forma a partir del aparato de Golgi y contiene una gran concentración de hidratos de
carbono y enzimas lisosómicas como la hialuronidasa. Hay también una enzima proteolítica llamada
acrosina. El papel de estas enzimas en la fecundación es el facilitar el reconocimiento y penetración del
espermatozoide a través de las envolturas del ovocito. Para ello es necesario que se produzcan una serie
de cambios en el espermatozoide, conocidos como capacitación, y que culminan en un proceso de
modificación del acrosoma en la llamada reacción acrosómica. El líquido seminal impide la capacitación
por su acción decapacitante. Es por ello que dicho proceso, indispensable para una correcta fecundación
del ovocito, se produce en el tracto genital femenino donde el espermatozoide se libera del líquido
seminal.
La membrana plasmática recubre estrechamente el acrosoma y la región postacrosómica. Delimita una
escasa cantidad de citoplasma. En la zona donde parece unirse con la membrana nuclear se define una
depresión, el anillo posterior. Este anillo parece dividir la cabeza en dos partes.
o Hacia delante se encuentra la membrana temporal, que participa activamente en la reacción
acrosómica al fusionarse con la membrana acrosómica externa.
o Hacia atrás se extiende la zona de membrana estable.
B) Cuello
El cuello es la unión entre la cabeza y el flagelo y es una zona compleja y de gran importancia, que
soporta algunas estructuras esenciales:
o La pieza conectiva que tiene un denso capitel.
o La placa basal, adaptada en su forma a la fosa de implantación.
A partir del capitel se extienden hacia atrás 9 densas columnas segmentadas de 1 a 1,5 micras de largo,
que forman una especie de embudo, y se continúan en sus extremos con las nueve fibras externas
densas del flagelo.
El centriolo proximal está situado bajo la placa basal y a la entrada de ese embudo, pero formando un
ángulo de 70-80 grados con el eje del flagelo. Posee la estructura típica de nueve tríadas tubulares. El
par central de microtúbulos del axonema flagelar puede llegar por delante hasta el interior de la pieza
de conexión, incluso hasta el centriolo proximal. Generalmente en los espermatozoides maduros falta el
centriolo distal, el orientado según el eje del flagelo, pero residuos de sus nueve tripletes pueden estar
unidos a la cara interna de las columnas segmentadas.
En la región del cuello, y por fuera de la pieza de conexión pueden encontrarse algunas mitocondrias
orientadas longitudinalmente, que a veces emiten prolongaciones que se extienden entre las columnas
segmentadas.
C) Flagelo
El flagelo es una larga estructura filiforme de aproximadamente 50 μm de longitud. Está recubierto por
una vaina fibrosa en su primera fracción y luego solo por la membrana flagelar.
Posee una constitución interna común a la mayoría de los flagelos del reino animal. En el eje está el
axonema formado por dos microtúbulos centrales únicos, rodeados por nueve pares de microtúbulos
regularmente distribuidos. Son los microtúbulos A y B. Esta estructura se conoce como axonema 9+2.
Cada microtúbulo A posee dos brazos en gancho formados por la proteína dineina, la cual puede
hidrolizar las moléculas de ATP, produciendo la energía necesaria para impulsar el espermatozoide. Pero
el flagelo de los espermatozoides humanos se diferencia de otros en que el axonema está rodeado por
nueve fibras densas externas, lo que lo convierte en un modelo 9+9+2. Se considera que el axonema es
el componente motor y que las fibras densas externas son estructuras que dan firmeza al flagelo.
El flagelo se diferencia en tres regiones:
o La pieza intermedia mide de 5 a 7 μm. El axonema está en esta región rodeado por las fibras densas.
Se caracteriza por una vaina de mitocondrias orientadas circularmente y dispuestas extremo con
extremo para formar una espiral cerrada. Las mitocondrias producen la energía necesaria para el
movimiento en forma de ATP.
o La pieza principal mide unas 45 μm de longitud. El axonema conserva el mismo aspecto en todo el
trayecto pero las fibras densas se modifican, disminuyendo progresivamente de diámetro y
desapareciendo en un orden bien establecido, así por ejemplo las fibras 3 y 8 se incorporan a las
columnas longitudinales de la vaina fibrosa.
o La pieza terminal está formada sólo por el axonema, recubierto por la membrana flagelar. Además el
axonema pierde su disposición circular para hacerse desordenada.

ESPERMATOGÉNESIS

La espermatogénesis es un proceso complejo mediante el cual las células madres germinales se dividen
para renovarse y para generar células hijas que se convertirán en espermatozoides.
Este proceso que convierte una celula esférica diploide (46 cromosomas, XY) en cuatro células haploides
(23 cromosomas, X o Y) flageladas, ocurre dentro de los tubulos seminíferos en los testículos y dura
aproximadamente dos meses en los mamíferos. Los tubulos seminíferos están recubiertos por las
células de Sertoli, de sostén, las cuales están unidas fuertemente para dividir el espacio de los túbulos
seminíferos en dos compartimentos: el basal y el luminal, formando la base de la barrera hemato-
testicular con el fin de que la espermatogénesis ocurra en un sitio privilegiado inmunolóicamente, ya
que los espermatozoides comienzan a ser producidos en la pubertad y son considerados “extraños” para
el sistema inmune qye desarrolla el reconocimiento de lo propio durante el primer año de vida. Dentro
de los túbulos, las células germinales van formando capas dependiendo de su grado de difereciacion; es
decir, junto a la membrana basal yacen las espermatogonias, seguidas por los espermatocitos primarios,
espermatocitos secundarios y las espermátides cerca de la luz del túbulo.
Las espermátides maduran a espermatozoides funcionales en las células de Sertoli. Este proceso de
maduración se conoce con el nombre de espermatogénesis, el cual puede durar varias semanas y
consiste en una serie de eventos (formación del acrosoma, formación del flagelo, reorganización de las
mitocondrias alrededor de la parte media, condensación del núcleo al 10% del tamaño original y pérdida
de gran parte del citoplasma). Al completarse la maduración del espermatozoide, el citoplasma de las
células de Sertoli se retracta de alrededor del espermatozoide, liberándolo a la luz de los túbulos.
Los espermatozoides dentro de los testículos tienen poca o ninguna movilidad y son incapaces de
fertilizar el ovocito, adquieren su funcionalidad sólo después de atravesar el epidídimo, donde finalizan
su proceso de maduración. Esta etapa tiene una duración de 10 a 15 días.

EYACULACIÓN
En resumen, se distinguen distintas fases del eyaculado:
o El preeyaculado, en la cual vierten las secreciones de las glándulas bulbouretrales y glándulas de
Littre. Su función será la de lubricar la uretra como preparación de la eyaculación.
o Primera fracción del eyaculado, donde vierten las secreciones de la próstata que contribuye al
eyaculado con un porcentaje entre el 15 y el 30% del volumen final y las procedentes del testículo y
epidídimo que aportan entre un 5 y un 10%.
o Por último, la segunda fracción la constituyen las secreciones procedentes de las vesículas seminales
que aportan entre un 50 y un 70% del volumen final.

A) Recogida de la muestra completa

Un análisis de semen correcto se debe realizar sobre una muestra de semen completa:
o La primera parte del eyaculado aporta las secreciones del testículo-epididimo (en esta
fracción están los espermatozoides) y las secreciones de la próstata.
o La segunda parte corresponde a las secreciones de vesículas seminales.
Por tanto, si se derrama una fracción de la primera parte, al faltar parte de los espermatozoides
obtendremos una concentración irreal, más baja; y si se derrama una fracción de la segunda, la
fracción que aporta más volumen, lo que ocurrirá es que obtendremos un volumen más bajo y
una concentración espermática más alta. En consecuencia, una muestra incompleta debe ser
desechada.

-
Uno de los principales factores relacionados con la fertilidad es la producción espermática, que se
valora mediante el es-permograma. El mismo consiste en la evaluación macroscó-pica y
microscópica del semen. Lamentablemente la gran variabilidad intraindividual de los parámetros
del semen, limita la utilidad de este estudio dado que, muestras recogidas por un mismo individuo,
bajo las mismas condiciones y con el mismo período de absti-nencia, pueden mostrar variaciones
en todos los paráme-tros1, por lo que se sugiere realizar por lo menos dos esper-mogramas antes
de arribar a un diagnóstico definitivo

El espermograma es un examen de laboratorio esencial en la evaluación de la infertilidad para el

estudio de las enfermedades genitales masculinas y de otras patologías, como las provocadas por
la exposición a productos químicos, factores ambientales y medicamentos, entre otras causas. El
análisis del semen o espermograma incluye la evaluación de los espermatozoides, el plasma
seminal y la presencia de otras células como leucocitos y células de la línea germinal .También,
aporta información importante en cuanto al proceso de espermatogénesis, la función de los
espermatozoides y de las glándulas anexas. Se evalúan las características generales del semen
tanto macroscópicas: color y aspecto, viscosidad, licuefacción y volumen, como así también
parámetros microscópicos, tales como número de espermatozoides, movilidad, morfología y
vitalidad. Se debe realizar un control de calidad riguroso que garantice reproducir de los resultados
y minimice los errores inter e intra-observador. Esta guía da los lineamientos esenciales para la
realización de una correcta evaluación del semen humano, de acuerdo con las normativas de la
Organización Mundial de la Salud.

El análisis del semen o espermograma es una prueba de laboratorio simple de gran importancia para la
evaluación de la infertilidad de las parejas y para el estudio de las enfermedades genitales masculinas y
de otras patologías, como las causadas por la exposición a productos químicos, factores ambientales y
medicamentos, entre otras. Muchos de los parámetros y técnicas descritas hace más de 50 años
continúan teniendo validez en la actualidad. El espermograma básico evalúa las características generales
del semen, como son la apariencia y el volumen, el número de espermatozoides, la motilidad, la
morfología, la vitalidad y la presencia de leucocitos. El recuento y la motilidad de los espermatozoides
tienen utilidad para determinar si hay suficientes espermatozoides que puedan alcanzar el ovocito, en
tanto que la morfología de los espermatozoides se considera como el parámetro del espermograma que
más se asocia con la capacidad de fertilización. Otros parámetros adicionales a los ya mencionados,
como las pruebas inmunológicas que detectan anticuerpos contra los espermatozoides y las pruebas
funcionales como las de unión del espermatozoide a la zona pelúcida y penetración al ovocito, se
utilizan como pruebas complementarias en la evaluación de la pareja infértil. En este modulo se
presenta una descripción de los parámetros que componen un espermograma básico y correlaciona los
resultados con posibles alteraciones de los órganos masculinos.

Durante la eyaculación, los espermatozoides son liberados del epidídimo, donde se almacenan, a través
del conducto deferente y se mezclan con las secreciones de la próstata y otras glándulas para conformar
el semen.

-
Conclusión?
El espermograma tiene como finalidad evaluar el semen y los espermatozoides. Entre las principales
indicacoines se incluyen la evaluación de los órganos genitales masculinos, el estudio de la pareja infértil
y la búsqueda de espermatozoides después de una vasectomía o de una reversión de una vasectomía.
Tiene utilidad clínica como prueba de tamización para la infertilidad y para determinar su causa
probable. La combinación de varios de sus parámetros tiene mayor valor predictivo que el uso de los
parámetros individuales.
El espermograma tiene sus limitaciones y la mas importante es la variabilidad de los parámetros en un
mismo individuo. Es asi como las muestras recogidas por un mismo individuo, bajo condiciones iguales y
con el mismo periodo de abstinencia, pueden mostrar variaciones en todos los parámetros. Por lo tanto,
se sugiere hacer al menos dos espermogramas en muestras diferentes, antes de hacer un diagnóstico
definitivo.

Uno de los principales factores relacionados con la fertilidad es la producción espermática, que se
valora mediante el es-permograma. El mismo consiste en la evaluación macroscó-pica y
microscópica del semen. Lamentablemente la gran variabilidad intraindividual de los parámetros
del semen, limita la utilidad de este estudio dado que, muestras recogidas por un mismo individuo,
bajo las mismas condiciones y con el mismo período de absti-nencia, pueden mostrar variaciones
en todos los paráme-tros1, por lo que se sugiere realizar por lo menos dos esper-mogramas antes
de arribar a un diagnóstico definitivo
PROCEDIMIENTO

RESULTADOS
Licuefaccion completa
Semen: olor a orina . imp percibirlo
Olor característico
Hora 8:38 1 hr de reposo
Total volumen 3.5 ml
Tiene viscosidad y filancia 2 cm
Color gris y ligeramente amarillo – grisáceo
Aspecto opalescente
Ph 8.5 alcalino (7.2 – 7.5)
Translucido
Sin grumosidad negativo

EGO
Orina color amaerillo
Aspecto ligeramente turbio
Glucosa negativa
Bilirrubina negativa
Cetona 15 mg/dl
Sangre neg
Ph 6.5
Proteinas 30 mg/dl
Nitrito neg
Leucos 15 leu/ml
Urobilinógeno 0.2

Muestra de orina al microscopio

Eritrocitos escasos (0-2 campo)
Leucocitos 4-6 escasos
Cel espiteliales 0-2 escasos
Espermatozoides 0-3 campo escasos
Hebra de musina escasa
Bacterias no hay

Muestra de semen incubar 8:53-9:03

Muestra de orina centrifugar colorante de malbin para ego
Homogeneizar para desprender boron y colocar una gota para observar en el microscopio 10x y 40x
10 microlitros de semen y eosina al 1%

Para tomar muestra lo ideal debe ser entre 5 y 7 pm con 4 días de abstinencia
Mas de 15 dias de abstinencia no sirve la muestra

Control movilidad
A – 46
B – 29
C – 14
D – 20
5-6 leucocitos por campo
Nitrito escaso
25 muertos
46 vivos

4-5% anormalidad
Aglutinación inespecífica 0-3 campo

EXÁMEN MACROSCÓPICO

FÍSICO

Muestra de semen

Licuefacción: Normal

Volumen: 3,5 ml

Color: Grisáceo

Aspecto: Opalescente

Grumosidad: Negativa

Viscosidad: Normal

Filancia: 2 cm

EXÁMEN BIOQUÍMICO

pH: 8,5

EXÁMEN MACROSCÓPICO

Muestra de orina post-semen

Aspecto: Ligeramente turbio

Color: Amarillo

EXÁMEN BIOQUÍMICO

Glucosa: Negativa

Bilirrubina: Negativa

Cetona: 15 mg/dl

Sangre: Negativa

pH: 6,5

Proteínas: 30 mg/dl

Nitrito: Negativo

Leucocitos: 15 leu/ml
Urobilinógeno: 0.2

EXÁMEN MICROSCÓPICO

Muestra de orina

Eritrocitos: 0-2 por campo (escasos)

Leucocitos: 4-6 (escasos)

Células epiteliales: 0-2 (escasos)

Espermatozoides: 0-3 por campo (escasos)

Hebra de musina: Escasa

Bacterias: 0

Muestra de semen

Movilidad

Progresivos rápidos: 46

Progresivos lentos: 29

Móviles, pero no progresivos: 14

Inmóviles: 20

Vitalidad

Vivos: 25

Muertos: 46

Morfología

Espermatozoides normales: 95-96%

Espermatozoides anormales: 4-5%

Aglutinación

Inespecífica

0-3 por campo

Recuento:
 PROCEDIMIENTO
 El semen obtenido por masturbación, después de 3-4 días de abstinencia sexual. Debe
recogerse en un bote de boca ancha, limpio y seco. El preservativo no es válido como
método de recogida. La muestra debe mantenerse a temperatura cercana a los 37 ºC y
analizarse lo antes posible. El semen es potencialmente infeccioso, por lo que deben
mantenerse con él las mismas normas de seguridad que con la sangre.
EXÁMEN FÍSICO
Licuación
por observación, manteniendo la muestra en el baño a 37ºC
Volúmen
en probeta graduada o tubo de ensayo graduado, ambos precalentados a 37ºC
Color
Por observación. Ambas muestras
Viscosidad
Con pipeta pasteu, viendo como gotea la muestra
Filancia
Con ayuda de la varilla de vidrio
pH
con tiras de papel indicador, dejando caer una gota sobre ellas, esperando unos segundos
y leyendo el color en comparación con la carta de colores del envase.
EXÁMEN MICROSCÓPICO
Movilidad
dejar caer una gota de semen sobre un porta precalentado a 37ºC, colocar el cubre
procurando que no se formen burbujas y observar al microscopio con objetivo seco de x40.
Vitalidad: mezclar 50 μL de semen con 50 μL de eosina azulada al 1%, esperar 20-30
segundos y añadir 100 μL de nigrosina al 10%. Agitar y realizar una extensión sobre
portaobjetos. Tras el secado de la preparación, observar al microscopio con objetivo de
inmersión de x100. Debemos tener en cuenta que, si el número de muertos es mayor que
el de formas D, hay que corregir estas últimas.
Recuento: diluimos el semen al 1/21 en la solución de macomber-saunders (5g de
bicarbonato sódico, 1 mL de formol al 40% y agua destilada hasta 100 mL); para lograr la
dilución, ponemos 50 μL de semen con 1 mL de solución. Montamos y cargamos la
cámara de Neubauer y, tras 2 minutos de reposo en cámara húmeda, la ponemos al
microscopio y contamos los 16 cuadraditos de una de las esquinas.
Morfología: realizamos una extensión sobre portaobjetos con una gota de semen y
dejamos que seque perfectamente. Posteriormente fijamos con metanol y teñimos con
panóptico rápido. Tras secar, pasmos la preparación al microscopio y observamos.

-
° Se desinfecta la zona de trabajo y se alista el microscopio a 40x
° después se espera la muestra de semen (la muestra se almacena en el frasco estéril)
° se hacen las pruebas de temperatura, pH y viscosidad ya que si se espera más tiempo a estas
pruebas puede variar los resultados.[U2]
° después se realiza las pruebas de características organolépticas.
° se coloca una pequeña muestra tomándolo con un hisopo y se coloca el el porta objetos
después se enfoca para detectar a los espermas que estén en la muestra y se observa si hay
anormalidades y que tanto persisten

-En primer lugar realizaremos un examen físico del semen

*Observaremos licuación , color , volumen , viscosidad ,

filancia y pH.
-En segundo lugar procederemos a un examen microscópico
del semen .

*Veremos , movilidad poniendo una gota sobre un porta

caliente a 37ºC observando a 40x.

*Vitalidad , mezclando 50 microlitros de semen con 50

microlitros de eosina azulada , realizando una extensión y
observando a 100x

*Recuento , diluyendo el semen en solución de Macomber-

Saunders (5g de bicarbonato , 1 ml de formol y agua destilada
hasta 100ml).

-En tercer lugar realizaremos la morfología.

*Realizaremos una extensión sobre un porta con una gota de

semen que teñiremos con panóptico rápido.

-Por último realizaremos el Sperm-Martes.

*Colocando en un portaobjetos 10 microlitros de semen junto

otros 10 de partículas de látex del test , a continuación
añadiremos 10

microlitros de antisuero IgG SpermMar y observar a 40x.

-
EVALUACIÓN FÍSICA
Licuefacción
La licuefacción se realiza mediante una simple observación visual.
Viscosidad
Se recogió la muestra con pipeta pasteur dejando caer gota a gota.
En cualquiera de los dos métodos se considera anormal cuando se forma un filamento de más de
2 cm; para considerarse normal debe caer gota a gota.
No hay que confundir una muestra viscosa con una muestra no licuada. El aspecto de la muestra
puede ser líquido, homogéneo y luego hacer un gran filamento cuando la recogemos con pipeta
pasteur, en el caso de ser muy viscosa.
Apariencia
Volumen
Se necesitan recipiente de recogida graduados.
pH
Se utilizaron tiras de papel pH graduación 6-10. Se checó el color antes de 30 segundos. Se
situó la muestra sobre el papel y antes de transcurrido ese tiempo se debe hacer la lectura.
Chequear tiras reactivas con soluciones patrón de pH para asegurar la buena calidad de
nuestro resultado
EVALUACIÓN MICROSCÓPICA
Para su realización es imprescindible un microscopio. Se aconseja además que esté dotado de
contraste de fases y que cuente con la pletina termostatizada a 37ºC.
En la evaluación microscópica realizamos en primer lugar una observación a 100x, usando para
ello un ocular 10x y objetivo 10x. En esta primera observación vamos a estudiar las
agregaciones, las aglutinaciones y por último las células no espermáticas.
Pasaremos luego a colocar un objetivo 20x o 40x. La observación a 200x o 400x nos permite
hacer la estimación de la dilución que necesitamos para calcular la concentración espermática, y
también el estudio de la movilidad espermática.
Utilizaremos un simple portaobjetos con su cubreobjetos correspondiente, pero necesitaremos
que tenga una profundidad de campo de 20 micras, para que no se obstaculice el libre
movimiento de los espermatozoides. Teniendo en cuenta que la profundidad de campo es igual
al volumen de muestra dividido por el área que ocupa, las 20 micras de profundidad las
obtendremos de las siguientes combinaciones:
A) Observación a 100X
Colocamos por ejemplo, 10 μl de la muestra de semen en el porta y sobre él un cubre 22x22. Lo
ponemos en el microscopio atemperado a 37ºC, y observamos con el objetivo de 10x.
Agregaciones, aglutinaciones, células no espermáticas (células epiteliales y células redondas:
células germinales inmaduras y leucocitos).
B) Observación a 200X o 400X
Movilidad
Para la valoración de la movilidad, se monta el portaobjetos con 10, 6,5 u 11 μl de muestra y se
cubre con el cubreobjetos, 22x22, 18x18 o 21x26. Se deja en reposo 1 minuto a 37ºC y se sitúa
en microscopio de contraste de fases, atemperado a 37ºC. Se observa con el objetivo de 20x o
40x.
o Se intentará hacer en un área definida, para ello se imaginará un cuadrado en el
centro y esa será el área de contaje; lo perfecto sería disponer de una retícula
(Ilustración 3A).
o Cuando se cuenta un campo se debe iniciar el contaje inmediatamente, como si los
espermatozoides comenzaran a moverse en ese justo momento.
o Primero se cuentan los espermatozoides con movilidad progresiva, luego los
espermatozoides con movilidad no progresiva y por último los inmóviles, siguiendo el
sentido de las agujas del reloj (Ilustración 3B).
Se debe intentar hacer el contaje con un solo golpe visual, lo que se conseguirá tras un buen
adiestramiento, aunque parezca raro, esto es ideal ya que se consigue menor error que con el
sistema de ir contando uno a uno.
Estimación del recuento
Al igual que para el estudio de la movilidad, se procederá a montar el portaobjetos con 10 μl de
muestra (por ejemplo) y lo cubrimos con el cubreobjetos correspondiente, 22x22. Se deja en
reposo 1 minuto a 37ºC y se sitúa en el microscopio.
MORFOLOGÍA
Se ha de realizar por duplicado.
o Elegir dos portaobjetos y limpiarlos vigorosamente con papel por ambos lados.
Identificarlos.
o Hacer la extensión: con otro porta hacer un ángulo de unos 45º y tocando la gota
arrastrar en el sentido que marcan las flechas de la imagen. Hacerlo a una velocidad
tal que se tarde aproximadamente un segundo en hacer el arrastre de la gota sobre el
porta.
Proceder a alguno de los siguientes métodos de tinción:
o Papanicolaou.
o Shorr.
o Diff-Quik. Muy fácil de usar y muy usada hoy en día:
- Solución de fijación: 15 segundos en solución de Triarilmetano en Metanol o
1 hora en Metanol al 95%.
- Solución de tinción 1, Xanthene acidófilo: 10 segundos.
- Solución de tinción 2, Thiazine basófilo: 2-5 segundos.
- Agua: 10-15 veces.
- Dejar secar.
o Observar al microscopio a 1000 aumentos.
o Se deben contar al menos 200 spz/porta.
VITALIDAD
Con colorantes supravitales: Eosina y Eosina/Nigrosina.
Se basa en que los colorantes no pueden atravesar una membrana plasmática
estructuralmente intacta, de tal forma que un espermatozoide vivo será aquel cuyo
núcleo no está teñido de rojo; y en el caso de que la membrana esté estructuralmente
dañada será atravesada por los colorantes, por lo que un espermatozoide muerto será
aquel cuyo núcleo se tiña de rojo.
o Solución de Eosina:
Eosina Y .......................... 0,67 g
ClNa ................................ 0,9 g
Agua ............................... 100 ml
Disolver la Eosina y ClNa en agua purificada y calentada.
o Procedimiento de la Eosina (hacer por duplicado):
o Mezclar 5 μl de semen con 5 μl de la solución de eosina, en un portaobjetos.
o Cubrir con un cubreobjetos 22x22.
o Dejar la preparación 30 segundos en reposo.
o Observar en microscopio de contraste de fases a 400 aumentos. Contar al menos
200 spz/porta.
Diferenciar un espermatozoide vivo de uno muerto es
bastante fácil con estas técnicas:
o Los espermatozoides teñidos corresponden a los
muertos.
o Los no teñidos corresponde a los vivos. Si sólo se tiñe
la zona del cuello o la cabeza tiene una ligera
coloración rosa, se considera que el espermatozoide
está vivo.

OTRAS CÉLULAS
Para calcular la concentración de estas células podríamos recurrir al método ya visto, doble
dilución y medida en cámara de Neubauer improved. Se haría a la par que se realiza el contaje
de los espermatozoides para la medida de la concentración espermática. Sin embargo este
método no es muy apropiado, ya que salvo que haya una alta concentración de células redondas
las diluciones empleadas suelen ser demasiado altas como para poder realizar una medida
fiable, que recordemos pasa por contar al menos 400 elementos para obtener un error que no
supere el 5%.

ETAPA PRE ANALÍTICA

De acuerdo con las recomendaciones del Manual de Labora-torio para el estudio del semen de la
OMS – 20102, la mues-tra para el espermograma se debe tomar según las siguien-tes normativas:
1- El paciente debe recoger la muestra luego de 2 días y no más de 5 de abstinencia sexual previa al
examen (no mantendrá relaciones sexuales ni se masturbará). 2- Lo ideal es que la muestra se
recoja en la intimidad de una dependencia próxima al laboratorio para que sea procesada
rápidamente. De lo contrario, deberá ser trasladada al laboratorio antes de transcurrida una hora
de la recolección y se la protegerá de las temperaturas extremas (no menor de 20°C ni mayor de
37°C) durante el traslado al laboratorio. 3- La muestra deberá obtenerse mediante masturbación y
eyacularse dentro de un recipiente pequeño, limpio, de vidrio o plástico y de boca ancha. El mismo,
de ser posible, deberá estar tibio para reducir el riesgo de shock por frío. 4- Cuando por
circunstancias especiales no sea posible obtener el semen mediante masturbación, se podrá utilizar
un condón de plástico inerte específico para este fin (colector seminal). El coitus interruptus no es
aceptable para hacer la recolección del semen porque puede perderse la primera porción del
eyaculado que contiene la mayor concentración de espermatozoides. Además, puede existir
contaminación vaginal (células, bacterias) y el pH ácido vaginal ejerce un efecto adver-so sobre la
motilidad de los espermatozoides. 5- Las muestras incompletas no se deben analizar, pero en
aquellos casos tales como: dificultades psicológi-cas, imposibilidad de repetir el estudio, problemas
físi-cos, y otras circunstancias que así lo ameriten, se pro-cesará la muestra y se informará al
médico lo ocurrido. Las muestras de semen se deben analizar dentro de la pri-mera hora después
de su recolección.

Ph
El pH debe medirse cuando el semen está licuado en un tiempo estandarizado, preferentemente
después de 30 minutos de obtenido, de no ser posible se medirá dentro de la hora de la
eyaculación.
MICROSCOPIA
Luego de la evaluación macroscópica se homogeniza bien la muestra con pipeta Pasteur (la
homogenización no debe ser tan vigorosa que genere burbujas, porque éstas dificul-tan la
visualización) y se dispensa con pipeta automática un volumen tal de obtener una cámara entre
porta y cubre-objetos de alrededor de 20 μm de profundidad, la cual ga-rantiza el movimiento libre
de los espermatozoides, a la vez que se distribuirán en monocapa, por lo que no se observa-rán
diferentes planos microscópicos, como ocurre al utilizar un mayor volumen. Para lograr dicha
cámara, de emplear cubreobjetos de 22x22mm se deben dispensar 10 μl, con cubreobjetos de
24x24mm dispensar 12μ y con cubreobje-tos de 18x18mm dispensar 7μl.
En el análisis microscópico inicial se debe valorar la presen-cia de células no espermatozoides,
leucocitos, filamentos de moco, cristales (fosfato de espermina), hematíes, es-permatozoides
agrupados y otros elementos (Trichomonas vaginalis, levaduras, etc.).
Se debe efectuar una primera observación a bajo aumento (100x: lente objetivo de 10x y ocular de
10x) con el fin de visualizar fibras de moco, coágulos, espermatozoides agru-pados y luego se debe
pasar a una magnificación de 400x donde se realizará la clasificación de la movilidad esper-mática y
de los diferentes elementos presentes estimando además el número de espermatozoides por
campo para la determinación de la concentración espermática.
RECUENTO ESPERMATICO
1- Mezclar bien el semen sin formar burbujas y cargar, como ya se explicó, un volumen exacto de
semen licuado entre porta y cubreobjetos, para determinar la dilución adecuada a realizar. Ésta es
por lo general la muestra que se empleará para la evaluación de la motilidad. 2- Luego se mezcla el
semen y se preparan las diluciones con el fijador (5g de bicarbonato de sodio (NaHCO3) + 1ml de
formol al 35% (v/v) + H2O destilada c.s.p. 100 ml). (tabla 2). 3- Se carga la cámara cuenta células
(hemocitómetro) y se deja que los espermatozoides se asienten en la cámara hú-meda. La
evaluación de las muestras se debe realizar den-tro de los siguientes 10 a 15 minutos (después de
lo cual la evaporación tiene graves efectos). 4- Se deben contar al menos 100 espermatozoides por
du-plicado, cargando dos cámaras. Se cuentan únicamente es-permatozoides enteros (con cabeza y
cola). 5- Se comparan los recuentos replicados para ver si son aceptables y si es así, se promedian
los conteos; de no ser así, se preparan nuevas diluciones. 6- Se calcula la concentración de
espermatozoides por ml. 7- Se calcula el número total de espermatozoides por eyaculado.
MORFOLOGIA
1- Se debe realizar por duplicado. 2- Depositar de 5-10μl de muestra bien homogenizada en el
extremo del portaobjetos. 3- Extender la gota suavemente con otro portaobjetos.
Si la muestra tiene baja concentración se debe: 1- Centrifugar a 600g durante 10 mínutos. 2-
Posteriormente re suspender el pellet. 3- Se hace la extensión de la manera antes descripta. 4-
Secar la muestra al aire 5- Fijar 6- Colorear (Técnicas de coloración recomendadas: Papanicolaou o
Diff-Quick) 7- Evaluación de la morfología espermática por duplicado (% de formas normales) con
microscopio óptico con inmersión con objetivo 100x. 8- Si los porcentajes son promediables (ver
tabla 1) se in-forma el promedio de los porcentajes, sino se realizan otras dos evaluaciones. El valor
de referencia es ≥ 4% (formas normales)

Glucosa, bilirrubina, sangre, nitrito, cetona, proteínas, leucocitos, urobilinógeno