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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MORELIA

“José María Morelos y Pavón”


DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA
QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

Práctica 6. Cuenta de levaduras en placa.

MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

Alumnos:
López Gutiérrez José Abraham
Romero Serna Jessica
Torres Guzmán Jesús Artemio
Villa Arreola Ignacio

02 de Mayo de 2018 Morelia, Mich.


Introducción.
El término levadura Hace refiere a los hongos que no son filamentosos, más bien estos son
unicelulares y de forma ovoide, los cuales se reproducen por gemación o por fisión. Las
levaduras que son encontradas en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las
levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre
y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Aunque
estas pueden ser perjudiciales cuando producen la alteración del sauerkraut, de los zumos
de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y
de otros alimentos. (Secretaria de salud, 1994) (Camacho, 2009)

La mayoría de las levaduras crecen mejor con un


alto contenido de humedad, donde la mayoría de
las levaduras la actividad de agua (αw) mínima de
crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. También las
levaduras son un tipo de microorganismos (MO)
osmotolerantes, esto quiere decir que crecen con
mayor rapidez al estar inmersas en sustratos con
altos contenidos de carbohidratos o cloruro de
sodio. (Camacho, 2009). La temperatura de
crecimiento osila desde los 5 a los 37 °C siendo los
28 °C donde se encuentra su óptimo crecimiento.
(Gutiérrez, 2007) Todas las levaduras son aerobias, en presencia de esta
molécula su crecimiento es eficiente y su producción es tanto de biomasa como de CO 2,
por otro lado cuando la presencia del oxígeno es mínima, estas cambian a un metabolismo
anaerobio o fermentativo en el cual el principal producto es el etanol. (Sarmieno A., 2003).
El pH óptimo de crecimiento está entre los valores de 4.5 a 6.5, aunque algunas otras
pueden estar en rangos de 2 a 8.5. (Villamil Y., 1999)

Algunos de los géneros de importancia son:

Schizosaccharomyces. género se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la


miel.

Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias,


como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza, fermentación de los vinos,
en la producción de alcohol, glicerol e invertasa.

Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtención de


productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa.

Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad para
crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen en la
alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa de soya
y de algunos vinos.

Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película.

Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras.

Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de frutas.

Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas.


Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para
incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie

Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la fermentación


de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses.

Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en las


fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada.

Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la
superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en
el sauerkraut.

Este método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, utilizando un medio
de cultivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar
como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio en si el medio empleado es el
Papota Agar Dextrosa (PDA). La hidrólisis de estos compuestos se realiza por enzimas que
poseen estos microorganismos. En si se tomara la muestra, se harán disoluciones y después
de proseguirá a vaciar el medio en las placas correspondientes, incubas a 25 °C durante
unos días, y finalmente pasar a realizar el conteo como lo nuestra la ilustración 1

Objetivos generales

Realizar adecuadamente mediante el método de cuenta en placa, el número de mohos y


levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano. •
Evaluar la calidad microbiológica de un alimento, que sea factible de estar contaminado
con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111- SSA1-1994. •
Comprender el fundamento de todas las etapas del método de detección y cuantificación
de mohos y levaduras en alimentos.

Ilustración 1Pasos a seguir para determinación de Levaduras y Mohos por cuenta en placa.
Reactivos
 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solución
amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%, estéril
 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solución salina de peptonada al
0.1%, estériles con tapón de algodón
 Matraz erlenmayer de 250 mL con 100 mL de agar papa dextrosa, extracto de malta
o agar Saboraud.
 Solución colorante de lactofenol azul de algodón
Colorantes para tinción de Gram
 Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 %

Material y equipo
 Vaso de licuadora estéril o bolsa para Stomacher
 Motor para licuadora o Stomacher
 Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón
 Pipetas graduadas estériles de 10 mL con tapón de algodón
 Pipetas Pasteur estériles
 Propipetaa
 Cajas de Petri estériles (una se utiliza para pesar la muestra)
 Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores,
etc
 Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C
 Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida
45±1°C
 Portaobjetos, cubreobjetos, diurex
 Microscopio óptico
 Asa bacteriológica y asa micológica
 Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal
cuadriculada y lente amplificador
Diagrama de flujo.

Preparar el medio Encender el


de cultivo de acuerdo Esterilizar el material a Limpiar y desinfectar
a las utilizar (autoclave a 15
la mesa de trabajo
mechero Fischer y
lbf/in2 y 121°C, 15- crear el radio de
especificaciones del 20min) con solución Benzal
fabricante. esterilidad.

Se inocula por Distribuir las cajas Pesar la muestra y preparar


Se mezcla duplicado ( 1ml de la estériles en la mesa de las disoluciones como lo
trabajo para una establece la técnica de
cuidadosamente el disolución con 20ml apropiada inoculación y preparación y dilución de
inóculo con el medio aprox. del medio adición de medio de muestras de alimentos para
PDA) cultivo su análisis microbiológico

realizar tincion humeda


Preparar una caja Conteo de colonias
Incubar las cajas para mohos y de ram para
control con 15 o 20 debidamente selladas a levaduras debidamente
(Seleccionar las placas
ml del medio para que contegan entre 10 -
25°C, durante 96±2 h selladas a 26°C, despues 150 colonias)
verificar esterilidad de 96±2 h

Resultados.
Para este conteo en placa se utilizó calabaza, se empleó el uso de disoluciones hasta 10-5
(la prueba se realizó por duplicado) Ilustración 2; se observó que en las placas no hubo
contaminación; en el crecimiento que se muestra, no se alcanzó a ver mohos, por lo que
se puede concluir que el microorganismo que creció fueron levaduras, además en la
disolución de 10-4 había poco contenido de colonias y en la última disolución no se
presentaban colonias.

Ilustración 2 Resultado del crecimiento de la levadura a diferentes disoluciones


La disolución que presento el rango adecuado para el conteo en placa (10-150 colonias)
fue la disolución de 10-5, que tiene un numero de colonias de de 96 y 115 colonias para la
placa A y B respectivamente (Ilustración 3). Por lo que el promedio corresponde a 105.5,
que en términos de expresión para estos procedimientos será tomado el valor de 105 y al
corresponder a la disolución de 10-5 se concluye que el resultado de los microorganismos
presentes es de 1.05X10-3 UFC/gr (NOTA: el conteo se realizó por la foto)

Placa A Placa B
Ilustración 3 Placas utilizadas para el conteo en placa.

Discusión de resultados.
Para la determinación del tipo de microrganismo se hicieron algunas consideraciones así
como el factor morfológico que se presentaba:

1. El crecimiento del microorganismo se realizó en un medio específico para mohos y


levaduras (PDA, que es un medio complejo), con lo que con esto se evita el
crecimiento de bacterias y demás microorganismos
a. Esto dependerá del fabricante, ya que algunos de estos, dan la afirmación
de que en el medio evita el crecimiento de bacterias como lo es PROBIOTEK.
b. Este medio puede ser suplementado con ácidos o antibióticos para evitar la
contaminación por bacterias como es el producto desarrollado por
foodsafety neogen, 2015.
2. Al momento de observar de forma macroscópica las placas, no se detectó alguna
colonia que presentara crecimiento de micelio.

Tomados estos dos aspectos, y la morfología macroscópica, donde se busca el color,


textura y la velocidad de crecimiento que hubo en la placa, teniendo como resultado.

 Color: entre un color crema y blanquecino.


 Textura: un poco lisas
 Algo plegado y seco.
 El tamaño de las colonias era muy variable

Por lo que, considerando todos estos aspectos y que el medio empleado (PDA) evita el
crecimiento de bacterias, se concluye que los microorganismos que crecieron en las placas
son levaduras; Las levaduras se pueden confundir con las bacterias, por lo que es necesario
la revisión microscópica de los resultados así como su tinción, o pruebas como tinción, ya
que sin esto el resultado no estaría bien fundamentado.

Conclusión

Es fundamental conocer si en un alimento hay crecimiento de algún tipo de hongos o


levaduras en los alimentos que se están consumiendo, ya que, con la precensia de algunos
de ellos, puede llegar a producir mucotoxinas como Aspergillus ssp, Rhizopus etc, algunos
que crecen y llegan a alterar el producto como Zygosaccharomyces, torulopsis,
Brettanomyces, rhodotorula, y otros como indicadores como es el caso de Candida krusei
se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. Con estas pruebas se puede
dar autorización si el producto es de buena calidad y que cuenta con las buenas prácticas
de fabricación y evitar el consumo de alimentos contaminados.

La identificación de levaduras y mohos en cualquier alimento tiene como fin identificar


aquellos alimentos que tienen algún efecto por parte del crecimiento de estos
microorganismos además de ser un parámetro de la calidad que es estandarizada como
buenas prácticas de manufactura, se debe tener un buen control de estos microrganismo
debido a que logran deteriorar los alimentos así como generar algún tipo de sutancia
nociva para la salud del consumidor.

Bibliografía

Camacho, A. M. (2009). depa.fquim.unam.mx. (F. d. Química, Ed.) Técnicas para el Análisis


Microbiológico de Alimentos, 1-13. Obtenido de
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Cuenta-mohos-
levaduras_6530.pdf

foodsafety neogen. (4 de Diciembre de 2015). foodsafety.neogen.com. (Acuamedia) Obtenido de


http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7149_sp_pi.pdf

Gutiérrez, L. A. (2007). Caracterización Fisiológica de levaduras aisladas de la filósfera de mora. 33-


35. Obtenido de http://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis276.pdf

PROBIOTEK. (s.f.). http://www.probiotek.com. Obtenido de


http://www.probiotek.com/productos/reactivos/medios-de-cultivo-reactivos/agar-de-
dextrosa-y-papa/

Sarmieno A., H. J. (2003). obtención y caracterización de un banco de levaduras con potencial


aplicación probiótica. Pontificia Universidad Javeriana, 103.

Secretaria de salud. (1994). salud.gob.mx. Obtenido de


http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/111ssa14.html
Villamil Y., Z. Y. (1999). Caracterización de levaduras fermentadoras aisladas de frutas en
descompisición con potencial aplicación productor de etanol. Pontificia Universidad
Javeriana .

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