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Evaluación de la actividad antimicrobiana de


extractos de plantas frente a cepas bacterianas
multiresistentes

Data · April 2013

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3 authors:

Román Y Ramírez-Rueda Adriana Pedraza


University of Campinas University of Boyaca
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Mery Nair Saenz Rodriguez


Universidad Nacional Autónoma de México
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"Fitoquimica e avaliação in vitro do efeito antimicrobiano de produtos naturais (extratos vegetais,


óleos essenciais e substancias isoladas) frente microorganismos multiresistentes (bactérias, fungos e
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Evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos de plantas frente a cepas


bacterianas multiresistentes

Evaluation of antimicrobial activity of plant extracts against multiresistant bacterial


strains
1* 1 1
Román Yesid Ramírez Rueda . Adriana María Pedraza Bernal . Mery Naír Sáenz Rodríguez
1
Universidad de Boyacá. * Autor responsable de la correspondencia. Universidad de Boyacá.
Tunja. Carrera 2 Este No 64-169. Teléfono (0*8) 745-0000 Ext. 1112. E-mail
ryramirez@uniboyaca.edu.co

Resumen

Objetivo: Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos metanólicos y diclorometánicos de


seis plantas contra bacterias multiresistentes. Materiales y métodos: Los extractos fueron
obtenidos de las hojas de cada planta estudiada por el método e extracción con solventes
(metanol y diclorometano) y secados en rotaevaporador. Para evaluar la actividad
antimicrobiana se utilizó la técnica de dilución en agar (adaptada del EUCAST) para determinar
la CMI probando cinco diluciones (10, 5, 2, 1 y 0,5 mg/ml) contra seis cepas bacterianas con
resistencia múltiple a los antibióticos. Todos los ensayos se realizaron por duplicado y se
o
incubaron 24 horas a 37 C. Resultados: De los doce extractos de plantas analizadas, dos
mostraron efecto inhibitorio. Los extractos de Helichrysum italicum inhibieron las bacterias
grampositivas en estudio (S. aureus ATCC 43300 y E. faecalis ATCC 51299). La CMI con el
extracto metanólico para las dos cepas mencionadas anteriormente fue 1,0 mg/ml y con el
extracto diclorometánico fue de 0,5 mg/ml. Conclusión: El estudio de las propiedades
medicinales de las plantas ha generado resultados que han aportado soluciones a
problemáticas tan importantes como la malaria. En este caso el tamizaje de seis especies
vegetales dio como resultado el hallazgo de un ejemplar cuyos extractos metanólicos y
diclorometánicos inhiben en bajas concentraciones dos cepas bacterianas multiresistentes.
Esto representa una nueva fuente potencial de moléculas que podrían ser utilizadas como
alternativa en la lucha contra la resistencia bacteriana.

Palabras clave: Extractos Vegetales, Plantas Medicinales, Helichrysum, Fitoterapia,


Staphylococcus aureus Resistente a Meticilina

Abstract
Objective: To evaluate antimicrobial activity of dichloromethane and methanol extracts from six
plants against multi-resistant bacteria. Materials and methods: Extracts were obtained from
leaves of each plant studied using extraction with solvents method (methanol and
dichloromethane) and dried in a rotaevaporador. In order to evaluate antimicrobial activity agar
dilution technique was used (adapted from EUCAST) to determine MIC values of five dilutions
(10, 5, 2, 1 and 0.5 mg/ml) against six bacterial strains with multiple resistance to antibiotics. All
assays were performed in duplicate and incubated 24 hours at 37ºC. Results: From twelve
plant extracts tested, only two showed an inhibitory effect. Helichrysum italicum extracts showed
inhibition against gram-positive bacteria under study (S. aureus ATCC 43300 and E. faecalis
ATCC 51299). CMI of methanolic extract in before mentioned strains was 1.0 mg/ml and
dichloromethane extract was 0.5 mg/ml. Conclusion: Study of medicinal properties of plants
has generated results that have provided solutions to issues as important as malaria. In this
case screening from six plant species resulted in the finding of one of this with methanolic and
dichloromethane extracts of which at low concentrations inhibit two resistant bacterial strains.
This represents a potential source of new molecules that could be used as alternative against
anti-bacterial resistance.

Keywords: Plant Extracts, Plants Medicinal, Helichrysum, Phytotherapy, Methicillin-Resistant


Staphylococcus aureus
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Introducción procedimiento anterior pero con metanol,


El afán del hombre por desarrollar nuevas obteniéndose después de este
estrategias para combatir las bacterias y su procedimiento el extracto metanólico. Una
resistencia a los antimicrobianos lo ha vez obtenidos ambos extractos se retiró el
llevado a probar nuevas fuentes de solvente por medio de evaporación para lo
o
antibióticos o sustancias que sirvan para cual se utilizó un rotaevaporador a 40 C en
eliminarlas. Uno de estos recursos es la el caso del extracto diclorometánico y a
o
fitoterapia, que desde la antigüedad ha sido 60 C en el metanólico hasta obtener un
utilizada como fuente inagotable de material libre de solvente. Dicho material
recursos terapéuticos por chamanes y obtenido se almacenó en envase de vidrio
médicos brujos que por empirismo o ámbar y se refrigeró hasta el momento de
tradición han creado compuestos a base de su uso.
plantas para curar todo tipo de
enfermedades, incluidas las infecciones Determinación de actividad
bacterianas (1). Esta sabiduría popular ha antimicrobiana: Los extractos
sido recientemente puesta en el ojo de la diclorometánicos y metanólicos de las seis
ciencia, puesto que científicos alrededor del plantas anteriormente mencionadas se
mundo están empleando variadas técnicas probaron contra seis cepas bacterianas con
para conocer los secretos terapéuticos que resistencia múltiple a los antibióticos:
se esconden en las plantas. Ejemplo de lo Staphylococcus aureus ATCC 43300,
anterior son los múltiples estudios hechos Enterococcus faecalis ATCC 51299,
alrededor del mundo y el crecimiento en Escherichia coli ATCC 35218,
publicaciones por búsqueda en PubMed Acinetobacter baumannii ATCC 19606,
que se refleja en un aumento de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 y
aproximadamente un 300%, siendo el Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. La
número de artículos publicados hasta técnica utilizada fue la dilución en agar,
diciembre de 1994 de 167 lo que contrasta tomada y adaptada de las técnicas usadas
con 307 encontrados hasta diciembre de por el EUCAST (European Committee on
2004 (2). Antimicrobial Susceptibility Testing) para
Para este trabajo se utilizaron extractos determinar la concentración mínima
metanólicos y diclorometánicos de seis inhibitoria (CMI) de agentes
plantas encontradas comúnmente del antimicrobianos a bacterias no fastidiosas
altiplano cundiboyacense colombiano, los (3). Para tal fin, se pesaron las cantidades
cuales fueron evaluados para determinar necesarias de cada extracto para obtener
su capacidad inhibitoria frente a cepas cinco diluciones (10, 5, 2, 1 y 0,5 mg/ml)
bacterianas con resistencia múltiple a los con volumen final de 10 ml de agar por
antibióticos. cada una de las plantas estudiadas. Previo
a la mezcla con el agar, cada cantidad de
extracto se solubilizó mezclándolo con 200
Materiales y Métodos µl de dimetil sulfóxido al 99,5% (DMSO).
Se utilizó un inóculo bacteriano de una
Obtención de los extractos: Las hojas de 4
concentración equivalente a 10 UFC/ml,
Potentilla candicans, Borago officinalis, sembrando 1 µl de cada uno en la
Gnaphalium viravira, Caesalpinia spinosa, superficie de la placa, la cual se dividió en
Taraxacum officinalis y Helichrysum seis partes asignando el área
italicum, fueron recolectadas, correspondiente a cada una de las
o
posteriormente deshidratadas a 40 C y bacterias en estudio. Adicional a lo anterior
finalmente pulverizadas. La extracción se se realizó el montaje de controles: de
llevó a cabo con dos solventes esterilidad (placa de Müller Hinton sin
sucesivamente (primero con diclorometano inocular y sin extracto), de inhibición
al 95% y luego con metanol al 95%) (Cloranfenicol 50 µg/ml), del diluyente
poniendo en contacto una parte de la (DMSO al 5%), de crecimiento (placa
planta con cinco del solvente (p/v) y inoculada con las seis cepas bacterianas
dejando esta mezcla en agitación continua en estudio pero sin extracto). Todos los
a bajas revoluciones por 24 horas a montajes descritos se realizaron por
temperatura ambiente. Una vez pasado duplicado. Después de inoculadas las
este tiempo el extracto diclorometánico se placas, se dejaron secar y se incubaron 24
filtró y la fase sólida (pulverizado de la o
horas a 37 C.
planta) se dejó secar a temperatura
ambiente para luego someterlo al mismo
Resultados
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Los controles mostraron los resultados (figura 1), la inocuidad de diluyente


esperados, comprobándose así la (DMSO) y la esterilidad del medio de cultivo
viabilidad de las seis cepas bacterianas
.

Figura 1. Control de crecimiento bacteriano

1. Staphylococcus aureus ATCC 43300, 2. Enterococcus faecalis ATCC 51299 3. Escherichia coli ATCC 35218, 4.
Acinetobacter baumannii ATCC 19606, 5. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, 6. Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853.
observarse la ausencia de crecimiento en
De los doce extractos derivados de las seis las áreas 1 y 2 de la cuadrícula,
plantas analizadas, solo dos mostraron (demarcado con las flechas) lo que indica
efecto inhibitorio. Tanto el extracto inhibición bacteriana en las dos
metanólico y diclorometánico de repeticiones del ensayo.
Helichrysum italicum mostraron inhibición Se refiere en la literatura que efectos
para las bacterias grampositivas evaluadas inhibitorios por debajo de 1 mg/ml para
(S. aureus ATCC 43300 y E. faecalis ATCC extractos son interesantes y representan un
51299). La CMI con el extracto metanólico potencial real de inhibición para
para las dos cepas en mención fue 1,0 exploraciones más profundas de la
mg/ml y con el extracto diclorometánico fue capacidad inhibitoria del espécimen
de 0,5 mg/ml. En la figura 2 puede analizado (2).

Figura 2. Ensayo de inhibición del extracto diclorometánico de Helichrysum italicum en una


concentración final de 0,5 mg/ml
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Discusión Helichrysum italicum es una y B. cereus en concentraciones por debajo


planta de la familia Asteraceae, que se de 0,1 mg/ml lo que resulta bastante
presenta como un arbusto perenne de poca coincidente con este estudio, en el cual
altura, (20 – 30 cm) leñosa, con hojas también solo hubo efecto contra bacterias
lanceoladas y flores amarillas dispuestas grampositivas con resistencia múltiple a los
en inflorescencias compactas. Puede antibióticos (S. aureus ATCC 43300 y E.
crecer en una gran variedad de climas, faecalis ATCC 51299). Aunque tampoco se
tolerar fuertes vientos, prefiere suelos evaluó la especie italicum (H. italicum) es
ácidos y requiere de la luz directa del sol de denotar que este género de plantas es
para su buen desarrollo. Sus flores se han de gran interés en la búsqueda de
utilizado desde tiempos inmemoriales como antimicrobianos naturales y que las CMI
antiinflamatorio, digestivo, antimicrobiano y mostradas ameritan posteriores estudios.
colerético (4). En adición a los extractos de Helichrysum,
sus aceites esenciales también han sido
Los componentes químicos que se estudiados, lo que se evidencia en un
presentan en mayor proporción su aceite estudio donde se probaron los aceites
esencial son el nerol, acetato de nerilo, esenciales y extractos acetónicos y
propionato de nerilo, butirato de nerilo, E- metanólicos de cuatro especies de
nerolidol, geraniol y acetato de geranilo (5). Helichrysum (H. dasyanthum, H. felinum, H.
Por su contenido de flavonoides y excisum y H. petiolare) contra B. cereus y
terpenoides H. italicum ha sido reconocida S. aureus, tales ensayos concluyeron que
como una planta inhibidora de la dermatitis las cuatro especies de Helichrysum
de contacto (6). evaluadas poseen efecto inhibitorio en
Se han llevado a cabo investigaciones en concentraciones que van desde 0,015
donde se evalúa la capacidad antioxidante mg/ml hasta 8 mg/ml. Adicionalmente a
y antimicrobiana de diferentes especies de estos ensayos, fueron determinados por
Helichrysum, tal es el caso de un estudio cromatografía de gases acoplada a
hecho en Turquía por Albayrak y espectrometría de masas los principales
colaboradores (7) en el cuál se probaron compuestos de los aceites esenciales
extractos metanólicos de 16 especies de siendo estos principalmente monoterpenos
Helichrysum (pero no la especie italicum) (α-pineno, 1,8-cineol y p-cimeno) (9).
contra 15 microorganismos entre ellos Así como en las anteriores investigaciones
bacterias grampositivas, gramnegativas, se efectúan tamizajes de varias especies
micobacterias y levaduras. Los resultados de Helichrysum, también hay grupos
demostraron que la mayoría de estas dedicados solo a estudiar específicamente
especies poseían efecto antimicrobiano en ciertas especies, tal es el caso de Drewes y
al menos un 10% contra bacterias colaboradores, que en 2006 publicaron los
grampositivas (excepto Bacillius cereus) y resultados de una investigación sobre
gramnegativos (excepto Proteus mirabilis y Helichrysum tenax, en la cual evalúan la
Yersinia enterocolitica) y cinco de ellas capacidad antimicrobiana de diterpenos
contra Mycobacterium smegmatis. Para las mono y diméricos extraídos de las hojas de
levaduras solo se probaron 8 de los 16 la especie de Helichrysum en mención
extractos teniendo mayor efecto contra comparados con el extracto hexánico
Candida albicans que contra crudo, tal investigación demostró que
Saccharomyces cerevisiae. Tales algunas veces las mezclas (extractos
resultados demuestran el potencial crudos) son más efectivas que los
inhibitorio del género Helichrysum, sin componentes individuales y en otras los
embargo nuestros resultados no solo están componentes individuales son más
respaldados por este estudio, una efectivos, lo que hace pensar que existe
investigación que por sus métodos es fenómenos de sinergia y antagonismo en
comparable en alto grado con la presente, las mezclas. Los resultados más llamativos
es la realizada recientemente en África por de tal investigación se relacionan con la
Lourens y su equipo (8), en la cual se inhibición de B. cereus a una concentración
determinó el efecto antimicrobiano de de 0,0036 mg/ml de un derivado del
extractos de 35 especies de Helichrysum 15β,16β-epoxido-ent-beyeran-19-ol en
que se probaron contra cinco cepas comparación al extracto crudo (de donde
bacterianas (3 grampositivas y 2 se asiló el componente) que fue de 0,057
gramnegativas) y una fúngica mg/ml, en contraste a esto para S. aureus
(Cryptococcus neoformans) probando el el componente aislado que mejor
efecto antimicrobiano de siete de las comportamiento presentó fue el derivado
especies de Helichrysum contra S. aureus
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18-ol del compuesto citado anteriormente el investigaciones encaminadas a probar la


cual inhibió esta bacteria a una acción antimicrobiana de algunos de estos
concentración de 0,0057 mg/ml comparado compuestos tales como la apigenina, la
con la CMI del extracto crudo que fue luteolina y el kaempferol entre otros,
0,0036 mg/ml (10). Estas CMI probadas mostraron buena acción antimicrobiana
son bastante inferiores a las del presente sobre cepas de P. aeruginosa (0,625
estudio, pero no se descarta que mg/ml) y C. albicans (0,312 mg/ml) con
Helichrysum italicum pueda presentar CMI extractos de H. chasmolycicum (14). En
tan bajas como estas; tales CMI no fueron contraste a lo encontrado en el estudio
evaluadas por la incapacidad técnica de anteriormente mencionado, el mismo
pesar cantidades por debajo de 5 mg. investigador en el año 2005 había probado
También se referencian investigaciones en varios de estos flavonoides extraídos de H.
las que se estudian solo extractos de compactum con resultados más discretos
Helichrysum italicum, en uno de estas se para la apigenina y el kaempferol,
determinó la acción del extracto dieltil- obteniendo CMI del orden de 40 mg/ml
etereo de Helichrysum italicum contra el para bacterias grampositivas,
crecimiento y la actividad enzimática de S. gramnegativas (incluída P. aeruginosa) y C.
aureus sensible y resistente a meticilina, en albicans (15), estos resultados hacen
el cual se obtuvo inhibición en pensar que existen variaciones entre
concentraciones de hasta 0,125 mg/ml y de ensayos hechos en diferentes especies, de
reducción de la actividad enzimática de la lo cual podría presumirse que los
coagulasa, lipasa, DNAsa y termonucleasa compuestos extraídos de una planta
que son considerados como importantes poseen pequeñas variaciones estructurales
factores de virulencia del microorganismo con respecto a los de otras plantas de
en cuestión (11). Comparado con el diferente especie.
presente estudio, el descrito anteriormente Recientemente se ha publicado un estudio
solo supera en 4 veces la CMI encontrada que muestra el avance en las fases de
(0,5 mg/ml) lo que sugiere que los ensayos experimentación al que se ha llegado en la
se desarrollaron correctamente y que investigación de los efectos farmacológicos
metodología usada es ideal para seguir de especies de Helichrysum, en este caso
investigando en el área y más con la especie plicatum, cuyo extracto
específicamente con Helichrysum italicum. hidro-etanólico fue evaluado para
Adicional a los estudios de inhibición comprobar el efecto en la formación de
microbiana, también se han desarrollado cálculos renales de oxalato de calcio en
estudios sobre la toxicidad de compuestos modelos murinos, ya que dicho efecto es
fenólicos como el arzanol (presente en conocido en la medicina tradicional pero sin
Helichrysum italicum) que demuestran ninguna base científica que el mismo efecto
mínima toxicidad en sistemas in-vitro, lo reportado por los usuarios de dicho
que demuestra la inocuidad de algunos de tratamiento. Tras los análisis se demostró
sus componentes y hace a esta planta que en el grupo de las ratas que fueron
candidata para efectuar pruebas in-vivo tratadas con el extracto en mención se
(12). Lo anteriormente expuesto es una redujo sustancialmente la formación de
razón más para pensar que Helichrysum cálculos renales de oxalato de Calcio con
italicum es un espécimen con alto potencial dosis de 125 mg/ml, observándose un
para ser usado como una fuente de nuevas efecto dosis dependiente con la casi
sustancias antimicrobianas naturales. desaparición de depósitos de los cristales
Especies del género Helichrysum no solo en dosis de 500 mg/ml, sin efectos
han sido usados como antibacterianos, secundarios (16). Con base en el anterior
también se ha evaluado su capacidad estudio y los otros mencionados aquí,
antiviral in-vitro contra el virus Herpes podría generalizarse que los metabolitos
simplex tipo I (VHS-1), en esta contenidos en las especies de Helichrysum
investigación extractos acuosos a no representan peligros potenciales al
concentraciones de 1,35 mg/ml inhibieron menos en animales de experimentación en
la acción del HSV-1 en fibroblastos los que se han hecho ensayos clínicos
humanos sin exhibir efecto citopático controlados, sumado al hecho que algunos
alguno (13). extractos acuosos son de consumo
Los flavonoides son moléculas que poseen humano por tradición y creencia popular sin
importante acción antimicrobiana, algunos que se haya conocido oficialmente efectos
de estos se encuentran en buena cantidad secundarios. Todo lo anteriormente
en varias especies de Helichrysum; expuesto reitera la afirmación hecha en el
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trascurso del escrito la cual invita a hacer 8. Lourens A, Van Vuuren S, Viljoen
investigación de mayor nivel sobre A, Davids H, Van Heerden F. Antimicrobial
Helichrysum italicum no solo para evaluar activity and in vitro cytotoxicity of selected
su capacidad antimicrobiana sino en otros South African Helichrysum species. S Afr J
varios aspectos farmacológicos. Bot. 2011;77(1):229-35.

Conflicto de Intereses 9. Lourens A, Reddy D, Başer K,


Los autores no declaran ningún conflicto de Viljoen A, Van Vuuren S. In vitro biological
intereses. activity and essential oil composition of four
indigenous South African Helichrysum
species. J Ethnopharmacology. 2004;95(2-
Agradecimientos 3):253-8.
Al personal del laboratorio del Centro de 10. Drewes S, Mudau K, van Vuuren S,
Diagnóstico en Sanidad Vegetal de la Viljoen A. Antimicrobial monomeric and
Universidad Pedagógica y Tecnológica de dimeric diterpenes from the leaves of
Colombia por el apoyo técnico brindado Helichrysum tenax var tenax.
para el desarrollo del estudio. Phytochemistry. 2006;67(7):716-22.

11. Nostro A, Bisignano G, Cannatelli


A, Crisafi G, Germanò P, Alonzo V. Effects
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