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Libro de texto de color de Histología, tercera edición

LESLIE P. GARTNER, y James L. HIATT


Capítulo 1, 1-10

Capítulo 1

Introducción a la histología y técnicas histológicas básicas

Histología es la rama de la anatomía que estudia los tejidos de animales y plantas. Este libro de texto, sin embargo, analiza único animal, y más específicamente
humana, tejidos. En su aspecto más amplio, la palabra histología se utiliza como si fuera un sinónimo de anatomía microscópica, debido a su objeto abarca no sólo
la estructura microscópica de tejidos sino también la de los sistemas de células, órganos y de órganos.

El cuerpo está compuesto de células, matriz intercelular, y una sustancia fluida, fluido extracelular (líquido de tejidos), que baña estos componentes. fluido extracelular, que se
deriva a partir de plasma de sangre, transporta nutrientes, oxígeno y moléculas de señalización a las células del cuerpo. A la inversa, las moléculas, los productos de desecho,
y dióxido de carbono liberado por las células del cuerpo señalización llegar a vasos sanguíneos y linfáticos por medio del fluido extracelular. líquido extracelular y gran parte de
la matriz intercelular no son visibles en preparaciones histológicas de rutina, sin embargo, su presencia invisible ha de ser apreciados por el estudiante de la histología.

El tema de la histología ya no es sólo se ocupa de la estructura del cuerpo; También se ocupa de la función del cuerpo. De hecho, la histología tiene una
relación directa con otras disciplinas y es esencial para su comprensión. Este libro de texto, por lo tanto, entrelaza las disciplinas de biología celular,
bioquímica, fisiología, embriología, la anatomía macroscópica, y, cuando proceda, la patología. Los estudiantes reconocerán la importancia de este tema, ya
que se refieren al texto más adelante en sus carreras. Un excelente ejemplo de esta relación será evidente cuando el lector aprende sobre la histología del
riñón y da cuenta de que es la estructura intrincada y casi sublime de ese órgano (hasta el nivel molecular) que es responsable de la capacidad del riñón para
realizar su función . Las alteraciones del riñón'

El resto de este capítulo se describen los métodos utilizados por histólogos para estudiar la anatomía microscópica del cuerpo.

Preparación de tejidos

microscopía de luz

Pasos requeridos en la preparación de tejidos para microscopía de luz incluyen (1) de fijación, (2) la deshidratación y de compensación, (3) la incrustación, (4) el corte, y (5) de
montaje y la tinción de las secciones.

Diversas técnicas se han desarrollado para preparar tejidos para el estudio de modo que se parecen mucho a su estado natural, viviendo. Los pasos a seguir son fijación,
deshidratación y claro, la incrustación en un medio adecuado, seccionamiento en rodajas finas para permitir la visión por transiluminación, montaje secciones sobre una
superficie para facilitar la manipulación, y tinción ellos de modo que los diversos componentes de tejidos y células se pueden diferenciar.

Fijación

La fijación se refiere al tratamiento del tejido con agentes químicos que no sólo retardan las alteraciones del tejido posterior a la muerte (o después de la eliminación del
cuerpo), sino también mantener su arquitectura normal. Los agentes fijadores más comunes utilizados en la microscopía de luz son tamponada neutra formalina y de líquido
de Bouin. Ambas sustancias proteínas de entrecruzamiento, manteniendo así una imagen realista del tejido.

La deshidratación y la Compensación

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Debido a que una gran fracción del tejido está compuesto de agua, una serie graduada de baños de alcohol, comenzando con alcohol 50% y progresando en pasos
graduales a alcohol 100%, se utilizan para eliminar el agua ( deshidración). El tejido se trata con xileno, una sustancia química que es miscible con parafina fundida.
Este proceso se conoce como claro, debido a que el tejido se vuelve transparente en xileno.

Incorporación

Con el fin de distinguir las celdas superpuestas en un tejido y la matriz extracelular uno del otro, el histólogo debe
empotrar los tejidos en un medio apropiado y luego los cortar en secciones delgadas. Por microscopía de luz, el medio de inclusión habitual es de parafina. El tejido se
coloca en un recipiente adecuado de parafina derretida hasta que esté completamente infiltrado. Una vez que el tejido se infiltra con parafina, se coloca en un pequeño
recipiente, cubierto con parafina fundida, y se deja endurecer, formando un bloque de parafina que contiene el tejido.

Seccionamiento

Después de que los bloques de tejido se recortan de material de incrustación exceso, que están montados para seccionar. Esta tarea se realiza usando un microtomo, una
máquina equipada con una cuchilla y un brazo que avanza el bloque de tejido en incrementos iguales específicos. Para la microscopía de luz, el espesor de cada sección es
de aproximadamente 5 a 10 m.

Seccionamiento también se puede realizar en muestras congeladas ya sea en nitrógeno líquido o en la barra de rápida congelación de un criostato. Estas secciones se
montan por el uso de un medio de montaje rápido de congelación y se seccionaron a temperaturas bajo cero por medio de una cuchilla de acero pre-enfriado. Las
secciones se colocan en portaobjetos de vidrio pre-enfriado, permite llegar a temperatura ambiente, y se tiñeron con colorantes específicos (o tratados para estudios
histoquímicos o inmuno).

El montaje y la tinción

Las secciones de parafina se montan (colocados) en portaobjetos de vidrio y después se tiñeron por manchas solubles en agua que permiten la diferenciación de los diversos componentes
celulares.

Las secciones para microscopía de luz convencional, cortados por cuchillas de acero inoxidable, se montan en portaobjetos de vidrio recubiertas de adhesivo. Debido a que muchos
constituyentes de tejido tienen aproximadamente las mismas densidades ópticas, deben ser manchado para microscopía de luz, normalmente con manchas solubles en agua. Por lo
tanto, la parafina primero debe ser retirado de la sección, después de lo cual se rehidrata y se tiñó el tejido. Después de la tinción, la sección es de nuevo deshidratado de modo que el
cubreobjetos se puede fijar de forma permanente por el uso de un medio de montaje adecuado. El cubreobjetos no sólo protege el tejido de los daños, pero también es necesario para
la visualización de la sección con el microscopio.

Varios tipos de manchas se han desarrollado para la visualización de los muchos componentes de células y tejidos; que pueden agruparse en tres clases:

Manchas que diferencian entre los componentes ácidos y básicos de la célula

manchas especializados que diferencian a los componentes fibrosos de la matriz extracelular

Las sales metálicas que se precipitan sobre los tejidos, la formación de depósitos de metal en ellos las manchas más comúnmente utilizados en la histología son hematoxilina

y eosina (H & E). Hematoxilina es una base que preferencialmente colores los componentes ácidos de la célula de un tinte azulado. Debido a que los componentes más ácidos son

el ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), el núcleo y las regiones del citoplasma rico en ribosomas mancha azul oscuro; estos componentes se denominan basófilo.

Eosina es un ácido que tiñe los componentes básicos de la célula de un color rosáceo. Debido a que muchos componentes citoplasmáticos tienen un pH básico, las regiones del

citoplasma de manchas de color rosa; estos elementos se dice que son acidófilas. Muchas otras manchas también se utilizan en la preparación de muestras para estudio

histológico ( Tabla 1-1 ). Tabla 1-1

Las manchas comunes histológico y reacciones

Reactivo Resultado

hematoxilina Azul: núcleo; regiones ácidas del citoplasma;

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Reactivo Resultado

matriz del cartílago

Rosado: regiones básicas del citoplasma; fibras de colágeno


eosina

Azul oscuro: núcleos

tricrómico de Masson Rojo: músculo, queratina, citoplasma

Azul claro: mucinogen, colágeno

tinción elástica de orceina Marrón: fibras elásticas


tinción elástica de Weigert Azul: fibras elásticas
tinción de plata Negro: fibras reticulares

hematoxilina de hierro Negro: estriaciones del músculo, núcleos, eritrocitos


Magenta: moléculas de glucógeno y ricos en carbohidratos
Ácido periódico de Schiff

Rosado: eritrocitos, gránulos de eosinófilos


Wright y manchas de Giemsa (utilizado para la tinción diferencial de las células

de la sangre) Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos

Las moléculas de algunas manchas, tales como azul de toluidina, polimerizar uno con el otro cuando se exponen a altas concentraciones de polianiones en el tejido. Estos

agregados difieren en el color de sus moléculas individuales. Por ejemplo, toluidina manchas azules tissues azul a excepción de los que son ricos en polianiones (por ejemplo, la

matriz del cartílago y gránulos de mastocitos), que mancha púrpura. Un componente de tejido o célula que tiñe de color púrpura con esta mancha se dice que es metacromática, y

azul de toluidina se dice que exhiben metacromasia. Los microscopios de luz

Los microscopios compuestos se componen de una disposición específica de lentes que permiten una alta ampliación y buena resolución de los tejidos que se
está viendo.

El microscopio de luz actual utiliza una disposición específica de grupos de lentes para ampliar una imagen ( Fig. 1-1 ). Debido a que este instrumento utiliza más que una
sola lente, que se conoce como una microscopio compuesto. La fuente de luz es una bombilla eléctrica con un filamento de tungsteno, cuya luz se recoge en un haz
enfocado por el lentes condensadores.

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Figura 1-1

Comparación de la luz, electrónica de transmisión, y microscopios electrónicos de barrido.

El haz de luz se encuentra a continuación y se centra en la muestra. La luz que pasa a través de la muestra entra en una de las lentes del objetivo; estas lentes se sientan en
una torreta móvil situada justo por encima de la muestra. Por lo general, cuatro lentes del objetivo están disponibles en una sola torreta, proporcionando aumentos del petróleo
baja, media, alta y. Generalmente, en la mayoría de los microscopios de las tres primeras lentes magnifican 4, 10, y 40 veces, respectivamente, y se utilizan sin aceite; la lente
de aceite aumenta la imagen 100 veces.

La imagen de la lente objetivo se reunieron y reforzado por la lente ocular del ocular. Esta lente generalmente aumenta la imagen en un factor de 10-para
aumentos totales de 40, 100, 400, y 1000-y se centra la imagen resultante en la retina del ojo.

Focalización de la imagen se realiza mediante el uso de botones moleteados que se mueven las lentes del objetivo arriba o hacia abajo por encima de la muestra. El

mando de enfoque grueso moverá en incrementos más grandes que el mando de enfoque fino hace. Es interesante que la imagen proyectada en la retina está invertida de

derecha a izquierda y al revés. La calidad de una imagen no sólo depende de la capacidad de una lente para magnificar sino también de su resolución -la capacidad de la

lente para mostrar que dos objetos distintos están separados por una distancia. La calidad de una lente depende de lo cerca que su resolución se acerca al límite teórico de

0,25 m, una restricción que se determina por la longitud de onda de la luz visible. Hay varios tipos de microscopios de luz, que se distinguen por el tipo de luz que se utiliza

como fuente de luz y la manera en que usan la fuente de luz. Sin embargo, se requiere que la mayoría de los estudiantes de la histología de reconocer sólo las imágenes

obtenidas de microscopía de luz compuesto, microscopía electrónica de transmisión y microscopía electrónica de barrido; por lo tanto, no se discuten los otros tipos de

microscopios de luz.

Técnicas de imagen digital

técnicas de imagen digital emplean la tecnología informática para capturar y manipular imágenes histológicas.

El advenimiento de la tecnología informática ha proporcionado un medio de captura de imágenes digitalmente, sin el uso de la película. Aunque este método de captura de imágenes aún
no puede competir con la tecnología de película, tiene varias ventajas que lo convierten en una herramienta valiosa:

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visualización inmediata de la imagen adquirida

modificación digital de la imagen

La capacidad de mejorar la imagen mediante el uso de software disponible en el mercado

Además, debido a que estas imágenes se almacenan en un formato digital, cientos de ellos pueden ser archivados en un solo disco CD-ROM y su recuperación es
casi instantánea. Por último, su formato digital permite la transmisión electrónica de estas imágenes por e-mail o la distribución a través de Internet.

Interpretación de secciones microscópicas

Una de las habilidades más difíciles, frustrantes, y que consumen mucho tiempo se necesitan en la histología es interpretar lo que una sección de dos dimensiones se ve como en
tres dimensiones. Si se imagina una manguera de jardín en espiral y luego tomar las secciones delgadas de que la manguera, se verá que el objeto tridimensional no es
necesariamente distinguirse de cualquier uno de las secciones bidimensionales ( Fig. 1-2 ). Sin embargo, mediante la visualización de todas las secciones extraídas del tubo en espiral,
se puede reconstruir mentalmente la imagen tridimensional correcta.

Figura 1-2

Histología requiere una reconstrucción mental de imágenes bidimensionales en el sólido tridimensional de la que fueron seccionados. Aquí,
un tubo curvado se secciona en diversos planos para ilustrar la relación entre una serie de secciones de dos dimensiones y su estructura
tridimensional.

Procedimientos de visualización avanzada

histoquímica

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Histoquímica es un método de tejido de tinción que proporciona información sobre la presencia y localización de macromoléculas intracelulares y extracelulares.

constituyentes químicos específicos de tejidos y células se pueden localizar mediante los métodos de la histoquímica y citoquímica. Estos métodos capitalizar
sobre la actividad enzimática, reactividad química, y otros fenómenos físico-químicas asociadas con el constituyente de interés. Reacciones de interés son
monitoreados por la formación de un precipitado insoluble que lleva en un determinado color. Con frecuencia, histoquímica se realiza en tejidos congelados y se
puede aplicar tanto a la luz y microscopía electrónica.

Una reacción histoquímica común utiliza el reactivo de ácido periódico de Schiff (PAS), que forma un precipitado de color magenta con las moléculas ricas en glucógeno y
moléculas ricos en carbohidratos. Para asegurar que la reacción es específica para glucógeno, secciones consecutivas son tratados con amilasa. Por lo tanto, las secciones
no tratadas con amilasa muestran un depósito magenta, mientras que las secciones de amilasa tratados muestran una falta de tinción en la misma región.

Aunque las enzimas pueden ser localizados por procedimientos histoquímicos, se visualiza el producto de la reacción enzimática en lugar de la propia enzima. El
reactivo está diseñado para que el producto precipita en el sitio de la reacción y es visible ya sea como metálico o un depósito de color.

La inmunocitoquímica

La inmunocitoquímica utiliza anticuerpos fluoresceinados y anti-anticuerpos para proporcionar intracelular más precisa y localización extracelular de
macromoléculas que es posible con histoquímica.

Aunque los procedimientos histoquímicos permiten relativamente buena localización de algunas enzimas y macromoléculas en células y tejidos, localización más
precisa se puede lograr mediante el uso de inmunocitoquímica. Este procedimiento requiere el desarrollo de un anticuerpo contra la macromolécula particular para
ser localizado y marcar el anticuerpo con un colorante fluorescente tal como fluoresceína o rodamina.

Hay dos métodos de marcaje de anticuerpos: directos e indirectos. En el método directo ( Fig. 1-3 ) El anticuerpo contra la macromolécula está marcada con un
colorante fluorescente. Se permite entonces El anticuerpo que reaccione con la macromolécula, y el complejo resultante puede ser visto con un microscopio de
fluorescencia ( Fig. 1-4 ).

Figura 1-3

Los métodos directos e indirectos de inmunocitoquímica. A la izquierda, un anticuerpo contra el antígeno se marca con un colorante fluorescente y visto con
un microscopio de fluorescencia. La fluorescencia se produce solamente sobre la ubicación del anticuerpo. anticuerpos derecho, fluorescentes marcado se
preparan contra un anticuerpo que reacciona con un antígeno particular. Cuando se ve con microscopía de fluorescencia, la región de la fluorescencia
representa la ubicación del anticuerpo.

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Figura 1-4

Ejemplo de inmunocitoquímica directa. neuronas cultivadas de rata ganglio cervical superior se inmunotiñeron con anticuerpo marcado fluorescente
específico para el receptor de la insulina. Las áreas brillantes corresponden a sitios en los que el anticuerpo se ha unido a los receptores de insulina.
El patrón de tinción indica que los receptores se encuentran en todo el citoplasma de la soma y procesos, pero no se encuentran en el núcleo. (De
James S, Patel N, Thomas P, Burnstock G:. Localización inmunocitoquímica de receptores de insulina en ratas neuronas del ganglio cervical superior
en cultivo celular disociada J Anat 182: 95-100, 1993.)

En el método indirecto ( ver Fig. 1-3 ) Un anticuerpo marcado con fluorescencia se prepara contra el anticuerpo primario específico para la macromolécula de interés.
Una vez que el anticuerpo primario ha reaccionado con el antígeno, la preparación se lava para eliminar el anticuerpo primario no unido; A continuación se añade el
anticuerpo marcado y reacciona con el complejo original de antígeno-anticuerpo, formando un complejo visible secundaria por microscopía fluorescente ( Fig. 1-5 ). El
método indirecto es más sensible que el método directo porque numerosos anti-anticuerpos marcados se unen al anticuerpo primario, haciéndolos más fáciles de
visualizar. Además, el método indirecto no requiere etiqueta del anticuerpo primario, que a menudo está disponible sólo en cantidades limitadas.

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Figura 1-5

inmunocitoquímica indirecta. anticuerpos fluorescentes se prepararon contra anticuerpos primarios contra el colágeno de tipo IV, para demostrar la
presencia de una lámina basal continua en la interfaz entre las agrupaciones maligna de las células y el tejido conectivo circundante.

(De Kopf-Maier P, Schroter-Kermani C:. Distribución de colágeno tipo VII en los carcinomas humanos xenoinjertados Cell Tissue Res 272:
395-405, 1993.)

La inmunocitoquímica se puede utilizar con muestras para microscopía electrónica marcando el anticuerpo con ferritina, una molécula denso en electrones, en lugar de
con un colorante fluorescente. etiquetado ferritina se puede aplicar tanto en los métodos directos e indirectos.

autorradiografía

La autorradiografía es un método que utiliza la incorporación de isótopos radiactivos en macromoléculas, que luego se visualizaron mediante el uso de una capa
de emulsión de la película.

La autorradiografía (o radioautography) es un método particularmente útil para la localización y la investigación de una secuencia temporal específica de
eventos. El método requiere la incorporación de un isótopo radiactivo-más comúnmente tritio ( 3 H) -into el compuesto en estudio ( Fig. 1-6 ). Un ejemplo es el uso
de ácido amino tritiada para rastrear la síntesis y envasado de proteínas. Después se inyecta el compuesto radiomarcado en un animal, muestras de tejido se
toman a intervalos de tiempo seleccionados. El tejido se procesa como de costumbre y se coloca en un portaobjetos de vidrio; sin embargo, en lugar del tejido
que está siendo sellada con un cubreobjetos, una fina capa de emulsión fotográfica se coloca sobre ella. El tejido se coloca en una caja oscura durante unos
pocos días o semanas, durante el cual las partículas de tiempo emitidos desde el isótopo radiactivo exponen la emulsión a través de los sitios de la célula donde
se encuentra el isótopo. La emulsión se desarrolla y se fija por medio de técnicas fotográficas, y los pequeños granos de plata se dejan sobre las porciones
expuestas de la emulsión. El espécimen luego se sella con un cubreobjetos y vistos con un microscopio de luz.

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Figura 1-6

Autorradiografía. el examen microscópico de luz de la incorporación de prolina tritiada en la membrana basal como una función del tiempo posterior a la
inyección de prolina tritiada (barra de escala = 10 μ). En las micrografías de luz de A a C, los granos de plata (puntos negros) se localizan principalmente en
las células endodérmicas; después de 8 horas (luz micrografía D), sin embargo, los granos de plata también se localizan en la membrana basal. La presencia
de granos de plata indica la localización de prolina tritiada.

(De Mazariegos MR, CP Leblond, van der Rest M: trazado de Radioautographic 3 H-prolina en células endodérmicas del saco vitelino parietal como un
indicador de la biogénesis de los componentes de la membrana basal. Am J Anat 179: 79-93, 1987.)

La autorradiografía se ha utilizado para seguir el curso temporal de la incorporación de prolina tritiada en la membrana basal subyacente células endodérmicas del saco
vitelino (ver Fig. 1-6 ). Una adaptación del método de la autorradiografía de la microscopía electrónica se ha utilizado para mostrar que la prolina tritiada aparece por primera
vez en el citosol de las células endodérmicas, se desplaza entonces hacia el retículo endoplasmático rugoso, a continuación, al aparato de Golgi, a continuación, en las
vesículas, y finalmente en el la matriz extracelular ( Fig. 1-7 ). De esta manera, la secuencia de eventos que ocurren en la síntesis de la proteína colágeno de tipo IV principal
en la lámina densa de la basal lámina-se demostró visualmente.

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Figura 1-7

Autorradiografía. En esta micrografía electrónica de una célula endodérmico saco vitelino, granos de plata (similares a los de
Figura 1-6 ), Que representa la presencia de prolina tritiada, son evidentes recubre el retículo endoplasmático rugoso (RER), aparato de Golgi (G),
y gránulos secretores (SG). colágeno tipo IV, que es rica en prolina, se sintetiza en las células endodérmicas y se libera en la membrana basal. La
prolina tritiada es más concentrada en los orgánulos que participan en la síntesis de proteínas. M, las mitocondrias; N, núcleo.

(De Mazariegos MR, CP Leblond, van der Rest M: trazado de Radioautographic 3 H-prolina en células endodérmicas del saco vitelino parietal como un
indicador de la biogénesis de los componentes de la membrana basal. Am J Anat 179: 79-93, 1987.)

MICROSCOPIA CONFOCAL

La microscopía confocal se basa en un rayo láser para la fuente de luz y una pantalla de agujero de alfiler para eliminar la luz reflejada no deseable de ser observada. Por
lo tanto, la única luz que se puede observar es la que se encuentra en el punto focal de la lente del objetivo, por lo que el conjugado del agujero de alfiler del punto focal.

En la microscopía confocal, un rayo láser pasa a través de un espejo dicroico que estar centrado en el espécimen por dos espejos motorizados, cuyos movimientos son
controlados por computadora para explorar el haz a lo largo de la muestra. Debido a que la muestra se trata por colorantes fluorescentes, el rayo láser incidente provoca la
emisión de luz de los tintes. La luz emitida sigue el mismo camino tomado por el haz de láser, pero en la dirección opuesta, y el espejo dicroico se enfoca esta luz emitida
en un agujero de alfiler en un plato. Un tubo fotomultiplicador recoge el paso luz emitida a través del agujero, mientras que la placa que contiene los bloques de agujero de
alfiler toda la luz extraña que crearía una imagen borrosa. Hay que recordar que la luz que emerge del agujero de alfiler en un momento determinado en el tiempo
representa un solo punto de la muestra, y como los escáneres de rayos láser a través de los puntos individuales adicional muestra son recogidos por el tubo
fotomultiplicador. Todos estos puntos recogidos por el tubo fotomultiplicador se compilan por un ordenador, formando una imagen compuesta de un pixel a la vez ( Fig. 1-8 ).
Dado que la profundidad de campo es muy pequeña (sólo se observa una capa delgada de la muestra en cualquier exploración), el escaneo se puede repetir en niveles
más profundos y más profundos en la muestra, lo que permite la compilación de una imagen tridimensional muy bueno ( Fig. 1-9 ).

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Figura 1-8

Microscopia confocal. Un rayo láser pasa a través de un espejo dicroico que se centra en la muestra por dos espejos motorizados, cuyos movimientos son
controlados por computadora para explorar el haz a lo largo de la muestra. La luz que emerge desde el agujero de alfiler en cualquier momento particular en el
tiempo representa un solo punto en la muestra, y como los escáneres de rayos láser a través de los puntos individuales adicional muestra son recogidos por el
tubo fotomultiplicador. Todos los puntos son para producir la imagen confocal última montado por ordenador.

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Figura 1-9

imagen confocal de un metafase de células de rata canguro (PtK2) teñidas con FITC-faloidina para la F-actina (verde) y yoduro de propidio para los
cromosomas (rojo).

(Cortesía del Dr. Mateo Schibler, Universidad de California Instituto de Investigación del Cerebro, Los Ángeles, California).

MICROSCOPIO DE ELECTRONES

El uso de electrones como fuente de luz en el microscopio electrónico permite el logro de mayor magnificación y resolución que se dio cuenta de que con el
microscopio óptico.

En los microscopios de luz, lentes ópticas enfocan la luz visible (un haz de fotones). En los microscopios electrónicos, electroimanes cumplen la función de enfocar un haz de
electrones. Debido a que la longitud de onda de un haz de electrones es mucho más corta que la de la luz visible, microscopios electrónicos teóricamente son capaces de
resolver dos objetos separados por 0.005 nm. En la práctica, sin embargo, la resolución de la microscopio electrónico de transmisión es de aproximadamente 0,2 nm, que es
todavía más de mil veces mayor que la resolución del microscopio óptico compuesto. La resolución de la microscópio electrónico escaneando es de aproximadamente 10
nm, considerablemente menor que la del microscopio electrónico de transmisión. Por otra parte, los microscopios electrónicos modernos pueden magnificar un objeto tanto
como 150.000 veces; este aumento es lo suficientemente potente para ver macromoléculas individuales, tales como el ADN y la miosina.

Microscopio de transmisión por electrones

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza secciones mucho más delgadas en comparación con la microscopía de luz y requiere técnicas de precipitación de metales
pesados ​en lugar de manchas solubles en agua para teñir tejidos.

Preparación de muestras de tejido para TEM implica los mismos pasos básicos como en microscopía de luz. fijadores especiales se han desarrollado para su uso con el
microscopio óptico de transmisión, debido a que el mayor poder de resolución del microscopio electrónico requiere más fino y más específica entrecruzamiento de proteínas.
Estos fijadores, que incluyen soluciones tamponadas de
glutaraldehído, paraformaldehído, tetróxido de osmio, y permanganato de potasio, no sólo conservar detalles estructurales finas sino también actuar como manchas densos en

electrones, que permiten la observación del tejido con el haz de electrones. Debido a que estos agentes de fijación penetran en los tejidos frescos incluso menos de fijadores para

microscopía de luz, relativamente pequeños trozos de tejidos se infiltraron en grandes volúmenes de fijadores. bloques de tejido para TEM son por lo general no mayor de 1 mm 3. medios

de incrustación adecuados se han desarrollado, tal como una resina epoxi, de modo que los tejidos de plástico embebido pueden cortarse en secciones extremadamente finas

(ultra-finas) (de 25 a 100 nm) que no absorben el haz de electrones. Los haces de electrones se producen en una cámara evacuada por calentamiento de un filamento de tungsteno,

la cátodo. Los electrones luego son atraídos por el cargado positivamente ánodo, una placa de metal con forma de rosquilla con un agujero central. Con un diferencial de carga de

alrededor de 60,000 voltios colocados entre el cátodo y el ánodo, los electrones que pasan a través del agujero en el ánodo tienen una alta energía cinética.

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El haz de electrones se centra en la muestra por el uso de electroimanes, que son análogas a la lente condensadora de un microscopio de luz (véase Fig. 1-1 ).
Debido a que el tejido se tiñó con metales pesados ​que precipitan preferentemente sobre las membranas lipídicas, los electrones pierden parte de su energía cinética
a medida que interactúan con el tejido. Cuanto más pesado es el metal encontrado por un electrón, menos energía del electrón retendrá.

Los electrones salen de la muestra se someten a los campos electromagnéticos de varios electroimanes adicionales, que enfocar el haz en una placa fluorescente. Como
los electrones golpean la placa fluorescente, su energía cinética se convierte en puntos de luz, cuya intensidad es una función directa de la energía cinética del electrón. Se
puede hacer un registro permanente de la imagen resultante mediante la sustitución de una película de electrones sensible en lugar de la placa fluorescente y mediante la
producción de un negativo de la que una fotomicrografía blanco y negro se puede imprimir.

Criofractura Técnica

La estructura macromolecular de los aspectos internos de las membranas es revelada por la técnica de congelación-fractura ( Fig. 1-10 ). especímenes Quick-congelados que han
sido tratados con crioconservantes no desarrollar cristales de hielo durante el proceso de congelación; por lo tanto, el tejido no sufre daños mecánicos. A medida que la muestra
congelada es golpeado por una cuchilla de super-enfriado maquinilla de afeitar, se fractura a lo largo de planos de exfoliación, que son regiones de unión menos molecular; en las
células, la fractura se produce con frecuencia entre las valvas interior y exterior de las membranas.

Figura 1-10

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Citoquímica y de congelación-fractura. réplica de Fractura de etiqueta de una célula acinar del páncreas de rata. residuos de D-galactosamina N-acetil
fueron localizados por el uso de Helix pomatia complejo lectina-oro, que aparece como puntos negros en la imagen. Las puntas de flecha indican las
membranas celulares. El núcleo (Nu) aparece como una depresión, el retículo endoplasmático rugoso (RER) como líneas paralelas, y gránulos secretores
como pequeñas elevaciones o depresiones. Las elevaciones (G) representan la E-cara media, y las depresiones (asteriscos) representan la P-cara de la
membrana del gránulo secretor. m, mitocondrias.

(De Kan FWK, Bendayan M: distribución topográfica y plana de Helix pomatia glicoconjugados de unión a lectina en gránulos de
secreción y de membrana plasmática de las células acinares pancreáticas de la rata:. Demostración de la heterogeneidad membrana
Am J Anat 185: 165-176, 1989.)

La cara de fractura se recubre en un ángulo por el platino se evaporó y el carbono, formando acumulaciones de platino en un lado de una proyección y no hay
acumulación en el lado opuesto al lado de la proyección, generando una réplica de la superficie. El tejido entonces se digiere de distancia, y la réplica se examinó por
TEM. Este método permite la visualización de las proteínas transmembrana de las membranas celulares.

Microscopía Electrónica de Barrido

Microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona una imagen tridimensional de la muestra.

A diferencia de TEM, SEM se utiliza para ver la superficie de una muestra sólida. Usando esta técnica, se puede ver una imagen tridimensional del objeto. Por lo
general, el objeto a ver se prepara de una manera especial que permite una fina capa de metal pesado, tal como oro o paladio, para ser depositado en la superficie
del espécimen.

Como un haz de electrones explora la superficie del objeto, algunos (electrones de retrodispersión) se reflejan y otros (electrones secundarios) son expulsadas de la capa de
metal pesado. Los electrones de retrodispersión y secundaria son capturados por los detectores de electrones que son interpretados, clasificadas, y se muestran en un monitor
una imagen tridimensional (ver Fig. 1-1 ). Puede hacer que la imagen permanente, ya sea mediante la fotografía o la digitalización para su almacenamiento en un ordenador.

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