Purificação de Proteínas

Propriedades usadas na purificação de proteínas

através de cromatografia líquida

Na separação a amostra contendo a mistura de proteínas é

preparada em solução aquosa, a solução é colocada em contato
com um suporte sólido poroso (fase estacionária) e eluída através
deste suporte com uma solução aquosa (fase móvel).
A separação ocorre devido a diferenças entre as propriedades das
diferentes proteínas.

Propriedades exploradas: Tamanho (massa molecular)

Carga líquida
Polaridade (hidrofobicidade)
Afinidade química (especificidade)
 Sistema para FPLC

amostra

Coluna cromatográfica

Detector UV 280nm
Coletor de frações
 Recuperação da atividade enzimática

Etapa de purificação
100 U 80 U
10ml de material
2ml de lisado contendo
contendo 8 U/mL
50 U/mL

Recuperação = 80% = 80 U/100 U

Recuperação: indica qual a porcentagem de

atividade enzimática recuperada após o
procedimento de purificação
 1

Recuperação em relação ao início

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
etapas

Recuperação de 90% em cada etapa

100 U de alfa-glicosidase
100U/mg
1 mg de proteína

100 U de alfa-glicosidase
2 mg de proteína
50U/mg

100 U de alfa-glicosidase
10 mg de proteína
10U/mg
 Enriquecimento

Etapa de purificação
100 U/mg 200 U/mg

Enriquecimento = 2 = 200/100

Enriquecimento: indica o aumento da

atividade específica após o procedimento de
purificação.
 Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular

Tamanho:
20 kD

100 kD
Fluxo de solução
tamponante
através da coluna

abs280

volume
5 µm
fluxo
fluxo

volume
Seletividade
As dimensões dos poros da matriz determinam a faixa de peso
molecular das proteínas que podem ser separadas na cromatografia.
 Tipos de resina

Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida)

50 µm

Sepharose (dextrana + epiclorohidrina)

10 – 120 µm
 Cálculo de peso molecular relativo
utilizando cromatografia de filtração em gel

Definições

ve = volume de eluição da amostra (proteína de interesse)

vo = volume morto ou “void”. Volume no qual são eluídas proteínas

totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume
externo aos grãos da resina

vt = volume total da coluna. Pode ser calculado geometricamente a

partir das dimensões da coluna.
ve = volume de eluição da
amostra
(proteína de interesse)
vo = volume morto ou “void”.

Volume no qual são eluídas

proteínas totalmente excluídas dos
poros das resinas. Corresponde ao
volume externo aos grãos da resina

Pode ser medido usando

macromoléculas muito grandes, em
geral “blue dextrana” (milhões de
Daltons)
vt = volume total da coluna.
Pode ser calculado a partir das
dimensões da coluna.
Definições

“razão de eluição”
Kav = (ve – vo)/(vt-vo)

Log PM

Kav
 Cromatografia de Troca Iônica

Carga líquida:
Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis;
Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis.

pI (ponto isoelétrico) = pH no qual o número total de cargas

positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a
proteína não tem carga líquida.

Se o pH > pI, a carga líquida da proteína é negativa

Se o pH < pI, a carga líquida da proteína é positiva

+

Fluxo de solução
tamponante com pH
definido
+
Fluxo de solução
tamponante com pH
definido

volume
 Na+
Cl-
Na+ Cl-
Fluxo com solução
Cl- Cl- tamponante contendo NaCl
Na+
Cl-
+
Na+ Cl-
Na+ Cl-

Na+ Cl- NaCl

Cl-
Na+

volume
 pI = 7
+
pH = 6

pI = 9

+++

F α q1.q2
 NaCl

+++
volume

+ +++
Tipos de resina
 Cromatografia de Hidrofobicidade

Polaridade:

Adição de sal
Série de Hofmeister

Cátions:
NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg+2 > Ca+2 > guanidina

Efeito precipitante

Ânions:
SO4-2> HPO4-2>acetato>citrato>tartarato> Cl-> NO3-> SCN-
 Adição de sal

Precipitação por sulfato de amônio é usada para concentrar e/ou purificar

parcialmente amostras contendo proteínas
 Cromatografia de Hidrofobicidade

Polaridade:

(NH4)2SO4
 (NH4)2SO4

Fase estacionária
apolar

Abs
280

volume
 (NH4)2SO4

Abs
280

volume
Abs
280

volume
Tipos de resina
 Cromatografia líquida de fase reversa

Polaridade:

(Material poroso apolar é a fase estacionária)

Proteína ricas
em aminoácidos
mais apolares:
mais retidas

Eluição: Proteínas ricas em

1o. 2o. aminoácidos mais
aumento da % de
solvente orgânico polares: menos
na solução eluente retidas