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18/10/2016 A análise genética e medição Camp: comparação entre ratos magros e obesos anovulatórias

    

Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia Serviços on Demand
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Diário
Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.37 no.4 Rio de Janeiro abr 2015
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http://dx.doi.org/10.1590/SO100­720320150005252 
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entre ratos magros e obesos anovulatórias texto de página nova (beta)

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Análise genética e Dosagem de AMP cíclico: referências de artigos
Comparação entre camundongos Fêmeas anovuladoras  Como citar este artigo
Magras e obesas
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Daniela Berguio Vidotti  1  , Beatriz Schnabel  2  , Mariane Secco  3  ,
Priscila Cardoso Cristovam  4  , Ricardo Carneiro Borra  5  , Ismael Links Relacionados
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Oftalmologia da Universidade Federal de São Paulo ­ UNIFESP ­ São Paulo (SP), Brasil
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 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos ­ UFSCar ­ São Carlos (SP), Brasil

ABSTRATO

OBJETIVO:

Para avaliar os genes diferencialmente expressos nos ovários de magra (tipo selvagem) e obeso (ob / ob) ratinhos
fêmeas e produção de AMP cíclico em ambos os grupos.

MÉTODOS:

A expressão em níveis de RNA mensageiro de 84 genes relativos a obesidade foi analisada através da matriz PCR, e
AMP cíclico foi quantificada pelo método de ensaio imunoenzimático.

RESULTADOS:

Os genes regulados negativamente em mais do grupo obesidade incluídos adenilato­ciclase polipéptido de
activação do tipo 1, a somatostatina, A4 apolipoproteína, colipase pancreático, e interleucina­1 beta. O decréscimo
significativo nos níveis de expressão destes genes foi de cerca de 96, 40, 9, 4,2 e 3,6 vezes, respectivamente. Por
outro lado, os genes mais aumentado no grupo obesidade foram receptor (calcitonina) modificadores da actividade
da proteína 3, activado pelo proliferador de peroxisoma alfa do receptor, o receptor da calcitonina, e do receptor da
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hormona libertadora de corticotropina 1. O aumento significa nos níveis de expressão, tais genes foram de 2,3, 2,7,
4,8 e 6,3 vezes, respectivamente. A produção de AMP cíclico de ovário foi significativamente maior em ratos ob / ob
do sexo feminino (2.229 ± 52 fmol) em comparação com o grupo controle (1.814 ± 45 fmol).

CONCLUSÕES:

camundongos fêmeas obesos e anovulatórios ter reduzido os níveis de hormônios reprodutivos e ovogenesis
alterada. Vários genes têm os seus níveis de expressão alterada quando leptina está ausente, especialmente a
adenilato­ciclase de activação tipo polipéptido 1.

Palavras­chave: leptina; Ovário; Expressão genetica; Adenilato­ciclase pituitária­polipéptido activador;
Infertilidade

RESUMO

OBJETIVO:

genes OS Avaliar diferencialmente expressos em ovários de camundongos Fêmeas Magras (tipo selvagem) e obesas
(ob / ob) ea Produção de AMP cíclico em Ambos OS grupos.

MÉTODOS:

A Expressão Nos níveis de RNA Mensageiro de 84 genes Relacionados à obesidade foi analisada POR PCR matriz ,
EO AMP cíclico foi quantificado POR Método imunoenzimático.

RESULTADOS:

genes OS that Mais sofreram diminuição da Expressão no Grupo Obesidade incluíram o tipo 1 de polipeptídeo
Ativador da adenilato ciclase, o da somatostatina, da apolipoproteína A4, da colipase pancreática e da beta
interleucina 1. A Media de Redução na Expressão Desses genes foi de apróximadamente 96, 40, 9, 4,2 e 3,6 vezes,
respectively. Por Lado Outro, genes OS that Mais tiveram aumento na Expressão nenhum gene were o Grupo
Obesidade da proteína modificadora da Atividade do receptor de calcitonina 3, faça proliferador de peroxissomos
ativados POR proteína alfa, faça receptor de calcitonina e do Pará receptor Hormônio liberador de corticotropinas 1.
Como Médias de acréscimo Nos níveis de Expressão de genes Tais were de 2,3, 2,7, 4,8 e 6,3 vezes, respectively. A
Produção de AMP cíclico ovariana foi significantemente Aumentada em camundongos Fêmeas ob / ob (2.229 ± 52
fmol) when Comparada Ao Grupo Controle (1.814 ± 45 fmol).

CONCLUSÕES:

Camundongos Fêmeas obesas e anovuladoras possuem níveis de Hormônio reprodutivo reduzidos e ovulogênese
alterada. genes Varios mostram níveis de Expressão ALTERADOS when a leptina ESTÁ ausente, principalmente o
tipo 1 de polipeptídeo Ativador da adenilato ciclase.

Palavras­Chave: Leptina; ovário; Expressão gênica; Polipeptídio hipofisário Ativador de adenilato ciclase;
Infertilidade

INTRODUÇÃO
O tecido adiposo foi recentemente reconhecido como um importante órgão endócrino. Através da secreção de
factores solúveis (colectivamente chamados adipocitoquinas), este tecido pode regular vários processos
fisiológicos, tais como a glucose e o metabolismo lipídico, resposta imune, e reprodução 1 . Entre essas
adipocinas, a leptina parece influenciar fortemente no início da puberdade e ovulatório capacidade de 2 .

A leptina é um péptido de 146 aminoácidos codificados pelo gene ob. A sua expressão ocorre principalmente no
tecido adiposo branco e, em menor grau, no um castanho. Outras estruturas que expressam este gene incluem
hipotálamo, glândula pituitária, o epitélio gástrico, placenta, glândulas mamarias, gônadas e 3 ­ 7 . A leptina
controla a ingestão de alimentos e as taxas metabólicas de acordo com o estado nutricional. Durante uma
refeição, a concentração de leptina no soro aumenta e que exerce uma acção inibidora no hipotálamo,
reduzindo o apetite. A concentração desse hormônio aumenta ainda durante um par de horas após a refeição, e
estimula a termogênese para promover o gasto de energia e reduzir os estoques de gordura. Por outro lado, os
indivíduos privados de alimentos têm uma diminuição da concentração sérica de leptina, que estimula o apetite
e restringe o gasto de energia. A produção de leptina é directamente proporcional à massa de gordura no corpo.
Os indivíduos obesos produzem grandes quantidades de leptina, mas tornam­se também hormônio­resistente.
Tendência de tornar­se resistentes à leptina através de superalimentação crônica é observada tanto em
humanos e animais 8 .

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Fêmeas ratinhos knockout­leptina (ob / ob) são estéreis, indicando um papel para esta hormona no controlo do
estado reprodutivo. Eles apresentam baixas concentrações de gonadotrofinas e desenvolvimento incompleto dos
órgãos reprodutivos. Este fenótipo é invertida pela administração de leptina exógena 9 . Nas mulheres, a
concentração sérica de leptina é inversamente correlacionada com amenorréia idade 10 . Este hormônio
também está implicada na manutenção de outras funções reprodutivas femininas normais, incluindo a lactação,
folliculogenesis, esteroidogênese ovariana, maturação endometrial e receptividade a EMBRIO 11 . A leptina pode
influenciar no estado reprodutivo, agindo sobre o hipotálamo e estimulando a secreção de GnRH 2 , 12 . No
entanto, esta estimulação não parece ser exercida directamente sobre os neurónios produtores de GnRH. Há
uma interacção complexa entre os diferentes tipos de neurónios, que produz vários tipos de neuropeptídeos.
Kisspeptina pode ser o candidato mais forte para mediar os efeitos da leptina no hipotálamo 2 , 12 .

Embora os receptores de leptina são expressos em ovários 13 , pouco se sabe sobre como a leptina regula a
expressão genética nestes órgãos. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão do gene em ovários de magra
(tipo selvagem) e obeso (ob / ob) ratos, a fim de determinar os genes expressos diferencialmente. Nós
concentramos nossa discussão sobre cerca de 10 genes, e especulou por que eles são para cima ou reprimidos,
e como essas diferenças nos níveis de expressão pode ser responsável pelo fenótipo anovulatórios em
camundongos fêmeas obesas.

MÉTODOS

Feminino C57BL / 6 (Control) e B6.V­Lep ob / J (ob / ob) ratos adquiridos a partir do Centro de Desenvolvimento
de Medicina e Biologia Modelos Experimentais (CEDEME, sigla em Português), na Universidade Federal de São
Paulo (UNIFESP) , foram analisadas neste estudo. O Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP aprovou todos os
procedimentos utilizados.

Os ovários a partir do controlo (n = 5) e ob / ob (n = 6) Os grupos foram assepticamente extraídos. Os órgãos
foram mantidas a ­80 ° C até serem aplicadas para a extracção de ARN total, utilizando o reagente Trizol (Life
Technologies) e instruções do fabricante seguinte.

A transcrição reversa foi realizada numa mistura contendo 5 uM hexâmero aleatório, 200 uM de dNTP, 2 U / mL
de MMLV transcriptase (Promega, Madison, WI), e um ARN ug com o tampão correspondente a 42oC durante 90
minutos, depois a 85 ° C durante 10 minutos.

PCR em tempo real foi realizada utilizando o ABI PRISM 7000 Sequence Detection System 10 (Applied
Biosystems) equipado com uma placa de reacção de 96 poços óptico. As reacções foram constituídas com 16,5
uL Sybr (R) Verde PCR Master Mix (Applied Biosystems). Todas as experiências em tempo real foram correu em
triplicado e um valor médio foi utilizado para a determinação dos níveis de ARNm. Considerando o fenótipo
anovulatórios de ob camundongos fêmeas / ob, buscou­se estabelecer como a ausência de leptina modula o
perfil de expressão gênica em ovários. Genes diferencialmente expressos entre os controles (tipo selvagem) e
camundongos obesos (ob / ob) foram determinados por meio de matriz PCR, usando RNAs extraídos de ovários.
De acordo com o método da taxa de falsas descobertas (FDR) 14 , nove genes foram consideradas para análise.
A identificação dos genes diferencialmente expressos entre controle e ob / ob grupos foi realizada utilizando a
metodologia de análise estatística ΔΔCt e, com base em de Student desemparelhado t­ teste. A abordagem FDR
14 com 0,05 de corte foi utilizado para selecionar uma lista de genes diferencialmente expressos  15 .

Alguns dos ovários removidos por extracção de ARN foi armazenado em azoto líquido até quantificação cíclica
de AMP, utilizando o kit EIA de cAMP directa (Amersham Biosciences, NJ, EUA), seguindo as instruções do
fabricante.

Foi analisada a diferença entre os dois grupos aplicação de Student t ­test. Se normalidade dos dados foi
confirmada, através do teste de Shapiro­Wilk usando o software SPSS (SPSS Statistics, v. 16.0, SPSS Inc.,
EUA), foi analisada pelo teste de Mann­Whitney. A significância estatística considerado p <0,05.

RESULTADOS

Polimerase matriz reação em cadeia de genes da obesidade

Genes regulados negativamente em camundongos obesos incluídos: adenilato polipéptido tipo 1 (Adcyap1 ou
PACAP), a somatostatina (SST), apolipoproteína A4 (Apo A4), colipase pancreático (CLPS), e interleucina­1 beta
de activação de ciclase (IL­1β). O decréscimo significativo nos níveis de expressão destes genes foi de cerca de
96, 40, 9, 4,2 e 3,6 vezes, respectivamente. Por outro lado, os genes regulados positivamente no grupo
obesidade foram receptor (calcitonina) actividade modificando proteína 3 (RAMP3), proliferador de peroxisoma
alfa do receptor activado (PPARa), a calcitonina do receptor (CALCR), e do receptor da hormona libertadora de
corticotropina 1 (CRHR1), como pode ser visto na Figura 1 . O aumento médio nos níveis de expressão destes
genes foram de 2,3, 2,7, 4,8 e 6,3 vezes, respectivamente. A alteração nos níveis de expressão de todos estes
genes estão resumidos na Tabela 1 .

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Figura 1 ­  enredo esquemático, mostrando genes diferencialmente expressos entre controle e ratos fêmeas obesos 

Tabela 1 ­  Lista de genes considerados diferencialmente expressos (FDR de 5% e de 2 vezes ou duas vezes o nível de
expressão como grupo de controlo) 

H  Regulação vezes 
banco de genes símbolo do gene Grupo Controle (ΔCT) ob / ob Group (ΔCT) UMA p­valor
(ΔΔCT) (2 ­ΔΔCT )
Ciclase polipeptídeo ciclase ativando 1
NM_008361 ADCYAP1 4.6 11.2 7.9 ­6.6 95.7x 0,0003
somatostatina
NM_201615 SST 6.5 11,8 9.1 ­5.3 39.6x 0,001
A apolipoproteína A­IV
subregulado
NM_009625 APOA4 ­0.9 2.3 0,7 ­3.2 9.0x 0.0000
Colipase. pancreático
NM_007407 CLPS 7.7 9.8 8,7 ­2.1 4,2x 0,004
A interleucina­1 beta
NM_024435 IL1­B 6,7 8.6 7.6 ­1.8 3.6x 0,0005
Receptor de atividade (calcitonina) modificando a proteína 3
NM_009605 RAMP3 6.6 5.4 6 1.2 2,3x 0,0009
receptor alfa activado pelo proliferador de peroxissoma
NM_007468 PPARa 5.2 3.7 4,5 1.4 2,7x 0,0001
regulada
receptores da calcitonina
NM_013732 CALCR 12,7 10.4 11,6 2.3 4,8x 0,0006
Corticotropin­releasing um receptor da hormona
NM_008177 CRHR1 11.2 8,5 9.9 2.7 6.3x 0,0003

A: (ob / ob + Control) / 2 e M: (Control­ob / ob); p

a acumulação de AMP cíclico

A fim de determinar o estado de activação celular em ovários de controlo e ratos obesos, a acumulação de
AMPc intracelular foi medida aplicando ELISA. A acumulação de cAMP foi estatisticamente superior (p <0,01)
nos ovários de ratinhos obesos (2229 ± 52 fmol), em comparação com os controlos (1814 ± 45 fmol, Figura 2
).

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Figura 2 ­  Determinação dos níveis de cAMP em ovários de controle e feminino ratos obesos. Imunoensaio de enzima foi
utilizada para determinar a produção de cAMP expressa como percentagem do valor basal. Os dados são expressos como média
± SEM de valores em triplicado e são representações de três experiências. Os valores de campo foram: Controle (n = 3): 1814 ±
45 (fmol) e obesos (n = 3): 2.229 ± 52 (fmol). O P 

DISCUSSÃO

Demonstramos neste relatório que vários genes têm os seus níveis de expressão de leptina alterada quando
está ausente. Utilizou­se ratinhos ob / ob, que são geneticamente privados de leptina. Estes ratos são obesos e
anovulatórios; eles têm níveis reduzidos de hormonas reprodutivas, revelando um defeito funcional do eixo
hipotálamo­hipófise 16 , 17 . Embora seja claro que a leptina estimula ovogenesis por interferir com os níveis de
LH / estrogênio, pouco se sabe sobre os efeitos que esse hormônio exerce sobre a expressão do gene em
ovários.

Na ausência de leptina, Adcyap1 / PACAP, ApoA4, SstI, CLPS e IL­1β são regulados negativamente em
comparação com ratinhos de controlo ( Figura 1 ). A alteração mais importante era nos níveis de Adcyap1 /
PACAP, que foi regulada negativamente (96 vezes) de expressão em comparação com os controlos. PACAP é um
neuropeptídeo produzido por mamíferos que possuem acções sobre o sistema nervoso central e nos tecidos
periféricos, incluindo o intestino, o pulmão, glândulas supra­renais, testículos, ovários e 18 ­ 20 . Além disso, a
sua acção sobre o eixo hipotálamo­hipófise­gônadas regula a função reprodutiva. Mais especificamente, a
presença de PACAP e seus receptores no ovário estimula as funções ovarianas, incluindo steroidoigenesis e a
acumulação de AMPc em células da granulosa de rato 21 , 22 . Este péptido também acelera a maturação
meiótica em oócitos de rato 23 .

Além disso, o PACAP contribui para a sobrevivência de células da granulosa, através da inibição de apoptose em
foliculos pré­ovulatórios 24 . Assim, a presença de PACAP e seus receptores em ovários foram marcados efeitos

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sobre a fisiologia do ovário, e a expressão reduzida deste gene pode ser responsável pelo fenótipo
anovulatórias. É intrigante que os níveis de cAMP foram significativamente aumentados em ratos ob / ob
ovários ( Figura 2 ) em comparação com os controlos do mesmo tempo que o PACAP, um activador de adenilato
ciclase, foi reduzida. Este facto, no entanto, pode ser explicado porque outra célula vias de sinalização que têm
AMPc como segundo mensageiro pode ser activado em ob / ob ovários. CALCR e CRHR1, tanto regulada em ob /
ob ovários, podem ser responsáveis por este fenómeno. Foi já descrito que ambos os receptores podem
transduzir o sinal através de AMP cíclico, embora não tenha sido claro se a ambos os receptores são acoplados
fazer G s no tecido do ovário 25 , 26 .

A expressão Sst foi subregulado (40 vezes) nos ovários de ratos obesos, o que reforça o seu papel no
metabolismo e fisiologia reprodutiva. Nos vertebrados, a SST é um péptido multifuncional distribuídos através
do sistema nervoso central e nos tecidos periféricos, wich tem uma ampla papel fisiológico de neuromodulação,
regulação osmótica, e também afecta aspectos do crescimento, desenvolvimento e metabolismo 27 , 28 .
Secreção sst é regulada por mediadores intra / extra­pancreáticas e nutrientes 29 . Além disso, inibe a secreção
de glucagon e insulina 29 , 30 . Tem sido relatado que Sst administrado a ratinhos peripuberal bloqueou o
processo de gonadotropina­independente inicial de crescimento folicular in vivo, sugerindo que Sst pode actuar
directamente sobre as células foliculares de componentes no ovário 31 . Assim, o aumento Sst poderia explicar
o fenótipo anovulatórios. Novas investigações são necessárias para explicar esta aparente contradição.

Observou­se que o nível de expressão de mRNA em ApoA4 ob / ob ovários foi reduzida (9 vezes) em
comparação com os controlos. Esta conclusão é reforçada no estudo de Liu et al. 32 , que observaram que os
níveis de mRNA do hipotálamo de ApoA 4 foram significativamente reduzidos em ratos obesos (ob / ob). O gene
anorexígenos, ApoA4, está envolvido no controle da ingestão alimentar e do peso corporal 33 , 34 . Além disso,
animais obesos têm aumentado limiar de saciedade, contribuindo para a etiologia da obesidade. Nenhum efeito
sobre o estado reprodutivo exercida por Apo A4 já tinha sido descrita.

IL­1β também é regulada negativamente em ratos obesos. Os componentes do sistema de IL­1 tem vários
locais de síntese no ovário. Estes factores foram localizados em vários tipos de células do ovário, tais como as
células de oócitos, granulosa e da teca e em várias espécies de mamíferos. A IL­1 está envolvida no processo
de ovulação, em maturação do oócito e em vários outros eventos adversos associados à ovulação, como a
síntese de proteases, a regulação da actividade de activador de plasminogénio, prostaglandina e produção de
óxido nítrico. Também regula esteroidogênese ovariana 35 .

Encontramos também alguns genes que foram marcados upregulated em ob / ob ovários: RAMP3, PPARa, CALCR
e CRHR1.

Adrenomedulina (ADM), calcitonina péptidos relacionados com o gene (a­ e β­CGRPs) e intermedin /
adrenomedullin 2 (IMD / ADM2) são reguladores chave para vascular e evoluções cardiovasculares. Chang e
Hsu 36 avaliou o papel desses peptídeos e seus receptores cognatos (CLR / RAMP) na reprodução e circulação do
sangue materno­fetal, o desenvolvimento dos gametas, e movimento dos gametas no oviduto. Wang et al. 37 ,
utilizando ensaios intra­uterino em ratinhos, mostrou que a calcitonina promove a pré­implantação e
desenvolvimento de embriões em uma maneira dependente da dose de intracelular de Ca 2+ nível 38 . Os
autores correlacionaram essas descobertas a uma expressão gênica aumento significativo de fosfo­P38MAPK.
Eles estão de acordo com o conceito de que os receptores CLR / RAMP foram recrutados para criar uma miríade
de funções durante a reprodução em mamíferos. Em relação a este gene, descobrimos que Calr foi regulada em
ratinhos ob / ob, mostrando o novo e importante papel na regulação do metabolismo de lipídios e glicose e
inflamação. Neste artigo, viu­se que a correlação mais estreita entre a falta de leptina, obesidade e excesso de
peso é significativamente envolvido na diminuição da fertilidade e do aumento da Calr proporciona um aumento
de segundos mensageiros, ou seja AMP cíclico.

Outro gene, que foi fortemente influenciado no nosso modelo e verificou­se ser regulada positivamente foi de
PPAR, (proliferador de peroxissoma receptor activado), que suprime a expressão de leptina nos adipócitos.
PPAR tem muitos papéis potenciais em estados patológicos, incluindo a aterosclerose, a inflamação, cancro, e
desmielinização. Aqui, apresentamos o estado atual das descobertas moleculares de ação PPAR e seu
envolvimento relação entre obesidade e infertilidade. O aumento da expressão deste receptor podem ser
associados com a redução da leptina como um mecanismo de compensação. A infertilidade fenótipo está
associada, em parte, devido ao efeito de PPAR na diminuição implantação do blastocisto e decidualization.
Observações recentes utilizando isoformas de ligantes PPARô revelar que ele também pode ser uma estratégia
importante para distúrbios alvo terapêutico, incluindo o cancro, dislipidemia e agora, a infertilidade. Sabe­se
que a CRH, um neuropéptido de 41 aminoácidos, sintetizados no hipotálamo que regula o eixo hipotálamo­
hipófise­adrenal, está fortemente relacionado com o stress e a inflamação. Os efeitos da CRH são mediadas
através de receptores CRHR1 CRHR2 e que estão implicados em várias funções reprodutoras que actuam como
componentes inflamatórios. No presente estudo, foram avaliados os níveis de expressão relativa de vários
genes e moléculas em ovários saudáveis e obesos / inférteis, revelando a primeira evidência para um papel
potencial dos receptores do CRH no perfil infertilidade e sua posterior associação com a obesidade.
Demonstrámos que o receptor CRH é significativamente mais expresso nos ratinhos obesos ovários e inférteis
em comparação com ratinhos do tipo selvagem saudáveis. Tal stress e inflamação pode ainda ser
correlacionada com a obesidade, uma vez que o aumento das taxas de infertilidade, afectada principalmente
pela modulação da decidualização e diminuir processo blastocisto em ratinhos ob / ob pode, contribuem para a
expressão dos seus receptores para manter uma função adequada de ovários 39 .

Em resumo, este modelo de ratos obesos e anovulatórios reduziu os níveis de hormônios reprodutivos e
ovogenesis alterada. Além disso, demonstramos neste trabalho que vários genes têm os seus níveis de

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expressão alterada quando leptina está ausente, especialmente Adcyap1 / PACAP. No entanto, mais estudos são
necessários para caracterizar ainda mais os efeitos que esse hormônio exerce sobre os ovários.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
processo número 07 / 55629­0.

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Recebido: 18 de dezembro de 2015; Aceito: 30 de janeiro de 2015

Correspondência Daniela Berguio Vidotti Disciplina de Ginecologia, Departamento de Tocoginecologia da
Universidade Federal de São Paulo Rua Pedro de Toledo, 781 ­ 4º andar CEP: 04039­032 São Paulo (SP), Brasil

Conflito de interesses: nenhum.

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